1、第四章第四章药物的含量测定方法与验证药物的含量测定方法与验证基本内容第一节 滴定分析法第二节 分光光度法第三节 色谱法第四节 药品分析方法验证第五节 定量分析样品的前处理方法基本要求一、掌握定量分析方法验证的效能指标。二、熟悉定量分析样品的前处理方法。三、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用。含量测定：药物的含量测定系指运用化学、物理化学或生物学的方法测定药物中主要有效成分的含量。第一节 容量分析法（一）容量分析法的特点：常用于测定高含量或中含量组分，原料药含量测定首选比较准确（相对误差 0.2%）；操作简单、快速；仪器普通易得；（二）有关计算1.滴定度（T）：每1ml规定浓
2、度的滴定液相当于被测物质的质量(mg)2.滴定度的计算aA（待测物）+bB（滴定液）a bT/M1mT=m a/b McC+dDm：滴定液浓度(mol/L)M：被测物分子量3.百分含量的计算（1）直接滴定法设至终点时，消耗滴定液体积为 V ml则药物实测质量为VT浓度校正因子FC实际C规定实测药物质量实测药物质量V?F?T含量含量?100?100供试品取样量供试品取样量WW：供试品取样量（2）剩余滴定法（回滴定法、返滴定法）药物+A（定、过量）剩余的A+B （回滴）V空白试验V0（V0V）FT含量含量?100W第二节 分光光度法光谱光谱分析法分光光度法分类紫外-可见分光光度法红外分光光度法原子
3、吸收分光光度法荧光分光光度法火焰光度法二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法吸收光谱范围：紫外：200400nm可见：400760nm-4-7灵敏度高，可达10g/ml-10 g/ml 1.特点 准确度高，RSD（%）为2%-5%仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用广范2.朗伯-比耳定律A=ECL吸收系数：摩尔吸收系数摩尔吸收系数 研究分子结构%百分吸收系数1 含量测定1cm3.仪器的校正和检定波长的校正：汞灯中的几根较强的谱线或用仪器自身所带的氘灯的特定谱线为参照进行校正吸收度准确性的检定：重铬酸钾的硫酸溶液，规定波长处测定，应符合规定杂散光的检查：一定浓度的碘化钠和亚硝酸钠溶液，规定波长
4、处测定透光率，应符合规定4.对溶剂的要求:含杂原子的有机溶剂通常具有很强的末端吸收它们的使用范围均不能小于截止使用波长石英吸收池、空气为空白(nm)溶剂溶剂+吸收池A 220240 0.40 241250 0.20 251300 0.10 300以上 0.055.测定方法要求供试品溶液的A应在0.3 0.71）对照品比较法：A供A对C供C对实测药物质量CX?D?V原料药：含量?100供试品取样量W实测含量/片CX?D?V?W制剂：标示量?100标示含量/片标示量?WW片数片数W2）吸收系数法：注意：E1cm应1001CX?AXE1%?1001cm应注意仪器的校正和检定：作为计算浓度的因数进行定
5、量的方法，不是任何情况下都适用的，特别时单色光不纯的情况下，A会随仪器不同而变化，误差较大但若认定一台仪器，固定其工作状态和测定条件，则C和A间的关系在多数情况下仍符合LambertBeer定律3）计算分光光度法：方法有多种，具体按每种药物规定的方法进行。如：VA的三点校正法4）比色法加入显色剂后，按照对照品比较法测定影响显色因素很多，故需注意平行操作空白溶剂：溶剂+显色剂，同法处理（二）荧光分析法-10灵敏度高，可达10g/ml-1210g/ml 在低浓度进行测定，防止自熄灭作用1.特点用基准溶液代替对照液校正仪器灵敏度制备荧光衍生物，可提高灵敏度和选择性干扰因素多，需做空白实验样品用量少，
6、操作简单，应用范围较广2.含量测定原理：当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其荧光强度R与该物质浓度C成正比方法：对照品比较法R供供R供空白供空白计算：C供供?C对对R对对R对空白对空白第三节 色谱法根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后再在线或离线对各组分逐一进行分析的方法，是分离分析混合物的最有力手段。按分离原理：吸附；分配；离子交换；空间排阻分类按分离方法：PC；TLC；柱色谱；GC；HPLC特点：高灵敏度、高效能、高速度、应用广泛（一）HPLC法1.对仪器一般要求固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变其他均可适当改变色谱图20分钟内记录完
7、毕2.系统适用性试验2色谱柱的理论板数：n=5.54(tR/Wh/2)分离度：R=2（tR1 tR2)/(W1+W2);应大于1.5重复性：对照液连续进样 5次，峰面积RSD2.0 拖尾因子：T=W0.05h/2d1应在0.95 1.05流动相真空脱气机四元泵自动进样器柱温箱紫外检测器蒸发光散射检测器质谱检测器液质联用仪流动相：对于以C18为固定相的反相色谱系统，常用甲醇-水，间或加以乙腈、缓冲液等为流动相，有机溶剂比例通常不低于5四元泵四元泵自动进样器自动进样器色谱柱填充剂常用：十八烷基硅烷键合硅胶检测器检测器3.测定方法1)内标法加校正因子测定供试品中主成分含量峰面积对照液（R）：AR含量
8、CRAS/CSf=AR/CR/CASSf=Ax/Cx内标液（S）：AS供试液（X）：AXCSCXAxCx=f AS/CS2)外标法测定供试品中主成分含量对照液（R）：AR供试液（X）：AXCRCXCX CRAX ARCR AXCXAR要求：进样量准确、操作条件稳定（二）GC法1.对GC仪器一般要求载气：氮气色谱柱：填充柱或毛细管柱填充柱：内径24mm，长110m，内装吸附剂高分子多孔小球或涂渍固定液的载体毛细管柱：内径0.20.5mm，长10100m，一般为空心柱，内壁或载体经涂渍或交联固定液检测器：氢火焰离子化检测器色谱图：30分钟内记录完毕2.色谱适用性实验：同HPLC3.测定法：同HPL
9、C第四节 药品分析方法验证目的：证明采用的方法适合于相应检测要求。起草药品质量标准生产工艺变更制剂组分改变原分析方法修订均需对分析方法进行验证验证内容：准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性一、准确度（一、准确度（accuracyaccuracy）：）：?测量值与真实值接近的程度?表 示:回收率?测定方法：回收试验加样回收试验测得量测得量回收率回收率?100加入量加入量测得量测得量?本底量本底量回收率回收率?100加入量加入量?含量测定方法的准确度1.原料药：可用已知纯度对照品或供试品进行测定；或与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较2.制剂：考察其他组分和辅料对回收率的
10、影响用含已知量被测物的制剂各组分混合物（包括制剂辅料）进行测定，回收率计算同原料药向制剂中加入已知量的被测物进行测定与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较?具体做法：测定高、中、低三个浓度，n=3,共9个数据来评价回收率；用UV和HPLC法时，一般回收率可达 98%102%；容量法可达99.7%100.3%二、精密度（二、精密度（precision precision）：）：?定 义:同一样品多次测量值之间相互接近的程度?表 示：偏差，标准偏差,相对标准偏差1.偏差(deviation,d)d=测得值-平均值=Xi-X2.标准偏差（standard deviation,SD或S）S=(Xi
11、X)2/(n-1)1/23.相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%?重复性:同一实验室,同一人多次测定的精密度同一实验室，不同人，不同仪器测定的精密度不同实验室，不同人测定的精密度?中间精密度:?重现性:?数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限三、专属性（三、专属性（specificityspecificity）:指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性1.鉴别反应应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应（鉴别、杂质检查、
12、含量测定方法，均应考察其专属性）2.含量测定和杂质测定色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中注明各组分位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。四、检测限（四、检测限（limit of detectionlimit of detection，LOD)LOD)是指试样中被测物能 被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。1.目视法 用含已知浓度被测物的试样进行分析，目视确定能被可
13、靠地检测出的被测物的最低浓度或量，常用于显色鉴别法，TLC 2.当用GC和HPLC法时，一般以S/N2或3时的相应浓度来确定检测限。五、定量限（五、定量限（1imit of quantitation1imit of quantitation，LOQ)LOQ)是指样品中被测物能 被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ。常用信噪比法确定定量限。一般以S/N=10时相应的浓度进行测定。六、线性（六、线性（linearity）是指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度或量直接呈正比关系的程度。回归方程的相关系数（r）越接近1，表明线性越好可用
14、一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列（至少5份）供试液进行测定，以响应值对浓度作图，建立回归方程，求出 r如UV：制备一个标准系列，浓度点 n=5A=0.3-0.7建立回归方程C=aA+b r 0.9999C5075100125150A0.22吸光度A0.80.70.60.50.40.30.20.10020406080浓度c(ug/ml)100120140160y=0.0047x-0.01R2=0.99860.350.450.580.69A线性的偏离C七、范围七、范围（range）是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。如原料药和制剂含量测定：应为测试浓度
15、的 80%120%制剂含量均匀度检查：应为测试浓度的 70%-130%。溶出度或释放度中的溶出量测定：应为限度的 20%。八、耐用性（八、耐用性（robustnessrobustness）是指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被测溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。HPLC变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。GC变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。检验项目和验证内容：检验项目和验证内容：项目项目内容内容准确度准确度精密度精密度重复性重复性中间精密度中间精密度专属性专属性检测限检测限定量限定量限线性线性范围范围耐用性耐
16、用性杂质测定杂质测定鉴别鉴别定量定量含量测定含量测定及溶出量及溶出量限度限度测定测定 已有重现已有重现性验证，性验证，不需验证不需验证中间精密中间精密度度 如一种方如一种方法不够专法不够专属，可用属，可用其他分析其他分析方法予以方法予以补充补充 视具体情视具体情况予以验况予以验证证第五节定量分析样品的前处理方法一、概述1.结构特征与分析方法之间的关系含卤素有机药物R-X（F，Cl,Br,I）卤素与芳环相连Ar-X 结合牢固卤素与脂肪链相连 R-X 结合较不牢固含金属有机药物含金属有机药物有机金属药物R-O-Me，有机酸或酚的金属盐/配位化合物；结合不牢固，可直接测定R-Me，结合牢固，适当处理
17、后测定不经有机破坏的分析方法2.药物分析中常用的分析方法经有机破坏的分析方法二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法例如：富马酸亚铁的含量测定溶于热稀矿酸2+Fe指示剂:邻二氮菲(+Fe2+)红色Ce4+3+Fe终点：邻二氮菲(+Fe3+)淡蓝色（二）经水解后测定法1.碱水解后测定法适用于X与脂肪链相连的卤代烷烃CH3CH3COHCCl312H2O例如：三氯叔丁醇的含量测定NaCl +AgNO3 三氯叔丁醇CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH (CH3)2CO+3NaCl+HCOONa+2H2OAgCl +NaNO3AgNO3+NH4SCN AgSCN +NH4NO32.酸水解后测定法
18、例如：硬脂酸镁的含量测定MgSO4+2C17H35COOHMg(C17H35COO)2+H2SO4H2SO4+2NaOH Na2SO4+2H2O（三）经还原分解后测定法适用于Ar-I 的药物例如：泛影酸的含量测定ICH3CONHI+3NaI+2CH3COONa+3NaZnO2+3H2O NaI+AgNO3 AgI +NaNO3 COOHINHCOCH3COOH+11NaOH +3ZnH2NNH2指示剂：曙红钠终点：黄红三、经有机破坏的分析方法金属原子、卤素等与C结合牢固者，必须有机破坏常用的有机破坏的方法有干法破坏湿法破坏（一）干法破坏适用于含卤素、S、P等有机药物分析的前处理，也用于某些药物
19、中硒及砷盐的检查。1.高温炽灼法加无水Na2CO3、硝酸镁、氢氧化钙或 ZnO以助灰化2.氧瓶燃烧法含含X、S、P、Se有机药物有机药物?无机离子无机离子?吸收吸收?测定测定O2、燃烧、燃烧吸收吸收液液1）仪器装置500ml,1000ml,2000ml,磨口、硬质玻璃锥形瓶2）称样固体样；液体样要求3）燃烧分解操作法4）吸收液的选择用于X、S、Se等的鉴别、检查、含量测定时多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2应用示例：碘苯酯的测定应用示例：碘苯酯的测定H2SO4-HNO3法(二)湿法破坏 H2SO4-HClO4法H2SO4-硫酸盐法凯氏定氮法H2SO4-H2O2,H
20、NO3-KMnO4法等含含N药物药物?H2SO4?NH4HSO4?(NH4)2SO4?NH3?H2SO4NaOH?酸酸/碱滴定碱滴定吸吸收收 液液吸吸收收思考与练习思考与练习A型题 1相对标准偏差表示的应是A准确度B回收率C精密度D纯净度E限度2表示两变量指标A与C之间线性相关程度常用A相关规律B比例常数C相关常数D相关系数E精密度B型题14A空白试验B对照试验C回收试验D鉴别试验E检测试验1以同量的溶剂替代供试品同法进行测定试验A2在供试液中加入已知量的标准物或已知量的被测物后，同法进行测定试验C3用已知量的纯物质作为试样，同法进行测定试验B4取少许水杨酸，加水溶解，加三氯化铁试液，显紫堇色DX型题1药物分析方法的效能指标有A检测限B耐用性C准确度D专属性E代表性2对药物中杂质进行检查时，要求所用的检查方法应具有A耐用性B专属性C检测限D准确度E线性与范围3用信噪比表示检测限时，信噪比一般应为A11 B21 C31 D41 E51
