1、 重组重组DNADNA技术技术 Recombinant DNA Technology 第二十四章第二十四章 重组重组DNA技术技术（recombinant DNA technology） 又称又称分子克隆分子克隆（molecular cloning）或或DNA克隆克隆 （DNA cloning）或基因克隆或基因克隆（gene cloning) 技术技术， 是指在体外是指在体外利用酶学方法利用酶学方法将目的将目的DNA片段与能自主片段与能自主 复制的遗传元件复制的遗传元件（又叫载体又叫载体）连接连接，形成重组形成重组DNA 分子分子，进而在受体细胞中复制进而在受体细胞中复制、扩增扩增，从而获得单
2、一从而获得单一 DNA分子的大量拷贝分子的大量拷贝。 第第 一一 节节 重组重组DNADNA技术中常用的技术中常用的 工具酶工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology 重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶 工工 具具 酶酶 功功 能能 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNA DNA连接酶连接酶 催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸二酯键，羟基末端之间形成磷酸二酯键， 使使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或
3、片段连接 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 切除末端磷酸基切除末端磷酸基 反转录酶反转录酶 合成合成cDNA；替代；替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析 末端脱氧核苷酰转移酶末端脱氧核苷酰转移酶 在在3 羟基末端进行同聚物加尾羟基末端进行同聚物加尾 DNA聚合酶聚合酶 合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针； DNA序列分析；填补序列分析；填补3 末端末端 Klenow片段片段 又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、 35 外切活性，
4、而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，第二链合成， 双链双链DNA 3 末端标记等末端标记等 Taq DNA聚合酶聚合酶 常用于常用于PCR；产物的；产物的3末端带有末端带有A，可用于，可用于T-A克隆克隆 多核苷酸激酶多核苷酸激酶 催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针 一、限制性核酸内切酶用于切割一、限制性核酸内切酶用于切割DNA 定义定义: 限制性核酸限制性核酸内切内切酶酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或
5、其周 围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶的一类内切酶。限制性核酸内切限制性核酸内切 酶是重组酶是重组DNA技术中重要的工具酶技术中重要的工具酶。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H 第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；用大写斜体； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体； 第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）； 用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。 命名命名 Hin d 属属 种种 株株
6、序序 Haemophilus influenzae d株株 流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶 （一）重组（一）重组DNA技术中通常使用技术中通常使用 型限制酶型限制酶 （二）（二）型限制性内切酶具有一些共性和特性型限制性内切酶具有一些共性和特性 1. 具有特定的识别和切割位点具有特定的识别和切割位点 限制性内切酶限制性内切酶 识别位点识别位点 限制性内切酶限制性内切酶 识别位点识别位点 Apa I GGGCCC CCCGGG Sma I CCCGGG GGGCCC BamH I GGATCC CCTAGG Sau 3A I GATC CTAG Pst I CTGCAG GAC
7、GTC Not I GCGGCCGC CGCCGGCG EcoR I GAATTC CTTAAG Sfi I GGCCNNNNNGGCC CCGGNNNNNCCGG II II型限制性内切酶的识别位点举例（型限制性内切酶的识别位点举例（示切割位点）示切割位点） 2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） Bam H GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG Hind GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口平端切口 黏端切口黏端切口 3. 切割双链切割双链DNA分子后产生黏端或平端分子后产生
8、黏端或平端 （sticky end） （blunt end） 同尾酶同尾酶（isocaudarner） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切但切 割割DNA后后，产生相同的黏端产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾这样的酶彼此互称为同尾 酶酶。这两个相同的黏端称为这两个相同的黏端称为配伍末端配伍末端(compatible end)。 Bam H Bg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A 4. 不同的酶可以产生同样的末端不同的酶可以产生同样的末端 GGAT
9、CC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam H GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bst CCCGGG GGGCCC C CCCGG CCGGG G + Xma CCCGGG GGGCCC CCC GGG GGG CCC + Sma 能识别同一序列能识别同一序列（切割位点可同或不同切割位点可同或不同）但来源不同但来源不同 的两种酶互称同工异源酶的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶或同裂酶。 5. 不同的酶可以识别同一个序列不同的酶可以识别同一个序列 6. 6. 切割会受其他因素的影响切割会受其他因素的影响 限制性内切酶通常
10、不能切割在识别位点内有限制性内切酶通常不能切割在识别位点内有 特异碱基甲基化的序列。特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。 例如，例如，EcoR I在正常情况下识别“在正常情况下识别“-GAATTC-” 序列，但在甘油浓度大于序列，但在甘油浓度大于5%（v/v）或反应温）或反应温 度较低时识别序列可变为“度较低时识别序列可变为“-AATT-”或“”或“-嘌呤嘌呤 嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活性”，这种现象称为星号活性 （star activity），以），以EcoR I*表示。表示。 二、二、DNA连接酶
11、用于催化连接酶用于催化DNA片段连接片段连接 DNA连接酶连接酶（DNA ligase）：催化两个相邻的：催化两个相邻的3-OH和和 5-磷酸基团形成磷酸基团形成3，5-磷酸二酯键磷酸二酯键，从而使从而使DNA片段或单片段或单 链断裂形成的缺口连接起来链断裂形成的缺口连接起来。 连接酶的作用机制连接酶的作用机制 1. 大肠杆菌染色体编码的大肠杆菌染色体编码的 DNA连接酶连接酶 需需NAD+作为辅因子作为辅因子 2. 大肠杆菌大肠杆菌T4噬菌体噬菌体DNA编码的编码的T4 DNA连接酶连接酶 需需ATP作为辅因子作为辅因子 DNA连接酶的来源连接酶的来源 三、重组三、重组DNA 技术中还需使用
12、其他常用技术中还需使用其他常用 工具酶工具酶 （一）（一） 碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 （二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模板合成为模板合成cDNA （三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成末端加尾以构成 黏黏性末端性末端 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA （五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性 （六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR （七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5 羟基
13、末端磷酸化羟基末端磷酸化 来自于大肠杆菌来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP） 或小牛肠或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于用于 脱去脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团末端的磷酸基团，使使5 -P成为成为5 -OH，该该 过程称核酸分子的脱磷酸作用过程称核酸分子的脱磷酸作用。 （一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的（一）碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的 磷酸基团磷酸基团 P 5 OH 3 OH 3 P 5 OH 5 OH 3 OH 3 OH 5 （二）反转录酶以（二）反转录酶以RNA为模
14、板合成为模板合成cDNA 反转录酶反转录酶 （reverse transcriptase） 反转录酶催化的反转录酶催化的cDNA合成合成 RNA RNA 5 3 AAAAAA AAAAAA TTTTTT 5 3 cDNA cDNA 随机引物随机引物 Oligo-dT 5 3 5 5 3 3 5 3OH GGG GG dGTP 末端转移酶末端转移酶 （三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端末端 加尾以构成黏端加尾以构成黏端 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I（DNA polymerase I） 是基因工程中常用的是基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶。其除具有其
15、除具有 53聚合酶活性外聚合酶活性外，还有还有35及及53核酸外核酸外 切酶活性切酶活性。因其具有因其具有53核酸外切酶活性而常核酸外切酶活性而常 用于用于DNA探针的探针的缺口平移法缺口平移法（nick translation） 标记标记。 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA DNA聚合酶聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶用枯草杆菌蛋白酶（subtilisin）裂解后裂解后 产 生 的 大 片 段产 生 的 大 片 段 ， 也 称 为也 称 为 Klenow 片 段片 段 （ Klenow fragment）。其保留了其保留了53聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切外切 酶活
16、性酶活性，失去了失去了5 3外切酶活性外切酶活性。 Klenow片段的主要用途有：片段的主要用途有： 补齐双链补齐双链DNA的的3 末端末端，使其转变成平端；或通过补齐使其转变成平端；或通过补齐3端而使端而使3末端标末端标 记；记； 在在cDNA克隆中克隆中，用于第二股链的合成；用于第二股链的合成； 用用 于于DNA序列分析序列分析。 （五）五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性 （六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定聚合酶具有良好的聚合活性和热稳定 性性，常用于常用于PCR。该酶具有该酶具有5
17、3聚合酶活性及聚合酶活性及 53外切酶活性外切酶活性，但没有但没有35外切酶活性外切酶活性，因而因而 无无35校对活性校对活性。 另外另外，Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用聚合酶具有末端转移酶作用， 能在所合成能在所合成DNA链的链的3末端加上一个单独的腺苷酸末端加上一个单独的腺苷酸 残基残基（A）。 （七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5 5 羟基末端磷酸化羟基末端磷酸化 常 用 的 是常 用 的 是 T4 多 核 苷 酸 激 酶多 核 苷 酸 激 酶 （ T4 polynucleotide kinase），该酶含该酶含5多核苷酸激酶多核苷酸激酶 和和3磷酸
18、酶活性磷酸酶活性，能催化能催化ATP的的-位磷酸向位磷酸向DNA 和和RNA的的5-羟基转移羟基转移。 该酶常用于：该酶常用于： DNA或或RNA的的5末端标记；末端标记； 使没有使没有5-末端磷酸的末端磷酸的DNA片段磷酸化片段磷酸化，以供以供 连接和克隆之用连接和克隆之用。 第二节第二节 目的目的DNA的获取的获取 Preparation of Interested DNA 一、一、化学合成法可直接合成目的化学合成法可直接合成目的DNA 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列氨基酸序列 应用：一般用于小分子肽类基因的合成应用：一般用于小
19、分子肽类基因的合成 * 化学合成法获取目的化学合成法获取目的DNA 由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列 色色 苯丙苯丙 蛋蛋 赖赖 第一步：构建第一步：构建基因组基因组DNA文库文库（是指包含（是指包含 某一个生物细胞或组织全部基因组某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的序列的 随机克隆群体，以随机克隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有片段的形式贮存了所有 的基因组的基因组DNA信息）。信息）。 第二步：筛选含有目的基因的克隆。第二步：筛选含有目的基因的克隆。 二、从基因组从基因组DNA文库中获取目的文库中获取目的DNA 组织或细胞染色体组织或细胞染色体DN
20、A 基因片段基因片段 克隆载体克隆载体 重组重组DNA分子分子 含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌 限制性内切酶限制性内切酶 或机械剪切或机械剪切 受体菌受体菌 基因组基因组DNA文库文库 存在于转化细胞内由存在于转化细胞内由 克隆载体所携带的所有基克隆载体所携带的所有基 因组因组DNA片段的集合片段的集合 * 从基因组从基因组DNA文文 库获取目的基因库获取目的基因 三、从三、从cDNA文库中获取目的文库中获取目的DNA 第一步：构建第一步：构建cDNA文库文库（包含某一组织包含某一组织 细胞在一定条件下所表达的全部细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转经反转 录而合成的录而合成的cD
21、NA序列的克隆群体序列的克隆群体，它以它以cDNA 片段的形式贮存了全部的基因表达信息片段的形式贮存了全部的基因表达信息）。 第二步：筛选含有目的第二步：筛选含有目的cDNA的克隆。的克隆。 cDNA文库文库 存 在 于存 在 于 转化细胞内转化细胞内 由克隆载体由克隆载体 所携带的所所携带的所 有有 cDNA 片片 段的集合段的集合 从从基因组基因组DNA文库或文库或cDNA文库中筛选文库中筛选 目的目的DNA的策略的策略 1. 菌落或噬斑原位杂交菌落或噬斑原位杂交 2. 针对表达文库针对表达文库，可用抗原可用抗原-抗体或配体抗体或配体-受受 体结合的原理体结合的原理（亲和筛选法亲和筛选法）
22、筛选筛选 如果已经知道目的基因的序列如果已经知道目的基因的序列，就能很就能很 方便地用方便地用PCR反应反应，从基因组从基因组DNA或或cDNA中中 获得目的基因获得目的基因，可不必要经过复杂的可不必要经过复杂的DNA文文 库构建过程库构建过程。 PCR是一种高效快速的体外是一种高效快速的体外DNA聚合程序聚合程序 四、经四、经PCR获取目的获取目的DNA 酵 母 单 杂 交 系 统 酵 母 单 杂 交 系 统 五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码五、通过特异杂交系统获取某些转录因子的编码DNADNA A. 无转录因子：报告基因不表达无转录因子：报告基因不表达 “诱饵”诱饵”DNA序列序
23、列 B. 有转录因子：报告基因表达有转录因子：报告基因表达 C. 有转录因子有转录因子 AD/DNA结合蛋白融合蛋白：报告基因表达结合蛋白融合蛋白：报告基因表达 转录因子的转录因子的 AD 转录因子转录因子 DNA结合蛋白结合蛋白 报告基因报告基因 报告基因报告基因 报告基因报告基因 . 第三节第三节 重组重组DNA技术中的技术中的DNA载体载体 DNA Vectors in Recombinant DNA Technology 载体载体（vectorvector）是为携带感兴趣的外源是为携带感兴趣的外源DNADNA，实现实现 外源外源DNADNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的在受体细胞
24、中的无性繁殖或表达有意义的 蛋白质所采用的一些蛋白质所采用的一些DNADNA分子分子 按功能分按功能分 克隆载体（克隆载体（cloning vector） 表达载体（表达载体（expression vector） 按基本元件按基本元件 的来源不同的来源不同 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 黏粒载体黏粒载体 病毒载体病毒载体 人工染色体载体等人工染色体载体等 载体概述载体概述 克隆载体克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意 设计的载体称为设计的载体称为克隆载体克隆载体。 表达载体表达载体(expression vect
25、or) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录和翻译序列可转录和翻译 成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。 一、克隆载体用于外源一、克隆载体用于外源DNA的克隆和的克隆和 无性繁殖无性繁殖 （一）克隆载体应具备的主要特点（一）克隆载体应具备的主要特点 至少有一个复制起点（至少有一个复制起点（origin of replication, ori） 至少有一个选择性标志（至少有一个选择性标志（selection marker） 有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位有适宜的限制性内切酶的单一切点：称为多克隆位 点（点（multiple clonin
26、g sites，MCS） 应有较高的拷贝数。应有较高的拷贝数。 pBR322质粒图谱质粒图谱 1. 1. 质粒质粒 (plasmid) 特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息遗传信息, , 会赋予宿主细胞一些遗传性状会赋予宿主细胞一些遗传性状。 （二）（二） 常用克隆载体有多种常用克隆载体有多种 pUC系列质粒图谱系列质粒图谱 噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适用于系列（插入型，适用于cDNA克隆）克隆） EMBL系列（臵换型，适用于基因组系列（臵换型，适用于基因组DNA克隆）克隆） cos位点位点:噬菌体噬菌体DN
27、A为线性双链分子，两端各有一条为线性双链分子，两端各有一条 由由12个碱基组成、彼此完全互补且个碱基组成、彼此完全互补且5单链突出的序列单链突出的序列 （即粘性末端），称（即粘性末端），称cos位点位点 2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因） M13mp系列系列 3. 穿梭载体（穿梭载体（shuttle vector） 人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外 源源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。 表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源表达载体是指
28、用来在宿主细胞中表达外源 基因的载体基因的载体 依据其宿主细胞的不同可分为依据其宿主细胞的不同可分为: 原核表达载体（原核表达载体（prokaryotic expression vector） 真核表达载体（真核表达载体（eukaryotic expression vector） 二、表达载体用于外源二、表达载体用于外源DNA的表达的表达 （一）（一） 原核表达载体用于在原核细胞中表达外原核表达载体用于在原核细胞中表达外 源基因源基因 从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外，从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体的一般特点外， 还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖
29、还需有调控外源基因有效转录和翻译的序列，如启动子、核糖 体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载体结合位点、转录终止序列等。目前应用最广泛的原核表达载 体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下：体是大肠杆菌表达载体。原核表达载体的基本组成如下： R：调节序列；：调节序列； P：启动子；：启动子； SD：SD序列；序列；TT：转录终止序列：转录终止序列 大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体 Lac启动子启动子（乳糖启动子乳糖启动子） Trp启动子启动子（色氨酸启动子色氨酸启动子） Tac启动子启动子（乳糖和色氨酸的杂合启动子乳糖和色氨酸的杂合启动子） PL和和PR启动子启动子（
30、噬菌体的左向和右向启动子噬菌体的左向和右向启动子） T7启动子启动子 1. 1. 启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被启动子是启动外源基因表达的必需元件，其能被RNARNA聚合酶聚合酶 所识别：所识别：目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种目前原核表达载体常使用的启动子有以下几种 2. SD序列提供核糖体结合位点序列提供核糖体结合位点 mRNA在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位在细菌中的翻译严格依赖于核糖体结合位 点点（ribosome binding site）的存在的存在。SD序列序列（Shine- Dalgarno sequence）位于转录起始位点上游位于转录起始位点上游81
31、3 bp处处， 为富含嘌呤的短片段为富含嘌呤的短片段，其能与核糖体其能与核糖体30S小亚基中的小亚基中的16S rRNA 3端的部分序列互补结合端的部分序列互补结合。SD序列作为核糖体结序列作为核糖体结 合位点合位点，保证了翻译起始复合物的形成保证了翻译起始复合物的形成。 3. 转录终止序列有助于外源基因的高效表达转录终止序列有助于外源基因的高效表达 尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋尽管载体中没有转录终止序列，也可表达某些外源蛋 白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中白，但表达效果通常不理想。因此，多数原核表达载体中 都带有转录终止序列。都带有转录终止序列。 转录终止
32、序列长短不一，短的只有几十转录终止序列长短不一，短的只有几十bp，长的可达，长的可达 几百几百bp。 转录终止序列有助于使转录终止序列有助于使RNA聚合酶重点转录克隆的外聚合酶重点转录克隆的外 源基因，控制所转录源基因，控制所转录RNA的长度，提高的长度，提高RNA稳定性。稳定性。 位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的位于启动子上游的转录终止序列可阻止其他启动子的 通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可通读，降低本底；位于多克隆位点下游的转录终止序列可 防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。防止因外源基因表达而干扰载体的稳定性。 4. 几种常见的原核表达载体各有特点几种常
33、见的原核表达载体各有特点 依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为依据表达目的蛋白的方式，可将原核表达载体分为 （1）非融合型表达载体）非融合型表达载体 （2）融合型表达载体）融合型表达载体 （3）分泌型表达载体）分泌型表达载体 （1）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白）非融合型表达载体用于表达非融合蛋白 非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进非融合蛋白是指不与细菌的任何蛋白或多肽融合在一起进 行表达的蛋白行表达的蛋白。表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体表达该类蛋白的载体称为非融合型表达载体。 使用强启动子使用强启动子tac，紧接紧接tac启动子启动子 的是多克隆位点的是多
34、克隆位点，目的基因克隆于目的基因克隆于 启动子和启动子和SD序列下游序列下游。在多克隆位在多克隆位 点下游包含一个很强的点下游包含一个很强的rrnB核糖体核糖体 RNA的转录终止子的转录终止子，其作用是为了其作用是为了 稳定载体系统稳定载体系统，因为上游强的因为上游强的tac启启 动子控制的转录必须由强终止子抑动子控制的转录必须由强终止子抑 制制，才不至于干扰与载体本身稳定才不至于干扰与载体本身稳定 性有关的基因表达性有关的基因表达。载体的其余部载体的其余部 分来自分来自pBR322。 使用使用pKK223-3时时，应配套使用应配套使用 LacIq宿主菌宿主菌，在无在无IPTG诱导时诱导时，
35、tac启动子受阻遏启动子受阻遏，当加入当加入IPTG后后， 便可去阻遏便可去阻遏，从而使外源基因表达从而使外源基因表达。 将一段特殊的蛋白质将一段特殊的蛋白质（或短或短 肽肽）的基因构建入载体的基因构建入载体，使使 之与目的蛋白融合表达可形之与目的蛋白融合表达可形 成 融 合 蛋 白成 融 合 蛋 白 （ fusion protein）。表达该类蛋白的表达该类蛋白的 载体称为融合型表达载体载体称为融合型表达载体， 如如pGEX系统系统。 pGEX系统包括多种载体系统包括多种载体， 如如 pGEX-lT 、 pGEX-2T 、 pGEX-3X 、 pGEX-4T 、 pGEX-5X、pGEX-6
36、P等等。该该 系统载体使用强启动子系统载体使用强启动子tac， 紧接启动子的是紧接启动子的是SD序列及其序列及其 下游的下游的GST基因基因，然后是多然后是多 克隆位点克隆位点。用用IPTG可诱导目可诱导目 的基因的表达的基因的表达，表达产物与表达产物与 GST融合融合，故可利用该标签故可利用该标签 对蛋白进行纯化对蛋白进行纯化。 （2）融合型表达载体用于表达融合蛋白）融合型表达载体用于表达融合蛋白 该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔，该类载体的优点是能把在受体细菌内表达的外源蛋白有效地分泌到周质腔， 甚至穿过细胞外膜进入培养基中。甚至穿过细胞外膜进入培养基中。
37、在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有在构建该类载体时，除有一般表达载体应有的启动子等元件外，还需含有 编码信号肽的序列（通常臵于编码信号肽的序列（通常臵于SD序列下游）。序列下游）。 分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。分泌型载体既可用于非融合蛋白的表达，也可用于融合蛋白的表达。 pIN 系列载体是较常用的分泌型表达载体系列载体是较常用的分泌型表达载体，可使所表达的蛋白分泌到宿可使所表达的蛋白分泌到宿 主菌的周质腔中主菌的周质腔中。该系列载体以该系列载体以pBR322为基础构建而成为基础构建而成，带有大肠杆菌中带有大肠杆菌中 最强的启动子之一
38、最强的启动子之一，即即lpp（脂蛋白基因脂蛋白基因）启动子启动子，其中编码信号肽的序列其中编码信号肽的序列 取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因取自大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa （外膜蛋白基因外膜蛋白基因）。 （3 3）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达）分泌型表达载体用于外源基因的分泌表达 pIN 系列载体有系列载体有3种，即种，即pIN -ompA1、 pIN -ompA2和和pIN -ompA3，分别适用，分别适用 于使用不同密码子框架的目的基因的插入，于使用不同密码子框架的目的基因的插入， 克隆位点分别为克隆位点分别为EcoR、Hind和和BamH。 （二）真核表达载体用于在真原核细胞中
39、（二）真核表达载体用于在真原核细胞中 表达外源基因表达外源基因 真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位 点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。 真核表达载体中还具有：真核表达载体中还具有： 真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终 止序列、止序列、poly A 加尾信号等加尾信号等 真核细胞复制起始序列真核细胞复制起始序列 真核细胞药物抗性基因真核细胞药物抗性基因 OriPro：原核复制起始序列；：原核复制起始序列；P：启动子；：启动子；MCS：多克隆：多克隆 位
40、点；位点；TT：转录终止序列；：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。：真核复制起始序列。 注：不是所有真核表达载体都有整合序列注：不是所有真核表达载体都有整合序列 真核表达载体的基本组成真核表达载体的基本组成 真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很真核启动子和增强子在不同类型细胞中的活性差别很 大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞大。某些来源于病毒的启动子和增强子，其真核宿主细胞 范围较广，如范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（肉瘤病毒基因组长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）、）、SV40病毒早期基因的启动子和病毒
41、早期基因的启动子和 增强子、人类巨细胞病毒（增强子、人类巨细胞病毒（CMV）启动子等。这些启动子）启动子等。这些启动子 和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表和增强子组合可在广泛的宿主细胞中起作用，故在真核表 达载体中被普遍使用。达载体中被普遍使用。 真核表达载体带有的真核表达载体带有的poly A 加尾信号可保证新转加尾信号可保证新转 录的录的mRNA能有效地加上能有效地加上poly A。 为为mRNA加上加上poly A依赖于依赖于mRNA 3末端的末端的 AAUAAA和其下游的和其下游的GU或或U富含区富含区。 尽管全长尽管全长cDNA克隆可能已带有克隆可能已带有AAUAAA
42、序列和序列和 一段一段poly A，但这些序列仍不足以保证但这些序列仍不足以保证poly A的有效形的有效形 成成。因此因此，载体中必须带有载体中必须带有poly A 加尾信号加尾信号。 常用的来自常用的来自SV40的的poly A加尾信号为加尾信号为237 bp，其其 中同时含有针对早期和晚期转录子的切割和中同时含有针对早期和晚期转录子的切割和poly A 加加 尾信号尾信号。两套信号作用的方向相反两套信号作用的方向相反，并分别位于不同并分别位于不同 的的DNA链上链上，对对mRNA的加工均很有效的加工均很有效。 酵母表达载体酵母表达载体 昆虫表达载体昆虫表达载体 哺乳类细胞表达载体哺乳类细
43、胞表达载体 根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要根据真核宿主细胞的不同，真核表达载体可主要 分为分为 ： （1 1）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白）酵母表达载体适于在酵母细胞中表达外源蛋白 根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵根据载体在酵母细胞中复制方式的不同，可将酵 母载体分为五类，母载体分为五类， YIp：酵母整合型质粒：酵母整合型质粒 YRp：酵母复制型质粒：酵母复制型质粒 YCp：酵母着丝粒型质粒：酵母着丝粒型质粒 YEp：酵母游离型质粒：酵母游离型质粒 YLp：酵母线性质粒：酵母线性质粒 除除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵外，其余各类既可在大肠杆菌，
44、又可在酵 母细胞中复制与扩增。母细胞中复制与扩增。 根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可根据在转化酵母细胞中的复制机制，又可 将酵母载体分为两个基本类型：将酵母载体分为两个基本类型： 整合型载体，如整合型载体，如YIp包含一个酵母包含一个酵母ura3标标 志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗 性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复 制的元件，其需通过质粒制的元件，其需通过质粒DNA与酵母与酵母DNA同源同源 序列重组而整合至酵母基因组中序列重组而整合至酵母基因组中 。 自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞自主
45、复制型载体，这类载体因在酵母细胞 中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有：中有自我复制能力而得名，属于这类载体的有： YRp、YEp和和YCp。 （2）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因）昆虫表达载体可在昆虫细胞中表达真核基因 昆虫表达载体主要有两类：昆虫表达载体主要有两类： 杆状病毒表达载体杆状病毒表达载体。载体的启动子为多角体蛋载体的启动子为多角体蛋 白白(polyhedrin)基因的启动子基因的启动子，所使用的外泌信号所使用的外泌信号 序列来自蜜蜂的序列来自蜜蜂的milittin序列序列，其可在宿主细胞其可在宿主细胞 （如如Sf9或或Sf20）中高水平表达外源蛋白中高水平表达外源蛋
46、白。 果蝇表达载体果蝇表达载体。载体上的启动子有载体上的启动子有Ac5（果蝇果蝇 黑素激动蛋白黑素激动蛋白5C基因基因）启动子和启动子和MT（果蝇黑素果蝇黑素 金属硫蛋白基因金属硫蛋白基因）启动子启动子，所使用的外泌信号序所使用的外泌信号序 列为列为Bip序列序列，其可连续表达或诱导表达外源蛋白其可连续表达或诱导表达外源蛋白。 （3 3）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中）哺乳类细胞表达载体适宜在哺乳类细胞中 表达真核基因表达真核基因 据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体据载体进入宿主细胞的方式分为病毒载体和质粒载体 据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体据载体在宿主细胞内是否整合
47、于细胞染色体DNADNA，可将其，可将其 分为整合型和非整合型载体分为整合型和非整合型载体 整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因整合型载体一般是随机整合入染色体，但所携带外源基因 的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的的表达受插入位点的影响，同时还可能会改变宿主细胞的 生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非生长特性，整合型载体通常用于外源基因的稳定表达；非 整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达整合型载体通常用于外源基因的瞬时表达 最常用的哺乳类细胞表达载体是最常用的哺乳类细胞表达载体是病毒载体病毒载体 一个理想的病毒表达载体，通常应具备以下条件：一个理想的
48、病毒表达载体，通常应具备以下条件： 使用安全，对宿主细胞无毒副效应；使用安全，对宿主细胞无毒副效应； 能容纳较大的外源能容纳较大的外源DNA片段且转染效率高；片段且转染效率高； 所产生的病毒效价高；所产生的病毒效价高； 外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表达 病毒的靶向性强；病毒的靶向性强； 外源基因的表达具有可控性。外源基因的表达具有可控性。 然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一然而，遗憾的是，到目前为止，还没有任何一 个病毒载体能满足以上全部理想条件。个病毒载体能满足以上全部理想条件。 目前，常用的病毒表达载体包括如下多种：目前，常用的病毒
