1、 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved.2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20222DME简介 直接显微镜计数法（DME）是一种通过过滤糖浆中的酵母、细菌、藻类、真菌及其他一些可染色的微小物质，快速检测细胞数目的微生物学方法。利用荧光染色剂吖啶橙及紫外显微镜可对细胞进行快速鉴定。本方法可以对淀粉糖浆中活菌/死菌微生物污染进行准确计数(本方法适用于所有玉米湿磨工业生产的糖品)2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20
2、223设备1.Olympus或相同类型的显微镜 2.反射荧光装置 3.带有玻璃支架的玻璃过滤容器(25 mm)4.带有3/8小孔的8#塞。TS NO.30578 5.GelmanSciences过滤仪154026.真空软管7.Nuclepore25mm聚碳酸酯滤膜，滤膜孔径0.8微米 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20224设备8.平刃镊子 9.显微镜载玻片1X3 10.玻璃正方形盖玻片22X22-2mm fisher牌12-540B 11.低荧光度的浸油Cargille的FF型 12.通过0.8微米Millipore过滤器
3、过滤的蒸馏水或去离子水 13.吖啶橙细菌染色剂250ml,Difco3336-75-9 14.异丙醇100%2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20225操作程序 1.确认过滤容器及其支架是干净的；2.安装过滤装置，滤膜光面朝上；3.向样品中(成品为13g样品;中间体样品为31g)加入60 mL过滤水摇动直至样品完全溶解；4.过滤样品并泄真空；5.加60mL过滤水冲冼样品杯；6.用4-15 mL过滤水冲冼过滤装置；7.过滤水并泄真空；2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5
4、/20226操作程序8.切断真空，用2.5mL 吖啶橙染色剂滴溢满滤膜；9.静止一分钟然后抽真空；10.用2.5mL过滤蒸馏水冲冼滤器；11.用2.5 mL异丙醇冲冼滤器，保持冲冼时间尽可能短以减少污染的可能性，这点很重要；12.在开真空的状态下移去过滤容器并用镊子取下滤膜片，这有助于干燥滤膜，与空气接触片刻后，滤膜就应刻干燥了；2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20227操作程序13.滴一小滴浸油在干净的载玻片上，将滤膜光面向上平铺在浸油上，在滤膜上面加一滴油，放上盖玻片轻轻压下滑动使之均匀；14.在蓝光激活下用4OX物镜观察
5、载玻片。在深色背景下微生物的荧光显色为桔色或绿色。局部的有机物残渣也发出荧光，但酵母菌、霉菌菌丝及细菌细胞也能够由它们的组织特性及染色特性被认出,见附图；15.取20个视野进行计数时，视野间不可重叠，否则可能会使计数过大；16.结果=平均视野数*82(cfu/ml)2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20228操作程序样品量如下：成品为13g样品 中间体样品为31g 如果样品很难过滤，多不可计（TNTC）或者有大量异物存在，则将样品稀释10倍后过滤。2009 Cargill Incorporated.All rights rese
6、rved计数程序计算1ml的视野数：确定每毫升的菌数 几种计算方法可以采用，需要确定显微镜的视野范围，这个范围应该是显微镜在给定放大倍数内可观察到的视野范围的总面积 A2mm显微镜载物台测微器在400倍放大显微镜下面，测微器有刻度标尺分为主刻度线和副刻度线。每两个主区域之间的空间是0.1mm,每两个副区域之间的空间是0.01mm。测定视野直径，标尺的位置应该是零刻度线在视野的边缘，从测微器上读数就象格尺一样，测得直径后，视野面积便可由下式计算：视野面积（直径/2）2*3.14（0.545/2）2*3.14=0.233 2009 Cargill Incorporated.All rights r
7、eserved计数程序 计算Millipore滤膜的面积。尽管滤器的直径是15.6mm，但过滤使用的不是滤器的总面积。有水和一滴染色剂结合的50ml样品应该被过滤。可以测量有染色剂存留的滤器的面积。滤器直径一旦被测量，滤器的面积便可由下式计算：滤器面积（直径/2）2*3.14（15.6/2）2*3.14=191.038 显微镜的视野面积和滤器的面积一旦确定，滤器面积的视野数量按下式计算：视野数滤器面积/视野面积=191.038/0.233=819.90 计算1ml的视野数/ml总滤器面积的视野数/样品的毫升数=819.90/10=82 2009 Cargill Incorporated.All
8、 rights reserved11/5/202211问题分析 注意对细胞的精确计数？检查光源是否打开？检查光线是否有偏离？视野光线是否均匀或者过亮？细胞是否形态明显且清晰？膜上是否有浸油？所用的水是否有污染？滤膜表面是否有染色剂存在？可见光灯是否打开？视野的焦距是否正确？形态是规则的还是不规则的？2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202212DME显微镜读数与辨认的培训 讨论下面几张显微图片中以下微生物或杂质的形态差异 Mycelium霉菌 Bacteria细菌 Yeast酵母 Debris异物形态和大小的差异有哪些？2009
9、 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202213细菌 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202214酵母菌和细菌 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202215霉菌菌丝 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202216霉菌，细菌和酵母菌 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/20221
10、7异物多时的照片 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill In
11、corporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights re
12、served 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved 2009 Cargill Incorporated.All rights reserved11/5/202232DME检测频率 DME ScheduleDME 取样表细菌酵母菌霉菌异物*备注Daily每天bacteriayeastmolddebris*commentsSACC Oldest正在出料的糖化产品2236961143900many绿色大块杂质Drum Filter filtrate转鼓泵出口滤液(P6511)1220161042220many绿色大块杂质DX CC Feed Ta
13、nk葡萄糖碳柱供料罐(TK6517)20336101680many绿色大块杂质DX Check Filter Feed Tank葡萄糖检查过滤供料罐(TK6519)62323280moderate DX IX Feed Tank葡萄糖离交供料罐(TK6520)19681640moderate DX Evaporator Feed Tank葡萄糖蒸发供料罐(TK6548)213200few ISO pH Trim Tank异构pH调节罐(TK6527)246000few FX CC Feed Tank果糖碳柱供料罐(TK6531)229600few FX Check Filter Feed Ta
14、nk果糖检查过滤供料罐(TK6007)237800few FX IX Feed Tank果糖离交供料罐(TK6532)246000few FX Evaporator Feed Tank果糖蒸发供料罐(TK6549)254200few 42 buffer tank42 缓存罐205000few ADSEP water色谱洗水41000few ADSEP Feed色谱供料270600few ADSEP product色谱产品196800few ADSEP by product色谱副产品196800few 90 buffer tank90缓存罐(TK6547)188600few MB Feed Ta
15、nk混床供料罐(TK6552)246000few 55 Evaporator Feed Tank55蒸发供料罐(TK6546)221400few Cuno In(1/4hours)Cuno进（1/4小时）270600few Cuno Out-2(1/4hours)Cuno出口（1/4小时）23800few 55 Evaporator Out(1/4hours)55蒸发出口（1/4小时）24600few Sweet Water甜水(TK6511)1640820few Process Water工艺水(TK6510)32800few condensate water冷凝水（TK6013）41000few 2009 Cargill Incorporated.All rights reservedQ&A?
