1、蛋白样本制备与Western一一 蛋白样本制备蛋白样本制备-成功蛋白分析的基础成功蛋白分析的基础蛋白样本蛋白样本activity assaysprotein microarraysSDS-PAGEimmunoblottingmass spectrometry/IEFEMSAELISA蛋白样本制备的目的蛋白样本制备的目的:后续应用后续应用3二二 蛋白样本制备的原则蛋白样本制备的原则蛋白样本制备原则方法应具备标准化，具有重现性方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；、可靠性、简便性；尽量抽提完全；尽量抽提完全；应使所有蛋白全部处于溶解状态应使所有蛋白全部处于溶解状态防止发生蛋白的降解、聚集、
2、沉淀、变性防止发生蛋白的降解、聚集、沉淀、变性防止在抽提过程中发生化学修饰防止在抽提过程中发生化学修饰如做如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白则需去除高丰度蛋白或无关蛋白必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。4二二 蛋白样本制备的策略蛋白样本制备的策略制备蛋白的目的制备蛋白的目的活性分析 免疫印迹杂交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等实验材料实验材料 细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白样本等目的蛋白的结性质目的蛋白的结性质与分布与分布分布于胞桨/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四级
3、结构特征 磷酸化等修饰方法的选择方法的选择 1 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取 2 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取5三三 案例分析案例分析-细胞中总蛋白的制备细胞中总蛋白的制备裂解样品离心收集定量检测6细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点表面活性剂表面活性剂缓冲液缓冲液蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂磷酸酶抑制剂磷酸酶抑制剂其它：其它：H2O、NaCl、等、等还原剂还原剂RIPA Buffer7细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点 缓冲液缓冲液Tris-HCl（pH7.5),提供提供pH环境，使
4、蛋白保持稳定，环境，使蛋白保持稳定，增加溶解性。增加溶解性。8细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）溶解膜与脂膜，溶解与稳定蛋白质（特别是膜蛋白）分为离子型（如分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如如NP-40、Triton-100、tween系列等）。系列等）。9各类表面活性剂特点各类表面活性剂特点 1 阴离子型阴离子型:SDS 脱氧胆酸盐 2 阳离子型阳离子型:CPB和CTAB 3 双性离子型双性离子型:CHAPS Zwittergen
5、t系列 4 非离子型非离子型:Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等10选用表面活性剂考虑的因素选用表面活性剂考虑的因素参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂选选用用表表面面活活性性剂剂考考虑虑的的因因素素工作条件下表面活性剂的溶解性工作条件下表面活性剂的溶解性使用分子生物学级的表面活性剂使用分子生物学级的表面活性剂,无核酸酶蛋白酶等无核酸酶蛋白酶等根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类考虑表面活性剂的去除方法考虑表面活性剂的去除方法表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量
6、表面活性剂的纯度影响提取蛋白的质量保护蛋白活性时保护蛋白活性时,不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度不仅考虑表面活性剂的种类还有浓度尽量使用毒性较低的表面活性剂尽量使用毒性较低的表面活性剂因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离因不明原因某些蛋白适用专门的表面活性剂进行分离使用非表面活性剂使用非表面活性剂NDSB结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性结合表面活性剂来增加膜蛋白溶解性有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,常先用一种表面活性剂将蛋白溶解常先用一种表面活性剂将蛋白溶解,而另一种表面活性剂取代进而另一种表面活性剂取代进
7、行蛋白的后续分析行蛋白的后续分析11去除未结合的表面活性剂去除未结合的表面活性剂1疏水吸附方法疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法透析法 Dialysis3凝胶层析法凝胶层析法 Gel Chromatography4离子交换层析离子交换层析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性剂的疏水性根椐表面活性剂的疏水性,CMC,凝聚数目凝聚数目,和电荷等性质来去除和电荷等性质来去除.12细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点蛋白蛋白酶抑酶抑制剂制剂抑制蛋白酶的活性，防止蛋白
8、被水解，使用前临抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前临时加入时加入13蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂14细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点磷酸磷酸酶抑酶抑制剂制剂抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使抑制磷酸酶的活化，防止蛋白样本脱磷酸化，使用前临时加入。用前临时加入。15磷酸酶抑制剂选择磷酸酶抑制剂选择 磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，磷酸酶主要包括非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶，酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸酸性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（例如：苏氨酸磷酸酶（例如：PP1,PP2A,
9、PP2B）、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。常规的抑制剂主要包括：常规的抑制剂主要包括：试剂名称试剂名称抑制作用抑制作用氟化钠氟化钠酸性磷酸酶，丝氨酸酸性磷酸酶，丝氨酸/苏氨酸磷酸酶苏氨酸磷酸酶正钒酸钠正钒酸钠碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶碱性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸钠焦磷酸钠丝氨酸丝氨酸-苏氨酸磷酸苏氨酸磷酸 16细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。DTT、巯基乙醇等。巯基乙醇等。.17压片时间选用表面活性剂考虑的因素Fo
10、lin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。DTT、巯基乙醇等。2:按溶解性分级抽提经亲和纯化的多克隆抗体避免反复冻融 2、工作液现配现用，4度不超过2周 3、说明书推荐的稀释倍数作参考，灌制积层胶 插入梳子内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照蛋白定量和SDS-PAGE检测根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.2、适用于WB实验方法去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）干扰此
11、法的测定。压片 底物直接显色HRP标记的 重链轻链适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物eECL高灵敏型(CW0049)彩虹预染中分子量CW0177该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。protein microarrays细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点水；溶剂水；溶剂NaCl：18全蛋白抽提时注意事项全蛋白抽提时注意事项可以适量加入甘可以适量加入甘油油,稳定蛋白稳定蛋白注意事项注意事项可以
12、适量加入可以适量加入Benzonase/DNase I等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Detergent的种的种类类 纯度纯度 浓度浓度 干干扰扰 去除等因素去除等因素Temperature 试剂和器皿冰上试剂和器皿冰上预冷预冷,低温低温4操操作作细胞或组织的样细胞或组织的样本量本量裂解液的用量裂解液的用量19细胞裂解液细胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技术要点的配方分析及技术要点20四四 蛋白样本制备产品选择指南蛋白样本制备产品选择指南21核蛋白样本制
13、备核蛋白样本制备抽提原理低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;离心分离出胞核;高渗破裂胞核,释放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,释放出DNA结合蛋白(组蛋白和转录因子)实验注意事项试剂和器皿冰上预冷裂解液的用量细胞总量抑制蛋白酶蛋白酶抑制剂22膜蛋白样本制备膜蛋白样本制备23膜蛋白的抽提v 方法及原理方法及原理 方法多 直接抽提法 分级抽提法 1:先机械法等非表面活性剂方法裂解细胞,再用表面活性剂抽提 2:按溶解性分级抽提 3:按亚细胞分级抽提 v 产物产物 细胞膜蛋白 细胞器质膜蛋白v 注意事项注意事项 根椐膜蛋白种类和后续研究目的的不同,选择不同的产品或表面活性剂变性剂等.抑制蛋白酶.
14、样本量24膜蛋白的直接提取膜蛋白的直接提取25蛋白的分级提取蛋白的分级提取 按蛋白溶解度不同进行分级抽提按蛋白溶解度不同进行分级抽提,降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第一步：用非表面活性剂溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白提取高疏水性蛋白(膜蛋白膜蛋白)；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的能溶解的膜蛋白约占
15、整个样品的11%（W/W）。）。26亚细胞分级抽提亚细胞分级抽提v 用超离心技术分离出细胞器、用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳要专业仪器，有时会出现假阳性。性。v 根椐胞浆根椐胞浆/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白的亚细胞策略用不同蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解提取液逐级溶解27实验中，若发现样品稀释液或裂解液本
16、身背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。目的蛋白的结性质与分布在上样前可20V恒压预电泳20分钟，可去除泳道中的杂质。可以适量加入甘油,稳定蛋白转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。胶的浓度真核膜蛋白抽提试剂盒（CW0005）protein microarrays显色方法-HRP酶促底物直接显色如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白根椐胞浆/胞膜/胞核/骨架蛋白的亚细胞策略用不同提取液逐级溶解哺乳动物蛋白抽提试剂盒（CW0002）考虑表面活性剂的去除方法BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原
17、为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。封闭与洗膜 内参对照 空白对照Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1:HeLa nuclearLane 2:HeLa whole cell lysateLane 3:A431 cell lysateLane 4:Jurkat cell lysateLane 5:HEK293 cell lysate.Blocking AgentSecondary Antibody防止蛋白质发生氧化，保护二硫键。四种亚细胞组分分离提取的结果四种亚细胞组分分
18、离提取的结果28线粒体蛋白样本制备线粒体蛋白样本制备v 首先用密度梯度离心方法分别分离首先用密度梯度离心方法分别分离出线粒体出线粒体,胞质胞质,胞核胞核.v 再用线粒体抽提再用线粒体抽提Buffer溶解线粒体溶解线粒体蛋白蛋白.29蛋白抽提产品蛋白抽提产品v哺乳动物蛋白抽提试剂盒哺乳动物蛋白抽提试剂盒（CW0002）v组织蛋白抽提试剂盒组织蛋白抽提试剂盒（CW0004）v真核膜蛋白抽提试剂盒真核膜蛋白抽提试剂盒（CW0005）v细菌蛋白抽提试剂盒细菌蛋白抽提试剂盒（CW0001）v酵母蛋白抽提试剂盒酵母蛋白抽提试剂盒（CW0003）v植物蛋白抽提试剂盒植物蛋白抽提试剂盒（CW2033）vNc-
19、细胞核细胞核/浆蛋白抽提试剂盒浆蛋白抽提试剂盒（CW0006）30五五 蛋白定量产品选择指南蛋白定量产品选择指南31BCABCA法蛋白定量法蛋白定量（CW0014CW0014）BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。）是理想的蛋白质定量方法。该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的该方法因快速灵敏、稳定可靠，对不同种类蛋白质检测的变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理变异系数非常小而倍备受专业人士的青睐。该方法的原理是，在碱性条件下，蛋白将是，在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为还原为Cu+，Cu+与与BCA试剂形成紫色的络合物，测定其在试剂形
20、成紫色的络合物，测定其在562nm处的吸收处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂在组织细胞裂解实验中，低浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但螯合剂（不影响检测结果，但螯合剂（EDTA，EGTA）、还原剂（）、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类会对检测结，巯基乙醇）和脂类会对检测结果有一定影响。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身果有一定影响。实验中，若发现样
21、品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用背景值较高，可试用Bradford法测定蛋白浓度。法测定蛋白浓度。32BradfordBradford法法蛋白定量蛋白定量（CW0013CW0013）考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmax），由），由465nm变为变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。测定快速
22、、简便，只需加一种芳香族氨基酸残基相结合。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜分钟即可完成，其颜色可以在色可以在1小时内保持稳定，且在小时内保持稳定，且在5分钟至分钟至20分钟之间，分钟之间，颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族颜色的稳定性最好。由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。去污剂、定时有较大的偏差。
23、去污剂、Triton X-100、十二烷基硫、十二烷基硫酸钠（酸钠（SDS）干扰此法的测定。）干扰此法的测定。33LoweryLowery法蛋白定量法蛋白定量（CW0015CW0015）Lowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键应用最广泛的一种方法，在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐酚试剂中的磷钼酸盐磷磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）
24、。在一定的条件下，兰色深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺度与蛋白的量成正比。这个测定法的优点是灵敏度高，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。34六六 成功的成功的Western BlotWestern BlotDiagram通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相
25、免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原理35六六 成功的成功的Western BlotWestern Blot二抗孵育二抗孵育蛋白提取与定量蛋白提取与定量一一抗孵育抗孵育封闭封闭转膜转膜SDS-PAGE蛋白变性蛋白变性显影显影36蛋白变性蛋白变性蛋蛋白质白质-SDS胶束胶束加入Sample buffer沸水浴5min37在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。六 成功的Western BlotBCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。cECL低背景(CW0048)2 阳离子型:8)SDS Glycero
26、lLowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。eECL高灵敏型(CW0049)Blocking AgentTemperature 试剂和器皿冰上预冷,低温4操作Bromphend-blue-巯基乙醇 DTT使用的Detergent的种类 纯度 浓度 干扰 去除等因素配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。蛋白定量和SDS-PAGE检测选用表面活性剂考虑的因素Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1:HeLa nuclearLane 2:HeLa whole cell lysateLane 3:A431 cell lysateLane
27、 4:Jurkat cell lysateLane 5:HEK293 cell lysate.蛋白定量和SDS-PAGE检测膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。antibody AC-15(ab6276)at 1/5000 dilution,方法应具备标准化，具有重现性、可靠性、简便性；SDS-PAGESDS-PAGE产物：三维网状结构凝胶产物：三维网状结构凝胶加速剂加速剂催化剂催化剂单体单体交联剂交联剂四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）过硫酸胺或核黄素（过硫酸胺或核黄素（AP）甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺
28、（Bis）38SDS-PAGESDS-PAGE 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶浓缩胶使蛋白样品浓缩使蛋白样品浓缩PH6.8Tris-ClPH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分离胶分离胶使蛋白样品分离使蛋白样品分离PH8.8Tris-ClPH8.8Tris-Cl 高，根据蛋白高，根据蛋白大小大小电泳缓冲液：电泳缓冲液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系统系统。39SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围聚丙烯酰胺凝胶最佳分离范围不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。不同分子量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。40聚丙烯酰胺分离胶配方聚丙烯酰
29、胺分离胶配方41SDS-PAGESDS-PAGE灌制分离胶 隔绝空气灌好后一般室温放置灌好后一般室温放置3040分钟分钟42SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方43SDS-PAGESDS-PAGE灌制积层胶灌制积层胶 插入梳子插入梳子44SDS-PAGESDS-PAGE胶制备注意事项胶制备注意事项v过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在过硫酸铵一般现配现用，如连续实验可在4度放度放置置23天。配制天。配制30丙烯酰胺储存液要过滤。丙烯酰胺储存液要过滤。v配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。出现浓度不均
30、的情况。v要根据温度调整要根据温度调整TEMED的使用量。的使用量。v水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。水封的时候水要慢慢加入，太快会导致胶面不平。v插梳子的时候要用力均匀，一次成型。插梳子的时候要用力均匀，一次成型。v在上样前可在上样前可20V恒压预电泳恒压预电泳20分钟，可去除泳道分钟，可去除泳道中的杂质。中的杂质。45上样及电泳上样及电泳v提前将样品沸水浴提前将样品沸水浴5分钟，分钟，1200014000rpm离心离心5分钟。分钟。v根据自己的设计上样。根据自己的设计上样。v80V恒压跑浓缩胶。恒压跑浓缩胶。v看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为看溴酚蓝压缩成一条线后把电压调为10
31、0V。v当溴酚蓝跑至离胶的下面还有当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.40.6mm时停止电泳。时停止电泳。46转膜转膜 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。至膜上。47细胞 组织 固定组织或石蜡包埋组织 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白样本等Blocking Agent灌制积层胶 插入梳子选用表面活性剂考虑的因素SDS-PAGE电泳 凝胶铜染监测膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。Lysates/pro
32、teins at 20 ug per laneLane 1:HeLa nuclearLane 2:HeLa whole cell lysateLane 3:A431 cell lysateLane 4:Jurkat cell lysateLane 5:HEK293 cell lysate.内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照Blocking Agent分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。压片时间二抗对照：不加一抗，用于检
33、验二抗的特异性低渗裂解细胞膜,释放出胞浆蛋白与胞核;内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照Sample buffer5ng-50ng/mlLowry法蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。2 阳离子型:通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白应使所有蛋白全部处于溶解状态转膜转膜48转膜注意事项
34、转膜注意事项v PVDF膜要预先用甲醇活化；膜要预先用甲醇活化；NC膜要预先泡水，除去中间的气泡。然膜要预先泡水，除去中间的气泡。然后在转膜也中平衡后在转膜也中平衡20分钟。分钟。v 膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方膜、胶、滤纸夹好后要将中间的气泡全部赶出来，否则有气泡的地方就会断路，蛋白无法转到膜上。就会断路，蛋白无法转到膜上。v 转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。转膜要在冰浴中进行，防止散热量太大导致转膜温度过高。v 根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。分子量（分子量（kd）转膜条件转膜条件200同上，可
35、在转膜液中加同上，可在转膜液中加0.1SDS49膜的封闭膜的封闭 为避免膜与作为检测试剂的特异性第为避免膜与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理闭处理,一般用一般用5的脱脂奶粉或者的脱脂奶粉或者3的的BSA室温或室温或37度封闭度封闭2小时。小时。50转好蛋白的膜转好蛋白的膜ProteinProtein51封闭封闭ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent52一抗孵育一抗孵育ProteinP
36、roteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody53二抗孵育二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondary Antibody54显影显影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme(E)sssssPPPP Substrate55显色方法显色方法-HR
37、P-HRP酶促底物直接显色酶促底物直接显色56显色方法显色方法化学发光化学发光cECL低背景(CW0048)eECL高灵敏型(CW0049)主要优点适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物适用于HRP检测的最灵敏的化学发光底物检测下限10-12g10-15g 信号持续时间8小时8小时首选检测方法成像设备或X胶片成像设备或X胶片建议一抗稀释度0.2ug-1ug/ml50ng-1ug/ml建议二抗稀释度10ng-50ng/ml5ng-50ng/ml产品保存期室温1年41年建议印迹膜硝化纤维或PVDF硝化纤维或PVDF57Blocking Agent根据蛋白分子量大小选择适合的转膜条件。PVDF膜要预
38、先用甲醇活化；细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点组织蛋白抽提试剂盒（CW0004）当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.Primary Antibody完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。activity assays根据文献方法或经验提取Blocking Agent有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,封闭与洗膜 内参对照 空白对照参考文献报告保持生物活性时使用的表面活性剂配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。测定快速、简便，只需加一种试剂。抗体的保存和使用：1、按说明书的要求分装保存；蛋白定量和SDS-PAGE检测必要时去除样品中的核
39、酸和某些干扰蛋白。上样量成功的要素成功的要素n 质优量足的蛋白样本质优量足的蛋白样本n 科学的对照科学的对照n 正确的抗体选择正确的抗体选择 保存和使用保存和使用n 细致的实验操作细致的实验操作n 步步监测步步监测58科学的对照科学的对照v 蛋白蛋白Marker：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋：预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪白的大小和示踪v 阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，阳性对照：目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性/特别
40、是一抗的质量和特别是一抗的质量和效率效率v 阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取阴性对照：非目的蛋白或明确不表达目的蛋白组织或细胞的蛋白提取物，用于检验抗体的特异性物，用于检验抗体的特异性v 二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性二抗对照：不加一抗，用于检验二抗的特异性v 内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，内参对照：管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照目的蛋白表达量的标准对照v 空白对照：不
41、加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果59蛋白蛋白MarkerMarker中分子量中分子量CW0142可视型中分子量可视型中分子量CW0139蓝色预染中分子量蓝色预染中分子量CW0140可视型蓝色预染中分子量可视型蓝色预染中分子量CW0141彩虹预染中分子量彩虹预染中分子量CW0177Western中分子中分子量量CW0021Western中低分子中低分子量量CW201460WBWB常用内参及其技术参数常用内参及其技术参数antibody AC-15(ab6276)at 1/5000 dilution,Lysates/proteins
42、at 20 ug per laneLane 1:HeLa nuclearLane 2:HeLa whole cell lysateLane 3:A431 cell lysateLane 4:Jurkat cell lysateLane 5:HEK293 cell lysate.WB内参对照内参对照CW008161正确的抗体选择正确的抗体选择 保存和使用保存和使用v 一抗的选择一抗的选择:1、样本的种属样本的种属 2、适用于适用于WB实验方法实验方法 3、单克隆抗体单克隆抗体 经亲和纯化的多克隆抗体经亲和纯化的多克隆抗体v 二抗的选择二抗的选择 与一抗种属匹配与一抗种属匹配 HRP标记的标记的
43、重链轻链 全长的、全长的、Fab段的以及段的以及Fc段的段的v 抗体的保存和使用：抗体的保存和使用：1、按说明书的要求分装保存；、按说明书的要求分装保存；避免反复冻融避免反复冻融 2、工作液现配现用，、工作液现配现用，4度不超过度不超过2周周 3、说明书推荐的稀释倍数作参考，、说明书推荐的稀释倍数作参考，v 提前一个月预订提前一个月预订62实验细节实验细节v电泳电泳:变性与还原变性与还原 SDS的质量的质量 胶的浓度胶的浓度 上样量上样量v转膜转膜:湿式湿式 半干式半干式 蛋白大小与电转液蛋白大小与电转液SDS和甲醇的比例和甲醇的比例 膜的种类膜的种类 PVDF NC 尼龙膜尼龙膜 膜的预处理
44、膜的预处理:尺寸同胶尺寸同胶 充分浸透充分浸透 杜绝气泡杜绝气泡 防止干燥防止干燥封闭封闭 脱脂奶粉与脱脂奶粉与BSA的选择的选择 以以TBST配制配制 封闭液需过滤封闭液需过滤 封闭封闭41小时小时 封闭与洗膜时间封闭与洗膜时间 按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂v一抗孵育一抗孵育 抗体释释液抗体释释液(TBST或封闭液或封闭液)及稀释倍数及稀释倍数,尽量采用低浓度抗体和较长的孵育时间尽量采用低浓度抗体和较长的孵育时间(过过夜夜)孵育温度孵育温度:4,轻摇轻摇v二抗孵育二抗孵育 抗体释释液抗体释释液(TBST)及稀释倍数及稀释倍数 室温室温 1-2小时小时,
45、轻摇轻摇 标记标记HPRv底物压片曝光底物压片曝光 ECL试剂盒试剂盒 压片时间压片时间63步步监测步步监测v蛋白样本蛋白样本 定量和定量和SDS-PAGE考马斯蓝染色考马斯蓝染色vSDS-PAGE电泳电泳 凝胶铜染监测凝胶铜染监测v转膜转膜 丽春红染色监测丽春红染色监测v一抗一抗 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照v二抗二抗 二抗对照二抗对照v封闭与洗膜封闭与洗膜 内参对照内参对照 空白对照空白对照v半定量半定量 内参对照内参对照v压片压片 底物直接显色底物直接显色v实验体系实验体系 内参与阳性对照内参与阳性对照64问题分析问题分析1 165666768问题分析369北京康为世纪生物科技河南
46、总代理北京康为世纪生物科技河南总代理 郑州森斯科贸有限公司郑州森斯科贸有限公司有时比较难仅一种表面活性剂既能溶解蛋白又适用于蛋白分析,细胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技术要点SDS的质量方法多 直接抽提法mass spectrometry根据样本下游的应用来选择表面活性剂的种类Blocking Agent考虑表面活性剂的去除方法SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶配方分为离子型（如SDS、脱氧胆酸盐等）和非离子型（如NP-40、Triton-100、tween系列等）。eECL高灵敏型(CW0049)Secondary Antibody配制过程中每加入一种试剂要充分混匀，防止胶出现浓度不均的情况。考虑表面活性剂的去除方法全长的、Fab段的以及Fc段的当溴酚蓝跑至离胶的下面还有0.BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白质定量方法。8)SDS Glycerol可以适量加入Benzonase/DNase I等核酸酶,去除DNA,充分提取蛋白,降低提取的粘度.按抗体说明书提示使用的特殊的封闭剂谢谢观看！谢谢观看！
