1、生物化学和分子生物学实验生物化学和分子生物学实验 1 1 必须穿白大褂；必须穿白大褂； 2 2 书包放在实验台的上层架子上；书包放在实验台的上层架子上； 3 3 实验报告在实验课后实验报告在实验课后2424小时内由组长统一上交；小时内由组长统一上交； 值日生注意事项强调：值日生注意事项强调： 1 1 清洁实验台上层架子；清洁实验台上层架子； 2 2 用湿抹布擦黑板用湿抹布擦黑板 3 3 清洁比色皿；清洁比色皿； 4 4 将所有移液枪调到最大量程；将所有移液枪调到最大量程； 实验一实验一 分光光度法分光光度法 可见光可见光 可见光，可见光， 在在400 400 - - 760nm760nm范围范
2、围 光的吸收定律光的吸收定律 To a specific wavelength, L A=KLC ( (一一) )基本原理基本原理 分光光度法是利用物质对某种波长的光具有分光光度法是利用物质对某种波长的光具有选择性选择性 吸收吸收的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一的特性建立起来的鉴别物质或测定其含量的一 项技术。项技术。 Lambert-Beer定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通定律，吸光度与溶液的浓度成正比，与光束通 过溶液的距离过溶液的距离(即光程即光程)成正比，用数学表达式表示为：成正比，用数学表达式表示为： A=KLC C：物质的浓度，：物质的浓度，L：光程（：光程（cm）
3、，），K为吸光系数或消光系数。为吸光系数或消光系数。 当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部 分则透过溶液分则透过溶液 入射光强度为入射光强度为I0，透射光强度为，透射光强度为It， 则透光度则透光度T=It/I0， T%=It/I0X100% 吸光度吸光度(A)或光密度或光密度(O.D)或称消光度或称消光度(E) A=-LgT 三种管的作用：三种管的作用： 标准管标准管（CsCs） 测定管测定管（CxCx） 空白管空白管 由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质所吸收，而由于单色光透过溶液时，不仅被待测物质所吸收，而 且还被且还被比色容器与溶剂以及其
4、它试剂吸收比色容器与溶剂以及其它试剂吸收一部分，一部分， 这部分需用消除；这部分需用消除； 空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而空白液的做法即用与样本相同的一切试剂，而不含被不含被 测定的物质测定的物质。 空白管空白管 （二）待测溶液的浓度计算（二）待测溶液的浓度计算 (1) 利用标准管法计算待测溶液的浓度：利用标准管法计算待测溶液的浓度： (2) 利用标准曲线进行换算：利用标准曲线进行换算： (3) 利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度。利用吸光系数（消光系数）求出待测溶液的浓度。 根据根据Lambert-Beer氏定律：氏定律：A=KLC 若若C为为1%（g/ml），），L为为1
5、cm，此时的，此时的K值称为百值称为百 分吸光系数用分吸光系数用E1%1cm表示表示.即：即：C=A/E1%1cm 若若C为为1mol/L，L为为1cm，其，其K K值称为摩尔吸光系数值称为摩尔吸光系数 用用表示即；表示即； C=A /C=A / 根据根据Lambert-beer定律：定律： 标准管：标准管：As=KLCs (下标下标S：标准液：标准液) 待测管：待测管：Ax=KLCx (下标下标X：待测液：待测液) L相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则相等，温度相同，测定同一物质，所用单色光相同，则K相同，则：相同，则： As/Ax=Cs/Cx 即即Cx=Ax/As Cs 在实
6、际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等在实际操作中，常使待测管体积与标准管体积相等(以以X代表测定管含量，代表测定管含量， S代表标准管含量代表标准管含量)则：则： X=Ax/As S 计算待测溶液浓度时，可根据测定时计算待测溶液浓度时，可根据测定时实际吸取实际吸取的的标准液的体积标准液的体积(Vs) 和和待测样品的体积待测样品的体积(Vx)，将上式演变为：，将上式演变为： 待测溶液浓度：待测溶液浓度：Cx=Ax/As Cs Vs/Vx 利用标准管法计算待测溶液的浓度利用标准管法计算待测溶液的浓度 实验操作实验操作CuSOCuSO4 4含量测定含量测定 试剂试剂 标准管标准管 测定管测定管 空白管空白管 CuSO4标准标准 液液(ml) 120mg/ml 1.0 CuSO4测定测定 液液(ml) 0.8 蒸馏水蒸馏水(ml) 6.0 6.2 7.0 700nm700nm比色，以空白管调零，读取比色，以空白管调零，读取AxAx和和AsAs 【实验报告实验报告】 实验原理实验原理 实验步骤实验步骤 数据记录及实验结果计算数据记录及实验结果计算 利用直接比较法：利用直接比较法：Cx=Ax/As Cs Vs/Vx 实验结论实验结论 日期、室温日期、室温 实验项目实验项目
