1、蛋白质的结构与功能授课用u 蛋白质研究的历史蛋白质研究的历史 18331833年，从麦芽中分离淀粉酶，随后从胃液中分离到年，从麦芽中分离淀粉酶，随后从胃液中分离到类似胃蛋白酶的物质。类似胃蛋白酶的物质。18641864年，血红蛋白被分离并结晶。年，血红蛋白被分离并结晶。1919世纪末，证实蛋白质有氨基酸组成，并合成了多种世纪末，证实蛋白质有氨基酸组成，并合成了多种短肽。短肽。2020世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级结构测定。结构测定。2020世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究
2、迅速发展。蛋白质研究迅速发展。19621962年，确定了血红蛋白的四级结构。年，确定了血红蛋白的四级结构。2020世纪世纪9090年代，功能基因组与蛋白质组研究展开。年代，功能基因组与蛋白质组研究展开。第一节第一节 蛋白质是生命的物质蛋白质是生命的物质基础基础分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。朊病毒的各个部分都含有蛋白质。朊病毒含量高：人体的含量高：人体的45%45%为蛋白质，脾、肺、肌肉为蛋白质，脾、肺、肌肉含量均超过含量均超过80%80%，细菌的含量为细菌的含量为5080%5080%，干酵，干酵母的含量为母的含量为46.
3、6%46.6%。u蛋白质的生物学重要性蛋白质的生物学重要性1.1.蛋白质是构成生物体的重要组成物质蛋白质是构成生物体的重要组成物质生物催化作用生物催化作用代谢调节作用代谢调节作用转运储存作用转运储存作用运动与支持作用运动与支持作用生物生物膜功能膜功能功能多样性功能多样性免疫保护作用免疫保护作用调控生长与分化调控生长与分化接受和传递接受和传递遗传信息遗传信息总而言之，没有蛋白质就没有生命总而言之，没有蛋白质就没有生命2.2.蛋白质具有重要的生物学功能蛋白质具有重要的生物学功能 很多蛋白质本身就为药物（如一些多肽、激素很多蛋白质本身就为药物（如一些多肽、激素等）；等）；即使有效成分不是蛋白质，但在
4、提取、分离时必即使有效成分不是蛋白质，但在提取、分离时必然遇到有关蛋白质的处理问题；然遇到有关蛋白质的处理问题；蛋白质的研究对有关药物的生产、储存、分析和蛋白质的研究对有关药物的生产、储存、分析和应用等也具有重要的现实意义。应用等也具有重要的现实意义。药学领域药学领域第二节第二节 蛋白质的化学组成蛋白质的化学组成蛋白质平均含蛋白质平均含N N量为总蛋白的量为总蛋白的1616，这是凯氏定氮法，这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：测蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N N量量6.256.25 注意：一定要排除非蛋白质的注意：一定要排除非蛋白质的 氮对蛋白质含量测定的影响氮
5、对蛋白质含量测定的影响 主要元素组成：主要元素组成：C、H、O、N、S；有些还含有少量的有些还含有少量的P 或金属元素或金属元素Fe、Cu、Zn、Mn等；等；个别蛋白质还含有碘。个别蛋白质还含有碘。蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成蛋白质的水解蛋白质的水解酸水解、酸水解、碱水解、蛋白酶水解碱水解、蛋白酶水解蛋白质的基本结构单位蛋白质的基本结构单位氨基酸氨基酸R=H-GlycineR=CH3-AlanineCOOHR groupaH2 NH（一）氨基酸的结构（一）氨基酸的结构 存在自然界的氨基酸有存在自然界的氨基酸有180180余种，但组成余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有人体蛋白质的氨基酸仅有2
6、020余种（基本氨基余种（基本氨基酸），且均属于酸），且均属于L-L-氨基酸（除甘氨酸）。氨基酸（除甘氨酸）。从氨基酸的结构通式可以看出：从氨基酸的结构通式可以看出：构成蛋白质的基本氨基酸为构成蛋白质的基本氨基酸为-氨基氨基 酸，脯氨酸例外，为酸，脯氨酸例外，为-亚氨基酸。亚氨基酸。各种氨基酸的区别在于各种氨基酸的区别在于R R侧链，侧链，R R不同蛋白不同蛋白 质的空间结构和理化性质也会发生变化。质的空间结构和理化性质也会发生变化。除除R R为为H H（甘氨酸）外，其余氨（甘氨酸）外，其余氨 基酸的基酸的-碳原子都是不对称的，碳原子都是不对称的，可形成不同的构型，具有旋光性。可形成不同的构型
7、，具有旋光性。天然蛋白质中基本氨基酸均为天然蛋白质中基本氨基酸均为L-L-型。型。COOHH2CCH2CH2CH2H+N（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类1.1.根据根据R R基团的理化性质基团的理化性质吲哚基吲哚基熟悉：分析多肽链的N-末端和C-末端残基的方法；等电点（isoeletric point，PI）：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，成为兼性离子，净电荷为0，呈电中性，此时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。20世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级结构测定。亚基间的疏水基团为了避开水相而相互作用形成疏水键，导致亚基聚合。Ribbo
8、n model of the bacterial catabolite gene activator protein(CAP)C末端 肼解法形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。RLA APS溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。-折叠借相邻主链之间的氢键维系。羟基化的氨基酸4-羟脯氨酸、5-羟赖氨酸 存在于结缔组织胶原蛋白中一种为顺式，肽链的N-端在同侧。20世纪中叶，各种蛋白质分析技术相继建立，促进了蛋白质研究迅速发展。C末端 肼解法指多肽链主链部分形成的无规律构象。具有一、二、三级结构的多肽链，称为亚基或亚单位(subunit)，四级结构的实质是亚基在
9、空间排列的方式。是指肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠形成的有规则的构象，以氢键为主要的次级键。含量高：人体的45%为蛋白质，脾、肺、肌肉含量均超过80%，细菌的含量为5080%，干酵母的含量为46.HOWT HO第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS巯基巯基胍基胍基咪唑基咪唑基2.稀有氨基酸稀有氨基酸羟基化的氨基酸羟基化的氨基酸甲基化的氨基酸甲基组氨酸甲基化的氨基酸甲基组氨酸-羟基谷氨酸存在于凝血酶原中，参与羟基谷氨酸存在于凝血酶原中，参与凝血凝血 1986年年-硒代半胱氨酸，硒元素取代了半胱氨硒代半胱氨酸，硒元素取代了半胱氨酸中的硫元素；酸中的硫元素；200
10、2年年-吡咯赖氨酸，赖氨酸的吡咯赖氨酸，赖氨酸的-氨基与（氨基与（4R，5R）-4-取代取代-吡咯啉吡咯啉-5-羧酸以酰胺键相羧酸以酰胺键相连而形成的化合物。连而形成的化合物。是生物体内组成蛋白质的第是生物体内组成蛋白质的第21和第和第22种基本氨种基本氨基酸，均属于基酸，均属于L-L-氨基酸。氨基酸。SeH3.非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸鸟氨酸、瓜氨酸是尿素循环的中间代谢产物；鸟氨酸、瓜氨酸是尿素循环的中间代谢产物；D-D-谷氨酸、谷氨酸、D-D-丙氨酸丙氨酸 存在于细菌细胞壁肽聚糖中；存在于细菌细胞壁肽聚糖中；-氨基丁酸由谷氨酸脱羧产生，为重要的神经递质。氨基丁酸由谷氨酸脱羧产生，为重要的
11、神经递质。1.1.物理性质物理性质形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。形态：均为白色结晶或粉末，不同氨基酸的晶型结构不同。溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸和稀碱中溶解性好。在稀酸和稀碱中溶解性好。熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于熔点：氨基酸的熔点一般都比较高，一般都大于200200，超，超过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。过熔点以上氨基酸分解产生胺和二氧化碳。旋光性：除甘氨酸外都有旋光性，左旋用（旋光性：除甘氨酸外都有旋光性，左旋用（-）表示，右旋）表示，右旋用（用（+）表示。氨基酸的旋光性
12、和大小取决于）表示。氨基酸的旋光性和大小取决于R R基的性质，基的性质，并且与并且与D/LD/L型没有直接的对应关系。型没有直接的对应关系。氨基酸的性质氨基酸的性质2.2.化学性质化学性质l 氨基酸的两性解离与等电点氨基酸的两性解离与等电点 氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。酸碱度。等电点（等电点（isoeletric pointisoeletric point，PIPI）：当溶液浓度为某）：当溶液浓度为某一一pHpH值时，氨基酸分子中所含的值时，氨基酸分子中所含的-NH-NH3 3+和和-COO-COO-数目正好相数目正好相等
13、，成为兼性离子，净电荷为等，成为兼性离子，净电荷为0 0，呈电中性，此时溶液的，呈电中性，此时溶液的pHpH值即为氨基酸的等电点。值即为氨基酸的等电点。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，pHpH变化时，迁移发生变化。变化时，迁移发生变化。拆分蛋白质分子中的多肽链pI 是氨基酸的特征常数蛋白质具有重要的生物学功能肽链中氨基酸残基的R侧链分布在片层的上下。-转角（-turn）蛋白质分子中氨基酸是如何连接的呢？在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。2-10个亚基组成具有四级结构的蛋白质为寡聚体(o
14、ligomer)，多于10个称为多聚体（polymer）。蛋白质末端分析或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳只能水解由碱性氨基酸构成的C-末端肽键质的空间结构和理化性质也会发生变化。维持亚基之间的化学键主要是疏水键。可采用两种或多种不同的断裂方法（断裂点不同）将多肽样品断裂成两套或多套肽段，并将其分离开来。蛋白质的结构与功能授课用等电点（isoeletric point，PI）：当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，成为兼性离子，净电荷为0，呈电中性，此时溶液的pH值即为氨基酸的等电点。pI 是氨基酸的特征常数用片段重叠法重新建立完整多肽链的一级结构这类结构主要
15、存在于球状蛋白分子中。茚三酮反应（灵敏度为1ug）一级结构中关键部分相同，其功能也相同：如不同动物来源的同种激素（胰岛素）。pI 是氨基酸的特征常数是氨基酸的特征常数COO-C HH3N+R-pK1+H+H+CO O HC HH3N+RH+H+pK2-COO-C HH2NRpHpI阳离子阳离子pH=pI两性离子两性离子pHpI阴离子阴离子l 紫外吸收性质紫外吸收性质 酪氨酸、色氨酸酪氨酸、色氨酸R R基团有共基团有共轭双键，具有紫外吸收特性，轭双键，具有紫外吸收特性，其最大吸收波长在其最大吸收波长在280nm280nm附近。附近。大多数蛋白质含有这两种大多数蛋白质含有这两种氨基酸，因此测定蛋白
16、溶液氨基酸，因此测定蛋白溶液280nm280nm处吸光值是检测蛋白浓度处吸光值是检测蛋白浓度的快速简便有效的方法的快速简便有效的方法 在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm570nm处。处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可以作为氨基酸的定量分析方法。因此可以作为氨基酸的定量分析方法。l 茚三酮反应（灵敏度为茚三酮反应（灵敏度为1ug1ug）寡肽、多肽的组成单位寡肽、多肽的组成单位 多种生物活性物质的前体：多种生物活性物
17、质的前体：NONO前体前体精氨酸；精氨酸；褪黑色素前体褪黑色素前体-色氨酸。色氨酸。作为神经递质作为神经递质（谷氨酸、（谷氨酸、-氨基丁酸）氨基丁酸）氧化分解产生氧化分解产生ATPATP 作为糖异生的前体作为糖异生的前体氨基酸的生理功能氨基酸的生理功能 蛋白质分子中氨基酸蛋白质分子中氨基酸是如何连接的呢？是如何连接的呢？两个氨基酸分子头尾连接起来肽键肽键的形成的形成NH2COOH1NH2COOH2NH2C NCOOHOH21脱水CarbodiimideJuang RH(2004)BCbasics 一个氨基酸的羧一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的基与另一个氨基酸的氨基之间失水形成的氨基之间失水形成
18、的酰胺键称为肽键，所酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。形成的化合物称为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，三个氨基酸组成由两个氨基酸组成的肽称为二肽，三个氨基酸组成的肽称为三肽，依此类推。的肽称为三肽，依此类推。由十个以下氨基酸组成的肽称为寡肽（由十个以下氨基酸组成的肽称为寡肽（oligope-oligope-ptide ptide）;十个以上氨基酸组成的肽称为多肽或多肽链十个以上氨基酸组成的肽称为多肽或多肽链（polypeptidepolypeptide）。）。肽链中的氨基酸因为脱水缩合而非原来的完整分子肽链中的氨基酸因为脱水缩合而非原来的完整分子单元，故将其称为氨基酸残基（单元，故将其称
19、为氨基酸残基（residueresidue）。）。肽链中肽链中AA的排列顺序和命名的排列顺序和命名l在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。序称为氨基酸顺序。l多肽链有两端：多肽链有两端：N-N-端：多肽链中有游离端：多肽链中有游离a a-氨基的一端，也称氨基端；氨基的一端，也称氨基端；C-C-端：多肽链中有游离端：多肽链中有游离a a-羧基的一端，也称羧基端。羧基的一端，也称羧基端。l氨基酸的顺序是从氨基酸的顺序是从N-N-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以C-C-端氨基酸端氨基酸残基为终点的排列顺序。如
20、上述五肽可表示为：残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu褪黑色素前体-色氨酸。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。不同的 aa 在于 R基团 的不同其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物学功能的基础。一级结构中关键部分相同，其功能也相同：如不同动物来源的同种激素（胰岛素）。蛋白质的结构与功能授课用测定各片段的氨基酸顺序主链：是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分规则的重复排列而成。非极性氨基酸：缬、甲、脯、丙、亮、异亮、苯、色肽平面的相叠形成螺旋氨基酸的顺序是从N-端的
21、氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。蛋白质的研究对有关药物的生产、储存、分析和应用等也具有重要的现实意义。褪黑色素前体-色氨酸。20世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级结构测定。Edman degradationEdman降解法（苯异硫氰酸酯法）非共价键（需要用变性剂尿素或SDS）二硫键需要用还原法蛋白质是构成生物体的重要组成物质I 非极性氨基酸（八种）由两个氨基酸组成的肽称为二肽，三个氨基酸组成的肽称为三肽，依此类推。蛋白质是具有三维空间结构的高蛋白质是具有三维空间结构的高分子物质，根据蛋白质肽链的折分子物质，根据蛋白质肽链的折叠方式和复杂程度，将蛋白质结叠方式和复杂
22、程度，将蛋白质结构分为构分为.1234 蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次Mathews et al(2000)Biochemistry(3e)p.195一级结构（一级结构（primary structure primary structure）-氨基酸序列氨基酸序列二级结构（二级结构（secondary structure secondary structure）-主要由氢键稳固的局部构象，如主要由氢键稳固的局部构象，如a a-helix,helix,-sheet-sheet等等三级结构（三级结构（tertiary structure tertiary structure）-一条多肽链中所有原
23、子或基团在三一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布维空间的整体排布四级结构（四级结构（quarternary structure quarternary structure）-多个多肽链的组合多个多肽链的组合空间结构空间结构蛋白质结构的层次蛋白质结构的层次 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构 蛋白质的一级结构指蛋白质分子中多肽链蛋白质的一级结构指蛋白质分子中多肽链的氨基酸排列顺序（注意方向），包括二硫键的氨基酸排列顺序（注意方向），包括二硫键的位置。的位置。主要的化学键：肽键，二硫键主要的化学键：肽键，二硫键 一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学的基础
24、，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素。蛋白质的一级结构的测定蛋白质的一级结构的测定l蛋白质的一级结构指蛋白蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中质多肽链中AAAA的排列顺序的排列顺序以及多肽链内或链间二硫以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。键的数目和位置。l其中最重要的是多肽链的其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质氨基酸顺序，它是蛋白质生物学功能的基础。生物学功能的基础。如何如何测测定定蛋白质蛋白质一级结构：一级结构：氨基酸序列氨基酸序列(1)直接进行氨基酸测序直接进行氨基酸测序：Edman degradationF.Sanger(Cambrid
25、ge U.)Insulin-胰岛素胰岛素(A,B chains)(2)由由 cDNA 序列反推序列反推氨基酸氨基酸序列：序列：DNA 定序法：定序法：F.Sanger Juang RH(2004)BCbasics1.小片段肽链测序小片段肽链测序：二硝基氟苯二硝基氟苯（FDNB）法法二甲氨基磺酰氯二甲氨基磺酰氯（DNS-Cl）法）法Edman降解法（苯异硫氰酸酯法）降解法（苯异硫氰酸酯法）氨肽酶法氨肽酶法肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法N末端氨基酸的分析末端氨基酸的分析C末端氨基酸的分析末端氨基酸的分析OUS SEO大多数的亲水的侧链分布于球形结构的表面，而疏水的侧链链分布于球形结构的内部，形成疏水
26、的核心。Sanger(Cambridge U.pI 是氨基酸的特征常数在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。在蛋白质的一级结构中，有少数氨基酸残基参与功能活性部位的构成或处于特定构象的关键部位，这部分残基对于蛋白质正常发挥功能至关重要。一级结构中关键部分相同，其功能也相同：如不同动物来源的同种激素（胰岛素）。弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O 和第四个残基的N-H 之间形成氢键，产生一个不很稳定的环状结构。侧链：R基部分。肽键平面对多肽链构象的限制主链：是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分规则的重复排列而成。溶解性：一般都溶于水，不溶或微溶于醇，不溶于丙酮，在稀酸
27、和稀碱中溶解性好。Juang RH(2004)BCbasics蛋白质分子可以有多个相同或不同的结构域；在加热条件及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。三级结构（tertiary structure）-一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布一级结构是空间结构的基础，并且决定高级结构，而高级结构决定它的生物学功能。(1)直接进行氨基酸测序：指在一条多肽链上所有原子和基团在三维空间的整体排布。蛋白质的结构与功能授课用主要涉及三步反应：偶联反应、环化断裂反应、转主要涉及三步反应：偶联反应、环化断裂反应、转化反应。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链化反应
28、。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。端氨基酸残基逐一进行标记和解离。EdmanEdman降解法（苯异硫氰酸酯法，降解法（苯异硫氰酸酯法，PITCPITC法）法）脱去脱去N N末端氨基酸后，剩下的肽链仍然是完整的。末端氨基酸后，剩下的肽链仍然是完整的。苯异硫氰酸酯（苯异硫氰酸酯（PITC)PITC)碱性条碱性条件，偶件，偶联联酸性条件，酸性条件，断裂环化断裂环化PTC-肽肽l多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩
29、合成不溶于水化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与的物质而与C-C-端氨基酸分离。端氨基酸分离。C末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定肼解法肼解法H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸l羧肽酶是一种肽链外切酶，它能特异地从多肽链羧肽酶是一种肽链外切酶，它能特异地从多肽链的的C-C-端将氨基酸依次水解下来，是端将氨基酸依次水解下来，是C C末端分析常用末端分析常用的方法。目前常用的羧肽酶有四种：的方法。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,CA,B,C和和Y Y；C
30、 C 末端基氨基酸测定末端基氨基酸测定羧肽酶法羧肽酶法羧肽酶种类羧肽酶种类能水解氨基酸种类能水解氨基酸种类羧肽酶A脂肪族或芳香族氨基酸（脂肪族或芳香族氨基酸（Pro除外）除外）C-末端肽键末端肽键羧肽酶B只能水解由碱性氨基酸构成的只能水解由碱性氨基酸构成的C-末端肽键末端肽键羧肽酶CC-末端的末端的Pro 羧肽酶Y能切断各种氨基酸在能切断各种氨基酸在C-末端的肽键末端的肽键2.2.大片段肽链测序大片段肽链测序：分析多肽链的分析多肽链的N-N-末端和末端和C C末端残基末端残基(二硝基氟苯法二硝基氟苯法,丹酰氯法丹酰氯法)非共价键（需要用变性剂非共价键（需要用变性剂尿素或尿素或SDSSDS）二硫
31、键需要）二硫键需要用还原法用还原法用两种不同的裂解方式裂解多肽链为较小片段用两种不同的裂解方式裂解多肽链为较小片段测定各片段的氨基酸顺序测定各片段的氨基酸顺序用片段重叠法重新建立完整多肽链的一级结构用片段重叠法重新建立完整多肽链的一级结构测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目拆分蛋白质分子中的多肽链拆分蛋白质分子中的多肽链蛋白质末端分析或蛋白质末端分析或SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳测序步骤测序步骤A.A.多肽链的拆分多肽链的拆分 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。可用拆分。可用8mol/L8mol/L尿素
32、或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍处理，即可盐酸胍处理，即可分开多肽链分开多肽链(亚基亚基)B.B.二硫键的断裂二硫键的断裂 可在尿素或盐酸胍存在时，用过量的可在尿素或盐酸胍存在时，用过量的-巯基乙醇处巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。的巯基，以防止它重新被氧化。C.测定蛋白质分子中多肽链的数目测定蛋白质分子中多肽链的数目 蛋白质末端分析蛋白质末端分析 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 D.多肽链断裂成多个肽段多肽链断裂成多个肽段 以便建立两个重要的氨基酸序列参考点以便建立两个重要
33、的氨基酸序列参考点 可采用两种或多种不同的断裂方法（断裂点不同）可采用两种或多种不同的断裂方法（断裂点不同）将多肽样品断裂成两套或多套肽段，并将其分离开来。将多肽样品断裂成两套或多套肽段，并将其分离开来。酶解法酶解法:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶白酶、羧肽酶和氨肽酶 化学法：化学法：(Cyanogen bromide)溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。酸的羧基所形成的肽键。E.分析多肽链的分析多肽链的N-末端和末端和C-末端残基末端残基 以便建立两个重要的氨基酸序
34、列参考点以便建立两个重要的氨基酸序列参考点 N末端末端 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）法）法 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNS）法）法 Edman降解法降解法 氨肽酶法氨肽酶法 C末端末端 肼解法肼解法 还原法还原法 羧肽酶羧肽酶F.片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意 两套或两套以上不同方两套或两套以上不同方法断裂的肽段样品，切口彼法断裂的肽段样品，切口彼此错位，两套肽段正好相互此错位，两套肽段正好相互跨过切口而重合，达到互补跨过切口而重合，达到互补的目的。的目的。第二节 蛋白质的化学组成三级结构层次上的局部折叠区。拆分蛋白质分子中的多肽链 化学法：(Cya
35、nogen bromide)蛋白质具有重要的生物学功能第一套肽段 第二套肽段20世纪初，发现蛋白质的二级结构，完成胰岛素一级结构测定。肽链中AA的排列顺序和命名Sanger(Cambridge U.以便建立两个重要的氨基酸序列参考点蛋白质的结构与功能授课用19世纪末，证实蛋白质有氨基酸组成，并合成了多种短肽。氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。第一节 蛋白质是生命的物质基础HOWT HO由十个以下氨基酸组成的肽称为寡肽（oligope-褪黑色素前体-色氨酸。是生物体内组成蛋白质的第21和第22种基本氨基酸，均属于L-氨基酸。单独亚基无生物学功能，当亚基聚合成为具有完整四级结构
36、的蛋白质后才有功能。-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8借助重叠肽确定肽段次序：借助重叠肽确定肽段次序：末端残基末端残基 H S末端肽段末端肽段 HOWT APS（OUS）第一套肽段第一套肽段 HOWT OUS EOVE RLA PS第二套肽段第二套肽段 HO WTOU SEO VERL APS 推断全顺序推断全顺序 HOWTOUSEO VERLAPS氨基末端残基氨基末端残基 H 羧基末端残基羧基末端残基 S第一套肽段第一套肽段 第二套肽段第二套肽段 OUS SEO PS WTOU EOVE VERL RLA APS HOWT HO举例：举例：所得资料所得资料核酸推导法核酸推
37、导法l原理：蛋白质的氨基酸顺序是由核酸原理：蛋白质的氨基酸顺序是由核酸的核苷酸顺序决定的。的核苷酸顺序决定的。测出核酸的核苷酸顺序测出核酸的核苷酸顺序根据三个核苷酸确定一个氨基酸的根据三个核苷酸确定一个氨基酸的密码子推导出蛋白质的氨基酸顺序密码子推导出蛋白质的氨基酸顺序小结小结掌握：片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序；掌握：片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序；熟记：组成蛋白质的各种氨基酸以及缩写符号；熟记：组成蛋白质的各种氨基酸以及缩写符号；熟悉：分析多肽链的熟悉：分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端残基的方法；末端残基的方法；蛋白质分子的构象蛋白质分子的构象又称空间结构、立体结构、又称空
38、间结构、立体结构、高级结构、三维构象等，是指蛋白质分子中原高级结构、三维构象等，是指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。走向。蛋白质的分子构象蛋白质的分子构象取决于一级结构，是蛋白质取决于一级结构，是蛋白质生物学功能或活性所必需的。生物学功能或活性所必需的。蛋白质的构象可分为二、三、四级结构。蛋白质的构象可分为二、三、四级结构。蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构 定义定义是指肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋是指肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠形成的有规则的构象，以氢键为主要的次级键。或折叠形成的有规
39、则的构象，以氢键为主要的次级键。蛋白质的二级结构中蛋白质的二级结构中不涉及氨基酸残基侧链的构象。不涉及氨基酸残基侧链的构象。主链：是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分规主链：是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽键部分规则的重复排列而成。则的重复排列而成。侧链：侧链：R R基部分。基部分。两两肽肽键键平面的交接平面的交接点为点为-碳碳以以肽键为肽键为平面平面连接连接成成多肽长链多肽长链注意注意：-碳上面接有各碳上面接有各种种大小不等的基大小不等的基团团肽单位肽单位（peptide unit）：肽键与相邻的两个：肽键与相邻的两个C C组成的基团组成的基团其中肽键具有部分双键性质，不能自由旋转。其中肽键具
40、有部分双键性质，不能自由旋转。肽单位是刚性平面，其上面肽单位是刚性平面，其上面6 6个原子处于同一平面，称为个原子处于同一平面，称为 肽平面。肽平面。肽链主链上只有两个肽链主链上只有两个碳原子碳原子 连接单键可旋转。连接单键可旋转。肽单位中与肽单位中与C-NC-N相连的氢和氧相连的氢和氧原子与两个原子与两个碳原子呈反向分碳原子呈反向分布。布。肽链中的肽平面蛋白质空间结构单元蛋白质空间结构单元Ribbon model of the bacterial catabolite gene activator protein(CAP)肽键平面对多肽链肽键平面对多肽链构象的限制构象的限制肽平面的相叠形成肽
41、平面的相叠形成螺旋螺旋a a-螺旋螺旋(a a-helix)指蛋白质分子中多个指蛋白质分子中多个肽平面通过氨基酸肽平面通过氨基酸a a-碳原子的旋转，使多碳原子的旋转，使多肽链的主骨架沿中心肽链的主骨架沿中心轴盘曲成稳定的轴盘曲成稳定的a a-螺螺旋构象。旋构象。右手右手a a-螺旋，螺距为螺旋，螺距为0.54nm，每，每圈含圈含3.6个氨基酸残基；两个氨基个氨基酸残基；两个氨基酸残基之间的距离为酸残基之间的距离为0.15nm;稳定因素：链内氢键，每隔三个稳定因素：链内氢键，每隔三个氨基酸残基形成一个氢键，氢键氨基酸残基形成一个氢键，氢键取向与主轴基本平行。取向与主轴基本平行。R基团在外侧，其
42、大小、形状及电基团在外侧，其大小、形状及电荷等均影响荷等均影响a a-螺旋的稳定性和形螺旋的稳定性和形成。成。0.54 nma-螺旋结构特征肽链伸展使肽键平面肽链伸展使肽键平面之间折叠成锯齿状；之间折叠成锯齿状；叠借相邻主链之叠借相邻主链之间的氢键维系。间的氢键维系。肽链中氨基酸残基的肽链中氨基酸残基的R R侧链分布在片层的侧链分布在片层的上下。上下。-折叠有两种类型。一种为顺式，肽链的折叠有两种类型。一种为顺式，肽链的N-N-端在同侧。端在同侧。另一种为反式，即相邻两条肽链的方向相反。一般反式另一种为反式，即相邻两条肽链的方向相反。一般反式较为稳定。较为稳定。-转角（-turn）在在-转角部
43、分，由四个连续的转角部分，由四个连续的氨基酸残基组成；氨基酸残基组成；弯曲处的第一个氨基酸残基的弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O-C=O 和第四个残基的和第四个残基的N-H N-H 之间形成氢键，产生一个不很之间形成氢键，产生一个不很稳定的环状结构。稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白这类结构主要存在于球状蛋白分子中。分子中。COOHH2CCH2CH2CH2H+N无规卷曲（无规卷曲（random coil）|指多肽链主链部分形成的无规律构象。指多肽链主链部分形成的无规律构象。|一种蛋白质往往具有多种不同类型的二一种蛋白质往往具有多种不同类型的二级结构构象，只是不同蛋白质各占多少级结构
44、构象，只是不同蛋白质各占多少不同而已。不同而已。核糖核酸酶的分子结构核糖核酸酶的分子结构-螺旋螺旋-折叠折叠-转角转角无规卷曲无规卷曲基序基序基序（基序（motifmotif）又称为超二级结构、模体或模）又称为超二级结构、模体或模序：多肽链内顺序上相邻的二级结构常在空序：多肽链内顺序上相邻的二级结构常在空间中相互接近，相互作用而形成有规则的二间中相互接近，相互作用而形成有规则的二级结构聚集体。级结构聚集体。超二级结构在结构的组织层次上高于二级结超二级结构在结构的组织层次上高于二级结构，但没有完整的结构域。构，但没有完整的结构域。常见的有：常见的有：，结构域（结构域（domain）三级结构层次上
45、的局部折叠区。三级结构层次上的局部折叠区。结构域：在较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻结构域：在较大的蛋白质分子中，多肽链上相邻的基序（超二级结构）紧密联系，进一步折叠成的基序（超二级结构）紧密联系，进一步折叠成一个或多个相对独立的致密的三维实体。一个或多个相对独立的致密的三维实体。具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，具有独特的空间构象，与分子整体以共价键相连，并承担特定的生物学功能。并承担特定的生物学功能。蛋白质分子可以有多个相同或不同的结构域；不蛋白质分子可以有多个相同或不同的结构域；不同的蛋白质分子可以有相同的结构域。同的蛋白质分子可以有相同的结构域。此外，氢键、离子键、范德华力、
46、二硫键等在维持蛋白质的四级结构也起一定的作用。非共价键（需要用变性剂尿素或SDS）二硫键需要用还原法(1)直接进行氨基酸测序：大多数的亲水的侧链分布于球形结构的表面，而疏水的侧链链分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。具有一、二、三级结构的多肽链，称为亚基或亚单位(subunit)，四级结构的实质是亚基在空间排列的方式。蛋白质分子可以有多个相同或不同的结构域；蛋白质的构象可分为二、三、四级结构。三级结构（tertiary structure）-一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布肽平面的相叠形成螺旋溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。拆分蛋白质分子中的多肽链蛋
47、白质的一级结构的测定褪黑色素前体-色氨酸。Sanger(Cambridge U.溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。酸水解、碱水解、蛋白酶水解此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。构成蛋白质的基本氨基酸为-氨基掌握：片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序；蛋白质的变构效应（allosteric effect）：一级结构不变，空间构象发生一定变化，导致生物学功能改变。丙酮酸激酶的结构域丙酮酸激酶的结构域蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)具有二级结构、超二级结构及结构域的一条多具有二级结构、超二级结构及结构域
48、的一条多肽链上，序列上相隔较远的肽链上，序列上相隔较远的AAAA残基侧链相互作残基侧链相互作用，在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链用，在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。和侧链构象在内的特征三维结构。指在一条多肽链上所有原子和基团在三维空间指在一条多肽链上所有原子和基团在三维空间的整体排布。的整体排布。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。大多数蛋白质的三级结构为球状或近似球状。大多数的亲水的侧链分布于球形结构的表面，大多数的亲水的侧链分布于球形结构的表面，而疏水的侧链链分布于球形结构的内部，形成而疏水的侧链链分布于球形结构的内部，形成疏水的核心。疏水的核心。
49、维系三级维系三级结构的化学键结构的化学键主要是非共价主要是非共价键：氢键、离键：氢键、离子键、疏水键子键、疏水键和范德华力。和范德华力。u蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构(Quaternary(Quaternary Structure)Structure)：二个或二个以上的亚基之二个或二个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连而形间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象。成更复杂的构象。蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构1.蛋白亚基蛋白亚基具有一、二、三级结构的多肽链，称为亚基具有一、二、三级结构的多肽链，称为亚基或亚单位或亚单位(subunit)，四级结构的实质是亚基在，四级结构的
50、实质是亚基在空间排列的方式。空间排列的方式。2-10个亚基组成具有四级结构的蛋白质为寡个亚基组成具有四级结构的蛋白质为寡聚体聚体(oligomer)，多于，多于10个称为多聚体个称为多聚体（polymer）。）。单独亚基无生物学功能，当亚基聚合成为具单独亚基无生物学功能，当亚基聚合成为具有完整四级结构的蛋白质后才有功能。有完整四级结构的蛋白质后才有功能。2.亚基间的结合力亚基间的结合力 维持亚基之间的化学键主要是疏水键。维持亚基之间的化学键主要是疏水键。亚基间的疏水基团为了避开水相而相互亚基间的疏水基团为了避开水相而相互作用形成疏水键，导致亚基聚合。作用形成疏水键，导致亚基聚合。此外，氢键、离
