1、大肠菌群检测操作规范培训大肠菌群检测操作规范培训质量管理部质量管理部目录目录一、细菌介绍一、细菌介绍二、大肠杆菌生物学特性二、大肠杆菌生物学特性三、大肠杆菌检测仪器、设备三、大肠杆菌检测仪器、设备四、检测培养基及试剂四、检测培养基及试剂五、检测前培养基准备五、检测前培养基准备六、接种培养六、接种培养七、七、MPN单位介绍单位介绍八、检测注意事项八、检测注意事项一、细菌介绍一、细菌介绍细菌是单细胞原核微生物，个体微小细菌是单细胞原核微生物，个体微小（细胞直径约（细胞直径约0.5m,0.5-5m），结构），结构简单，以二等分裂方式繁殖。在自然简单，以二等分裂方式繁殖。在自然界中，细菌分布最广、数量
2、最多。界中，细菌分布最广、数量最多。1、细菌的形态 细菌个体微小、形态各异细菌个体微小、形态各异球菌球菌杆菌杆菌弧菌与弯曲菌弧菌与弯曲菌螺旋菌及螺旋体螺旋菌及螺旋体不规则形不规则形弧菌弧菌2、细菌的结构 细菌的基本结构包括：细胞壁、细菌的基本结构包括：细胞壁、细胞膜、细胞膜、间体、细胞浆、核糖体、细胞质。间体、细胞浆、核糖体、细胞质。细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、细菌的附属结构包括：质粒、荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞。菌毛和芽胞。3、细菌的繁殖 细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁细菌最普遍、最主要的繁殖方式：二分分裂繁殖。在分裂前先延长菌体，染色体复制为二，殖。在分裂前先延长菌体，染色
3、体复制为二，然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质然后垂直于长轴分裂，细胞赤道附近的细胞质膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔膜凹陷生长，直至形成横隔膜，同时形成横隔壁，这样便产生两个子细胞壁，这样便产生两个子细胞。4、细菌的菌落 单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团菌落。形态构造的子细胞集团菌落。细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一
4、致等。或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落图细菌的菌落图二、大肠杆菌生物学特性大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、主要包括埃希氏菌、柠檬酸细菌、肠杆菌、克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。克雷伯氏菌等，均属于肠杆菌。大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏大肠菌群以大肠埃希氏菌为主，是革兰氏阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生阴性、两端钝圆的杆菌，无芽孢，以周生鞭毛运动或不运动。鞭毛运动或不运动。最适生长温度为最适生长温度为37，在，在42-44条件下
5、仍条件下仍能生长，生长温度范围为能生长，生长温度范围为15-46。1、大肠杆菌平板菌落照片2、大肠杆菌革兰氏染色照片3、大肠杆菌微菌落照片4、大肠杆菌透射电镜照片5、大肠杆菌扫描电镜照片6、大肠杆菌分裂照片三、检测仪器、设备 冰箱：冰箱：04 恒温培养箱：恒温培养箱：361 恒温水浴锅：恒温水浴锅：461 微生物显微镜微生物显微镜架盘药物天平：架盘药物天平：0g500g，精确至，精确至0.5g 三角瓶：三角瓶：500ml 灭菌吸管：灭菌吸管：1ml、10ml 灭菌平皿：直径灭菌平皿：直径90mm 试管：试管：18180mm四、检测培养基及试剂乳糖胆盐发酵管乳糖胆盐发酵管伊红美蓝琼脂伊红美蓝琼脂
6、乳糖发酵管乳糖发酵管革兰氏染色液革兰氏染色液生理盐水生理盐水乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。乳糖胆盐发酵管：用于大肠菌群的测定。35g乳糖胆盐于乳糖胆盐于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，试管中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。倍。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。乳糖发酵管：大肠菌群证实试验用。30g乳乳糖于糖于1升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管升蒸馏水中，溶解，分装于发酵试管中，放入小倒管，中，放入小倒管，11515分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。
7、伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板伊红美兰琼脂：用于大肠菌群的固体平板检测。检测。37.5g于于1升蒸馏水中，摇匀，加热升蒸馏水中，摇匀，加热煮沸，煮沸，12115分钟高压灭菌。分钟高压灭菌。五、检测前培养基准备 检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培检查预先经过灭菌处理的乳糖胆盐发酵培养基小导管内是否有气体。养基小导管内是否有气体。按产品品种将培养基分别放在试管架内，按产品品种将培养基分别放在试管架内，同时将同时将9ml 0.85%灭菌盐水管也放入相应的灭菌盐水管也放入相应的试管架内。试管架内。六、接种培养（一）酸牛奶系列产品（一）酸牛奶系列产品酸牛奶系列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养酸牛奶系
8、列产品接种单料乳糖胆盐发酵培养基基9支管，分别接种样品量为支管，分别接种样品量为1ml(原浓度原浓度)3支，支，0.1ml(10-1浓度浓度)3支，支，0.01ml(10-2浓度浓度)3支支。1、1ml接种培养在无菌条件下，用在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样样品试液于含有品试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成振荡摇匀制成1:10的稀释液；同时分别吸取的稀释液；同时分别吸取1ml样品试液于样品试液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。并轻微振荡摇匀，放入原位置。2、0.1ml接种培养另换另换1根根1
9、ml灭菌移液管吸取灭菌移液管吸取1:10的稀释液的稀释液1ml于含有于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成荡摇匀制成1:100的稀释液；同时分别吸取的稀释液；同时分别吸取1ml 1:10稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。3、0.01ml接种培养另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:100稀释液于稀释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。并轻微振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像检测接种过程操作录像检
10、测单料大肠检单料大肠检测测.MPG5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h，观察乳糖，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。胆盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。（二）活性乳酸菌饮料系列产品活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆活性乳酸菌饮料系列产品接种双料乳糖胆盐发酵培养基盐发酵培养基3支管，单料乳糖胆盐发酵培支管，单料乳糖胆盐发酵培养基养基6支，分别接种样品量为支，分别接种样品量为10ml 3支，支，1ml 3支，支，0.1ml 3支。
11、支。1、10ml接种培养在无菌条件下，用在无菌条件下，用1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1ml样品样品试液于含有试液于含有9ml0.85%灭菌盐水试管中，振荡灭菌盐水试管中，振荡摇匀制成摇匀制成1:10的稀释液；同时用的稀释液；同时用10ml灭菌吸管灭菌吸管分别吸取分别吸取10ml样品试液于样品试液于3支双料乳糖胆盐发支双料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。2、1ml接种培养另用另用1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 样品试液样品试液于于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。摇匀，放入
12、原位置。3、0.1ml接种培养另换另换1根根1ml灭菌移液管分别吸取灭菌移液管分别吸取1ml 1:10稀稀释液于释液于3支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微支单料乳糖胆盐发酵管内，并轻微振荡摇匀，放入原位置。振荡摇匀，放入原位置。4、接种过程操作录像检测、接种过程操作录像检测双料大肠检双料大肠检测测.MPG5、接种后培养将接种完的试管连同试管架一起置于将接种完的试管连同试管架一起置于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h，观察乳糖，观察乳糖胆盐发酵管的变化情况。胆盐发酵管的变化情况。6、结果查询并记录若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则若所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，则报告大肠菌群阴性报告大肠
13、菌群阴性。若有产酸产气，则要做证实试验。若有产酸产气，则要做证实试验。（三）证实试验1、伊红美蓝琼脂平板分离将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分将产酸产气乳糖胆盐发酵管内的培养物分别接种于伊红美兰琼脂平板别接种于伊红美兰琼脂平板(划线分离划线分离)，置，置于于361的培养箱内培养的培养箱内培养242h。接种和分离工具1接种针接种针 2.接种环接种环 3.接种钩接种钩 4.5.玻璃涂棒玻璃涂棒 6.接种圈接种圈 7.接种锄接种锄 8.小解剖刀小解剖刀平板分离画线法1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法将伊红美蓝琼脂平板从培养箱取出后,观察菌落形态
14、，并做革兰氏染色和乳糖复发酵试验。革兰氏染色：见革兰氏染色及镜检操作规范。（四）乳糖发酵试验挑取可疑菌落进行革兰氏染色后接种乳糖发酵培养基，置于361的培养箱内培养242h，观察产气情况。凡是革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管产酸产气的菌落即可报告大肠菌群阳性。根据证实为大肠菌群的阳性管数，查根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，查找每检索表，查找每100ml样品内的大肠菌群的样品内的大肠菌群的MPN值。值。将检测结果填入将检测结果填入微生物检测报告单微生物检测报告单，并及时传递给相关部门。并及时传递给相关部门。七、MPN单位介绍MPN=Most Probable Number，最大可能，
15、最大可能数数，是一种利用统计学检测微生物的方法。，是一种利用统计学检测微生物的方法。食品大肠菌群是以每克或食品大肠菌群是以每克或100ML中大肠菌中大肠菌群的最近似值，是用群的最近似值，是用MPN来表示。来表示。采用采用9管法，对样品选三个稀释度，每个稀管法，对样品选三个稀释度，每个稀释度接种三管相应的培养基进行培养，然释度接种三管相应的培养基进行培养，然后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据后根据情况做出判断阳性和阴性，再根据不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测不同稀释度的阳性管数查表即可得到被测样品相应指标的样品相应指标的MPN值。值。八、注意事项 乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试
16、乳糖胆盐发酵管内小导管内如无气泡，需轻振试管，若有气泡上冒，也算产气。管，若有气泡上冒，也算产气。在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属在伊红美蓝琼脂平板上的菌落如为深紫色有金属光泽，则为典型菌落，光泽，则为典型菌落，98%以上为大肠菌群。以上为大肠菌群。革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典革兰氏染色和乳糖复发酵时如有典型菌落，则挑取典型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。型菌落；无典型菌落，应挑取红色和粉色菌落。如果只有红色或粉色菌落，应挑取如果只有红色或粉色菌落，应挑取3个进行革兰氏染个进行革兰氏染色，并接种乳糖发酵培养基。色，并接种乳糖发酵培养基。如果有红色和粉色菌落，
17、则各挑取如果有红色和粉色菌落，则各挑取3个做革兰氏染色，个做革兰氏染色，各挑取各挑取3个接种乳糖发酵培养基混合接种。个接种乳糖发酵培养基混合接种。1、最孤独的时光，会塑造最坚强的自己。2、把脸一直向着阳光，这样就不会见到阴影。3、永远不要埋怨你已经发生的事情，要么就改变它，要么就安静的接受它。4、不论你在什么时候开始，重要的是开始之后就不要停止。5、通往光明的道路是平坦的，为了成功，为了奋斗的渴望，我们不得不努力。6、付出了不一定有回报，但不付出永远没有回报。7、成功就是你被击落到失望的深渊之后反弹得有多高。8、为了照亮夜空，星星才站在天空的高处。9、我们的人生必须励志，不励志就仿佛没有灵魂。
18、10、拼尽全力，逼自己优秀一把，青春已所剩不多。11、一个人如果不能从内心去原谅别人，那他就永远不会心安理得。12、每个人心里都有一段伤痕，时间才是最好的疗剂。13、如果我不坚强，那就等着别人来嘲笑。14、早晨给自己一个微笑，种下一天旳阳光。15、没有爱不会死，不过有了爱会活过来。16、失败的定义：什么都要做，什么都在做，却从未做完过，也未做好过。17、当我微笑着说我很好的时候，你应该对我说，安好就好。18、人不仅要做好事，更要以准确的方式做好事。19、我们并不需要用太华丽的语言来包裹自己，因为我们要做最真实的自己。20、一个人除非自己有信心，否则无法带给别人信心。21、为别人鼓掌的人也是在给
19、自己的生命加油。22、失去金钱的人损失甚少，失去健康的人损失极多，失去勇气的人损失一切。23、相信就是强大，怀疑只会抑制能力，而信仰就是力量。24、那些尝试去做某事却失败的人，比那些什么也不尝试做却成功的人不知要好上多少。25、自己打败自己是最可悲的失败，自己战胜自己是最可贵的胜利。26、没有热忱，世间便无进步。27、失败并不意味你浪费了时间和生命，失败表明你有理由重新开始。28、青春如此华美，却在烟火在散场。29、生命的道路上永远没有捷径可言，只有脚踏实地走下去。30、只要还有明天，今天就永远是起跑线。31、认真可以把事情做对，而用心却可以做到完美。32、如果上帝没有帮助你那他一定相信你可以
20、。33、只要有信心，人永远不会挫败。34、珍惜今天的美好就是为了让明天的回忆更美好。35、只要你在路上，就不要放弃前进的勇气，走走停停的生活会一直继续。36、大起大落谁都有拍拍灰尘继续走。37、孤独并不可怕，每个人都是孤独的，可怕的是害怕孤独。38、宁可失败在你喜欢的事情上，也不要成功在你所憎恶的事情上。39、我很平凡，但骨子里的我却很勇敢。40、眼中闪烁的泪光，也将化作永不妥协的坚强。41、我不去想是否能够成功，既然选了远方，便只顾风雨兼程。42、宁可自己去原谅别人，莫等别人来原谅自己。43、踩着垃圾到达的高度和踩着金子到达的高度是一样的。44、每天告诉自己一次：我真的很不错。45、人生最大
21、的挑战没过于战胜自己！46、愚痴的人，一直想要别人了解他。有智慧的人，却努力的了解自己。47、现实的压力压的我们喘不过气也压的我们走向成功。48、心若有阳光，你便会看见这个世界有那么多美好值得期待和向往。49、相信自己，你能作茧自缚，就能破茧成蝶。50、不能强迫别人来爱自己，只能努力让自己成为值得爱的人。51、不要拿过去的记忆，来折磨现在的自己。52、汗水是成功的润滑剂。53、人必须有自信，这是成功的秘密。54、成功的秘密在于始终如一地忠于目标。55、只有一条路不能选择那就是放弃。56、最后的措手不及是因为当初游刃有余的自己57、现实很近又很冷，梦想很远却很温暖。58、没有人能替你承受痛苦，也
22、没有人能抢走你的坚强。59、不要拿我跟任何人比，我不是谁的影子，更不是谁的替代品，我不知道年少轻狂，我只懂得胜者为。60、如果你看到面前的阴影，别怕，那是因为你的背后有阳光。61、宁可笑着流泪，绝不哭着后悔。62、觉得自己做得到和做不到，只在一念之间。63、跌倒，撞墙，一败涂地，都不用害怕，年轻叫你勇敢。64、做最好的今天，回顾最好的昨天，迎接最美好的明天。65、每件事情都必须有一个期限，否则，大多数人都会有多少时间就花掉多少时间。66、当你被压力压得透不过气来的时候，记住，碳正是因为压力而变成闪耀的钻石。67、现实会告诉你，不努力就会被生活给踩死。无需找什么借口，一无所有，就是拼的理由。68
23、、人生道路，绝大多数人，绝大多数时候，人都只能靠自己。69、不是某人使你烦恼，而是你拿某人的言行来烦恼自己。70、当一个人真正觉悟的一刻，他放弃追寻外在世界的财富，而开始追寻他內心世界的真正财富。71、失败并不意味你浪费了时间和生命，失败表明你有理由重新开始。72、人生应该树立目标，否则你的精力会白白浪费。73、山涧的泉水经过一路曲折，才唱出一支美妙的歌。74、时间告诉我，无理取闹的年龄过了，该懂事了。75、命运是不存在的，它不过是失败者拿来逃避现实的借口。76、人总是在失去了才知道珍惜！77、要铭记在心：每天都是一年中最美好的日子。78、生活远没有咖啡那么苦涩，关键是喝它的人怎么品味！每个人
24、都喜欢和向往随心所欲的生活，殊不知随心所欲根本不是生活。79、别拿自己的无知说成是别人的愚昧！80、天空的高度是鸟儿飞出来的，水无论有多深是鱼儿游出来的。81、思想如钻子，必须集中在一点钻下去才有力量。82、如果我坚持什么，就是用大炮也不能打倒我。83、我们要以今天为坐标，畅想未来几年后的自己。84、日出时，努力使每一天都开心而有意义，不为别人，为自己。85、有梦就去追，没死就别停。86、今天不为学习买单，未来就为贫穷买单。87、因为一无所有这才是拼下去的理由。88、只要我还有梦，就会看到彩虹!89、你既认准这条路，又何必在意要走多久。90、尽管社会是这样的现实和残酷，但我们还是必须往下走。91、能把在面前行走的机会抓住的人，十有八九都会成功。92、你能够先知先觉地领导产业，后知后觉地苦苦追赶，或不知不觉地被淘汰。93、强烈的信仰会赢取坚强的人，然后又使他们更坚强。94、人生，不可能一帆风顺，有得就有失，有爱就有恨，有快乐就会有苦恼，有生就有死，生活就是这样。95、好习惯的养成，在于不受坏习惯的诱惑。96、凡过于把幸运之事归功于自我的聪明和智谋的人多半是结局很不幸的。97、如果我们一直告诫自己要开心过每一天，就是说我们并不开心。98、天气影响身体，身体决定思想，思想左右心情。99、不论你在什么时候结束，重要的是结束之后就不要悔恨。100、只要还有明天，今天就永远是起跑线。
