1、.1第六章第六章免疫沉淀试验免疫沉淀试验.2 教教 学学 目目 的的l掌握：掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验原理原理l熟悉：熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、沉淀反应的特点、免疫电泳技术、沉淀反应的应用沉淀反应的应用.3 一、基本原理一、基本原理免疫沉淀反应（免疫沉淀反应（immunoprecipitation reaction）指可溶性抗原与相应抗体在指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。淀现象。第一节第一节 免疫沉淀试验的基本原理免疫沉淀试验的基本原理.4形成肉眼可见的大的形成肉眼可见的大的免
2、疫复合物。免疫复合物。第一阶段第一阶段第二阶段第二阶段沉淀反应分两个阶段沉淀反应分两个阶段抗原抗体特异性结抗原抗体特异性结合，快速但不可见合，快速但不可见.5环状沉淀试验环状沉淀试验絮状沉淀试验絮状沉淀试验免疫浊度测定免疫浊度测定免疫扩散试验免疫扩散试验免疫电泳技术免疫电泳技术液体内液体内沉淀试验沉淀试验凝胶内凝胶内沉淀试验沉淀试验二、免疫沉淀试验的分类二、免疫沉淀试验的分类.61.阶段性阶段性2.特异性特异性3.抗原性质：可溶性抗原性质：可溶性4.抗体的选择：抗体的选择：2价价 三、三、免疫沉淀试验的特点免疫沉淀试验的特点.7第二节第二节 液体免疫沉淀试验液体免疫沉淀试验.8一、絮状免疫沉淀
3、试验一、絮状免疫沉淀试验絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应絮状免疫沉淀试验是将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条件下，抗体混合，在电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。沉淀物。第二节第二节 液体免疫沉淀试验液体免疫沉淀试验.9抗原稀释法：抗原最适比例抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例一、絮状免疫沉淀试验一、絮状免疫沉淀试验.101:21:41:81:161:321:641:128各管抗原倍比稀释各管抗原倍比稀释加入抗血清加入抗血清各管抗体量不变各管抗体量
4、不变振摇振摇 混匀、混匀、3737孵育孵育沉淀量不同沉淀量不同出现沉淀量最多的管为最适比例管。出现沉淀量最多的管为最适比例管。轻摇轻摇絮絮 状状沉沉示示 意意 图图淀淀AgAgAbAbAgAg.11最适比方阵测定法最适比方阵测定法.12 原理：原理：当可溶性抗原与相应抗体特异结当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在增浊剂中合，二者比例合适时，在增浊剂中它们快速形成一定大小的抗原抗体它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。复合物，使反应液体出现浊度。二、免疫浊度测定二、免疫浊度测定.13优优 点：点：l稳定性好、简便快速，易于自动化稳定性好、简便快速，易于自动化l敏
5、感度高敏感度高l精确度高精确度高l无放射性核素污染无放射性核素污染.141.根据反应的时间和反应结合的动力学分为根据反应的时间和反应结合的动力学分为 速率比浊法速率比浊法 终点比浊法终点比浊法 2.根据检测仪器的位置及光信号性质分为根据检测仪器的位置及光信号性质分为 透射免疫比浊法透射免疫比浊法 散射免疫比浊法散射免疫比浊法3.免疫胶乳比浊法免疫胶乳比浊法分分 类：类：.15 透射比浊试验和散射比浊试验光路透射比浊试验和散射比浊试验光路检测器检测器A检测器检测器B IC I0 I I 透射比浊试透射比浊试验验 散射比浊试验散射比浊试验当复合物当复合物3106dal，II;90，散射光，散射光的
6、量代表的量代表IC的量。的量。.16（1）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量）抗原抗体的比例：反应体系保持抗体过量（2）抗体的质量）抗体的质量：特异性强，效价高，亲和力：特异性强，效价高，亲和力强，并使用强，并使用R型抗体型抗体（3）抗原抗体反应液的环境：最适）抗原抗体反应液的环境：最适PH为为6.5-8.5（4）增浊剂）增浊剂补充：免疫浊度测定影响因素补充：免疫浊度测定影响因素.17（1）抗原抗体的比例）抗原抗体的比例.18 在抗体过量的反应体系中在抗体过量的反应体系中,抗原量的递抗原量的递增与比浊定量成正比增与比浊定量成正比,当抗原抗体比例合当抗原抗体比例合适时反应达峰值适时反应达峰值,
7、而当抗原过量时而当抗原过量时,形成的形成的免疫复合物分子小免疫复合物分子小,浊度反而下降的一个浊度反而下降的一个抛物曲线。抛物曲线。海德堡曲线海德堡曲线.19（2）抗体的质量）抗体的质量抗体的特异性抗体的特异性抗体的效价抗体的效价(1:20)抗体的亲和力抗体的亲和力R型和型和H型抗体（型抗体（R型）型）.20（3）抗原抗体反应的环境）抗原抗体反应的环境最适最适PH为：为：6.5-8.5离子强度大，离子强度大，IC形成快形成快离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液离子种类的影响，常用磷酸盐缓冲液（4）增浊剂）增浊剂PEG(60008000)浓度浓度4%吐温吐温-20.211.抗血清中有非特异性的交叉反
8、应性杂抗血清中有非特异性的交叉反应性杂抗体成分抗体成分2.增浊剂浓度和反应时间掌握不当增浊剂浓度和反应时间掌握不当3.样品本身的浊度处理不当样品本身的浊度处理不当4.试剂污染变质试剂污染变质5.比色杯不够清洁比色杯不够清洁 伪浊度形成的原因伪浊度形成的原因.22第三节第三节 凝胶内免疫沉淀试验凝胶内免疫沉淀试验.23第三节第三节 凝胶内免疫沉淀试验凝胶内免疫沉淀试验.24 可溶性抗原和相应抗体在凝胶中可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度比例适当的位置形成相遇并且浓度比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或沉淀环。肉眼可见的沉淀线或沉淀
9、环。原理原理.25反应介质：凝胶反应介质：凝胶凝胶的特点：凝胶的特点：1、固相的液体、固相的液体2、多孔的网状结构、多孔的网状结构3、Ag-Ab复合物网络在凝胶复合物网络在凝胶中中.26原理：抗体与待测的抗原理：抗体与待测的抗原原,在两者比例合适的在两者比例合适的部位结合形成沉淀环。部位结合形成沉淀环。环的大小与抗原的浓环的大小与抗原的浓度成正相关。度成正相关。技术要点：技术要点：1.制板制板2.打孔打孔3.加样加样4.扩散扩散 5.绘制标准曲线绘制标准曲线定量试验定量试验一、单向免疫扩散试验一、单向免疫扩散试验.27倾注平板打孔加样倾注平板打孔加样 放置放置372448h观察沉淀观察沉淀环环
10、 一、单向免疫扩散试验一、单向免疫扩散试验.28.29T T1 1为为16-24h16-24h；T T2 2为为24-48h24-48h；T T3 3为为48h48h以上以上,可见可见T T3 3为直线，为直线，T T1 1为反抛物线为反抛物线t t1 1为为16-24h16-24h；t t2 2为为24-48h24-48h；t t3 3为为48h48h以上以上,可见可见t t1 1为直线，为直线，t t3 3为反抛为反抛物线物线ManciniMancini曲线曲线FaheyFahey曲线曲线.30待检蛋白质抗原须具备的条件待检蛋白质抗原须具备的条件l仅针对某待测抗原的单价特异性抗血清仅针对某
11、待测抗原的单价特异性抗血清l已知含量的标准品已知含量的标准品l待测品含量在待测品含量在1.25 g/ml以上以上.31单向扩散试验单向扩散试验上排为上排为5个不同浓度的参考品；个不同浓度的参考品；下排为患者血清，下排右下排为患者血清，下排右2为异常病理血清为异常病理血清一、单向免疫扩散试验一、单向免疫扩散试验.32应应 用用IgG、IgA、IgM、C3、C4、转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白转铁蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多种血浆蛋白的检测等多种血浆蛋白的检测.33技术要点：技术要点：1.制板制板 2.打孔打孔 3.加样加样 4.扩散扩散二、双向免疫扩散试验二、双向免疫扩散试验.
12、34.35.361.判断抗原或抗体的存在判断抗原或抗体的存在以及以及估计估计相对含量相对含量2.分析抗原或抗体相分析抗原或抗体相对分子量对分子量 二、双向免疫扩散试验二、双向免疫扩散试验.373.分析分析抗原的抗原的性质性质二、双向免疫扩散试验二、双向免疫扩散试验.38.394.滴定滴定抗体抗体的的效价效价5.鉴定鉴定抗原或抗体抗原或抗体纯度纯度 二、双向免疫扩散试验二、双向免疫扩散试验.40 应应 用用 1.AFP检测的最早方法检测的最早方法 2.血清中含量较高的酶类、细血清中含量较高的酶类、细菌病毒感染后血清中产生的抗菌病毒感染后血清中产生的抗体的检测体的检测.41三、免疫电泳技术三、免疫
13、电泳技术.42 优点：优点：1.加快反应的速度。加快反应的速度。2.提高了灵敏度。提高了灵敏度。3.增加了分辨率增加了分辨率。电泳分析电泳分析沉淀反应沉淀反应抗原抗体反应抗原抗体反应的高度特异性的高度特异性电泳技术的高电泳技术的高分辨率、快速、分辨率、快速、微量微量三、免疫电泳技术三、免疫电泳技术.43电泳电泳（electrophoresis）：在外加在外加电场的作用下带电颗粒向着其电性相电场的作用下带电颗粒向着其电性相反的电极移动，称为电泳。反的电极移动，称为电泳。.44l电泳迁移率：电泳迁移率：定义：同一电场条件下，各种带电粒子在定义：同一电场条件下，各种带电粒子在 单位时间内移动的距离。
14、单位时间内移动的距离。M=cm2/VS影响泳动的速度的因素影响泳动的速度的因素:本身净电荷量、颗粒大小、形状本身净电荷量、颗粒大小、形状 电场强度电场强度 溶液溶液pH值值 溶液离子强度溶液离子强度 电电 渗渗.45l电渗：电渗：电场中液体相对于固体的运动电场中液体相对于固体的运动 载体的性质载体的性质 缓冲液的离子强度缓冲液的离子强度 电泳时的电压电泳时的电压.46电渗方向与样品运动方向一致：电渗方向与样品运动方向一致：样品迁移率加快样品迁移率加快 电渗方向与样品运动方向不一致：电渗方向与样品运动方向不一致：样品迁移率降低，甚至倒退样品迁移率降低，甚至倒退.47l电泳载体：电泳载体：琼脂琼脂
15、 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 常用浓度：常用浓度：0.8%-1.0%特点特点:杂质少、接近电中性，常温易凝杂质少、接近电中性，常温易凝固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。.48l蛋白质的两性解离性质：蛋白质的两性解离性质：-NH2 +H2O -NH3+OH-COOH -COO-+H+两性离子两性离子pH=pI 电中性，无电泳移动性电中性，无电泳移动性pHpI 碱性溶液碱性溶液 带负离子，向阳极泳动带负离子，向阳极泳动.49原理：双向扩散原理：双向扩散+电泳电泳实质上是定向加速度的免疫双扩散实质上是定向加速度的免疫双扩散技术技术 比双向扩散试验灵敏度提高比双向扩散试验灵
16、敏度提高8 16倍倍（一一）对流免疫电泳）对流免疫电泳.50通电通电蛋白质抗原常带蛋白质抗原常带较强的负电荷，较强的负电荷，在电场中向正极在电场中向正极移动移动抗体球蛋白带负抗体球蛋白带负电荷较少，籍电电荷较少，籍电渗作用向负极泳渗作用向负极泳动动（一）对流免疫电泳（一）对流免疫电泳.51.52结果分析：结果分析：l无沉淀线出现则表明无沉淀线出现则表明无相应的抗原。无相应的抗原。l沉淀线位于抗原抗体沉淀线位于抗原抗体孔中间，说明两者比孔中间，说明两者比例较适合。例较适合。（一）对流免疫电泳（一）对流免疫电泳.53技术评价：技术评价：1.简便、快速简便、快速,敏感度较双扩提高敏感度较双扩提高8-
17、16倍，倍，可测蛋白质浓度达可测蛋白质浓度达 ug/ml.2.要求抗原、抗体比例严格要求抗原、抗体比例严格3.不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测不适宜抗原抗体都是球蛋白的检测.54 抗原抗体分子复合物形抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。原量呈正相关。单向免疫扩散电泳单向免疫扩散电泳,定量检测技术定量检测技术（二）（二）火箭免疫电泳火箭免疫电泳.551.2%巴比妥琼脂糖约巴比妥琼脂糖约55，加入适量抗，加入适量抗血清，混匀后制
18、板，打孔，孔内加待测样血清，混匀后制板，打孔，孔内加待测样品，样品孔放负极侧，品，样品孔放负极侧，6h后观察琼脂板后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品上沉淀峰，绘制标准曲线，求出待测样品浓度。浓度。技术要点技术要点（二）（二）火箭免疫电泳火箭免疫电泳.56火箭免疫电泳图火箭免疫电泳图为标准抗原；为标准抗原；为标本为标本-+（二）火箭免疫电泳示意图（二）火箭免疫电泳示意图.57结果判定：结果判定：1、定性：直接观察、染色、定性：直接观察、染色 2、定量：根据峰高、定量：根据峰高-浓度标准曲线计算浓度标准曲线计算3、为提高灵敏度，可加入少量、为提高灵敏度，可加入少量125I标记的标标记
19、的标准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形准抗原共同电泳，则可在含抗体的琼脂中形成不可见的火箭峰成不可见的火箭峰.58原理原理：区带电泳双向扩散：区带电泳双向扩散1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带不可见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散加入相应抗血清进行双向扩散（三）免疫电泳三）免疫电泳.59l根据各蛋白所处的电泳位置根据各蛋白所处的电泳位置,可分为可分为:l白蛋白区、球蛋白区、白蛋白区、球蛋白区、1区、区、2区、区、区、区、区区 +-ALB 1 2 白蛋白白蛋白 抗胰
20、蛋白酶抗胰蛋白酶 触珠蛋白触珠蛋白 转铁蛋白转铁蛋白 IgG前白蛋白前白蛋白 酸糖蛋白酸糖蛋白 铜蓝蛋白铜蓝蛋白 C3aC3b CRP 1脂蛋白脂蛋白 抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶 巨球蛋白巨球蛋白.60.61.621.纯化抗原和抗体成分的分析纯化抗原和抗体成分的分析2.正常及异常免疫球蛋白的识别与鉴定正常及异常免疫球蛋白的识别与鉴定应用应用免免 疫疫 电电 泳泳.63-+（三）免疫电泳示意图（三）免疫电泳示意图.64.65技术评价：技术评价：1.分辨率较高分辨率较高 2.仅定性仅定性 3.扩散时间长，影响因素多，结果较难分析扩散时间长，影响因素多，结果较难分析4.目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分
21、目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别与鉴定。析及正常和异常体液蛋白的识别与鉴定。.66抗原抗体在凝胶中直接发抗原抗体在凝胶中直接发生沉淀反应，在适当位置生沉淀反应，在适当位置形成抗原抗体复合物，经形成抗原抗体复合物，经染色后，可对各类免疫球染色后，可对各类免疫球蛋白及其轻链进行分型蛋白及其轻链进行分型 原理原理区带电泳区带电泳沉淀反应沉淀反应（四）免疫固定电泳四）免疫固定电泳.67左图为左图为IgG 型型,中图为中图为IgG 型，右为正常型，右为正常 SPG AM SPG AM SPGAM （四）免疫固定电泳示意图（四）免疫固定电泳示意图.68原理：原理：待检蛋白电
22、泳待检蛋白电泳 固定剂及各类抗血清加于凝胶表面的泳道固定剂及各类抗血清加于凝胶表面的泳道 抗原与对应抗体反应抗原与对应抗体反应 沉淀沉淀 漂洗漂洗 染色染色 某一抗原的存在某一抗原的存在?.69分辨率强，敏感度高，操作周期短，分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析仅需数小时，结果易于分析。应用应用最常用于最常用于M蛋白的鉴定与分型，也用于尿蛋白的鉴定与分型，也用于尿中本周氏蛋白质的检测与中本周氏蛋白质的检测与、分型，脑分型，脑脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。脊液中寡克隆蛋白的检测与分型。优点优点（四）免（四）免 疫疫 固固 定定 电电 泳泳.70应用应用:M 蛋白的鉴定和分型蛋
23、白的鉴定和分型.71（五）交叉免疫电泳五）交叉免疫电泳（六）自动化免疫电泳六）自动化免疫电泳.72第四节第四节 免疫沉淀试验的临床应用免疫沉淀试验的临床应用免疫浊度法：蛋白质的检测免疫浊度法：蛋白质的检测如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、如免疫球蛋白、补体、类风湿因子、C反应蛋白等反应蛋白等.73第五节第五节 临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点临床常用免疫沉淀试验试剂方法特点一、胶乳增强的透射免疫比浊试验在全自动生一、胶乳增强的透射免疫比浊试验在全自动生化分析仪中的应用化分析仪中的应用二、胶乳增强的透射免疫比浊试验在血凝固分二、胶乳增强的透射免疫比浊试验在血凝固分析仪中的应用析仪中的应用三、免疫固定电泳在半自动电泳仪中的应用三、免疫固定电泳在半自动电泳仪中的应用四、散射免疫比浊试验在特种蛋白免疫分析仪四、散射免疫比浊试验在特种蛋白免疫分析仪中的应用中的应用.74第六节第六节 影响免疫沉淀试验的主要因素影响免疫沉淀试验的主要因素如温度、电解质、酸碱度等如温度、电解质、酸碱度等.75名词名词:沉淀反应沉淀反应简答简答:1.双向免疫扩散试验的应用双向免疫扩散试验的应用2.免疫电泳技术的类型免疫电泳技术的类型思思 考考 题题
