1、第二讲细胞工程优选第二讲细胞工程第二节 细胞的基本概念1.细胞是生命活动的基本单位n细胞是构成有机体的基本单位n细胞是代谢与功能的基本单位：细胞具有独立的、有序的自控代谢体系n细胞是有机体生长发育的基础：有机体生长是以细胞增殖与分化为基础的n细胞具有遗传的全能性：单个的植物生殖细胞或单个体细胞、未受精的两栖类动物卵细胞可经处理发育成完整的个体2.细胞的基本共性n所有细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜n所有细胞都有两种核酸：DNA和RNAn都有核糖体n所有细胞增殖都以一分为二的方式进行分裂3.细胞生物学的研究方法3.1 细胞形态结构的观察方法光学显微技术 光学显微镜的分辨率受到介
2、质折射率和光波长的影响n普通光学显微镜n荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一n激光共聚焦扫描显微镜 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量，其原理是利用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍n相差显微镜和微分干涉显微镜电子显微镜n 电子显微镜与光学显微镜的成
3、像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成，图制片技术1）超薄切片 通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度2050nm，切片采用重金属盐染色，以增大反差，图2）负染技术 负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出
4、地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右，图 3）冰冻蚀刻 n冰冻蚀刻又称冰冻断裂。标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻。然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构，图 扫描电子显微镜 n 扫描电子显微镜用来观察标本的表面结构。其原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子
5、的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号，图扫描隧道显微镜n扫描隧道显微镜由Binnig等1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压，针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与
6、样品间的距离有函数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.10.2nm，纵向可达0.001nm。显微操作技术n 显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，图 4.细胞的基本结构4.1细胞的基本结构n细胞壁的结构n细胞膜的结构 细胞膜具有极性头部和非极性尾部的磷脂分子；蛋白分子以不同的方式镶嵌在脂双分子中或结合在其表面n
7、细胞核的结构 4.2细胞器n核糖体与内质网细胞中的蛋白质都是在核糖体上合成的，并起始于细胞基质内质网是除核酸外的一系列重要的生物大分子如蛋白质、脂类和糖类合成的基地蛋白质的修饰与加工、新生多肽的折叠与组装都是在内质网中进行的n高尔基体高尔基体主要是将内质网合成的多种蛋白进行加工、分类与包装，然后分别运送到细胞的特定部位或分泌到细胞外n叶绿体n原核细胞与真核细胞的比较两个或多个细胞互相接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、遗传物质重组的过程细胞是生命活动的基本单位细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进行，图吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而
8、出现负染效果，分辨力可达1.然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；病毒（多发性黏液瘤病毒、流感病毒）当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻。电子显微镜和超薄切片机它可以分化生成所有类型的血细胞（淋巴
9、细胞、髓系细胞和血小板）第二节 细胞的基本概念蛋白分子以不同的方式镶嵌在脂双分子中或结合在其表面电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。荧光显微镜及其观察效果（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）许多癌细胞具有变形运动能力，并且能产生酶类，使血管基底层和结缔组织穿孔，使它向其它组织迁移（图）原生质体的制备包括取材与除菌、酶解、分离、鉴定5个步骤细胞是构成有机体的基本单位5.细胞工程的基本操作5.1 无菌操作技术n细胞工程的所有试验都要求在无菌条件下进行，图5.2细胞培养技术n细胞培养首先要取材除菌，然后根据不同细胞的特点配制培养基并对其进行灭菌处理，最
10、后接种培养5.3细胞融合技术n两个或多个细胞互相接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、遗传物质重组的过程6 植物细胞工程6.1 植物组织的培养预备阶段n选择合适的外植体 外植体只能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段n去除病原菌及杂菌n配制适宜的培养基诱导去分化阶段n使植物去分化的主要方法是通过在培养基中添加较高浓度的生长素类激素使植物重新处于旺盛的有丝分裂状态继代增殖阶段生根发芽阶段移栽成活阶段n植物组织培养过程n转基因植物培育过程6.2 植物细胞原生质体的制备与融合原生质体的制备n植物细胞原生质体是指那些已去除全部细胞壁的细胞n原生质体的制备包括取材与除菌、酶解、分离、鉴定5个步骤原
11、生质体的融合n原生质体融合通常采用化学法诱导融合、物理法诱导融合杂合体的鉴别与筛选7 动物细胞的培养7.1 细胞培养法n动物细胞培养的方法通常是，图n绝大多数哺乳动物的细胞趋向于贴壁生长，且细胞具有接触抑制作用，因此培养大量细胞时需要较大的支持面，其中的方法有微导管培养法、微载体培养法、微胶囊培养法7.2 组织培养法动物细胞培养常用仪器7.3 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术抗原抗体反应n当某些外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质），即抗原，进入动物体内后会刺激后者产生相应的抗体，引起免疫应答，从而将前者清除或分解n哺乳动物主要有两类淋巴细胞：T细胞和B细胞，后者可以分泌抗体。由于环境复杂，
12、大量抗原诱使B淋巴细胞产生大量抗体，所以如果想获得大量专一性抗体就要从某个特定B淋巴细胞培养出大量的细胞群体，即克隆。由于其遗传的高度一致性，由它们分泌的抗体称为单克隆抗体nB淋巴细胞不能在体外无限的分裂，所以抗体的产生受到很大的限制，但是肿瘤细胞可以无限增殖，因此科学家想到将两者进行细胞融合从而产生大量抗体n单克隆抗体基本原理7.4 其他的与细胞有关的生命体病毒（多发性黏液瘤病毒、流感病毒）类病毒朊病毒8 干细胞技术8.1干细胞的定义及分类n干细胞（未分化细胞)：具有自我更新和分化发育潜能的原始细胞 n干细胞能在未分化状态下通过细胞分裂的方式进行长期繁殖延续；在特定生理条件下能诱导分化成具有
13、特定功能的分化细胞n干细胞分为：胚胎干细胞（多能干细胞）组织干细胞（专能干细胞）8.2 造血干细胞造血干细胞的特点n造血干细胞具有高度的自我更新能力能力；它可以分化生成所有类型的血细胞（淋巴细胞、髓系细胞和血小板）造血干细胞的分化过程n造血干细胞的分裂方式为不对称分裂不对称分裂，分裂后，其中一个保持造血干细胞的一切特征，另一个则分化为早期的造血祖细胞造血干细胞的临床应用n造血干细胞的移植造血干细胞与基因治疗n选择造血干细胞作为靶细胞造血干细胞的可塑性n造血干细胞不但可以分化成血细胞，在不同的环境中，由于受到相应的细胞分化信号调节，其还可以分化为肌肉细胞、肝脏细胞、神经细胞，血管内皮细胞等9 胚
14、胎干细胞9.1胚胎干细胞的起源n胚胎干细胞由“囊胚腔”内一侧的细胞群发育而成9.2 胚胎干细胞的培养n人类胚胎干细胞可以来自捐献，也可以从59周流产的胎儿体内提取9.3 胚胎干细胞早期应用n动物克隆n胚胎干细胞的应用（人体细胞培养）10 癌细胞10.1 癌细胞的主要特征n癌细胞有三个显著的基本特征即：不死性，迁移性和失去接触抑制癌细胞的不死性n肿瘤组织的细胞周期失控，不受正常生长调控系统的控制，能持续的分裂与增殖代谢旺盛，DNA和RNA聚合酶活性均高于正常组织，核酸分解过程明显降低，DNA和RNA的含量均明显增高n蛋白质合成及分解代谢都增强，但合成代谢超过分解代谢，甚至可夺取正常组织的蛋白质分
15、解产物，结果可使机体处于严重消耗的恶病质（cachexia）状态。癌细胞的迁移性n细胞粘着和连接相关的成分发生变异或缺失，细胞失去与细胞间和细胞外基质间的联结，易于从肿瘤上脱落。许多癌细胞具有变形运动能力，并且能产生酶类，使血管基底层和结缔组织穿孔，使它向其它组织迁移（图）接触抑制丧失 n正常细胞在体外培养时表现为贴壁生长和汇合成单层后停止生长的特点，即接触抑制现象，而肿瘤细胞即使堆积成群，仍然可以生长（图）另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一当某些外源生物（细菌等）或生物大分子（蛋白质），
16、即抗原，进入动物体内后会刺激后者产生相应的抗体，引起免疫应答，从而将前者清除或分解电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。原生质体的制备包括取材与除菌、酶解、分离、鉴定5个步骤蓝藻含有叶绿素a，细菌有菌色素所有细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜第二节 细胞的基本概念负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；细胞培养首先要取材除菌，然后根据不同细胞的特点配制培养基并对其进行灭菌处理，最后接种培养2 植物细胞原生质体的制备与融合负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；原核细
17、胞与真核细胞的比较第二节 细胞的基本概念肿瘤的形成与原癌基因和抑癌基因的突变有关在特定生理条件下能诱导分化成具有特定功能的分化细胞蓝藻含有叶绿素a，细菌有菌色素然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构，图在特定生理条件下能诱导分化成具有特定功能的分化细胞10.2 癌细胞形成的原因癌细胞形成的内因n肿瘤的形成与原癌基因和抑癌基因的突变有关原癌基因 n原癌基因(onco
18、gene)是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必须的。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤抑癌基因n抑癌基因也称为抗癌基因，其产物是抑制细胞增殖，促进细胞分化和抑制细胞迁移，抑癌基因的突变是隐性的 n散发性和遗传性Rb功能丧失的机理，图原癌基因的激活n原癌基因的激活方式多种多样，概括起来有：基因本身或其调控区发生了变异，导致基因的过表达，或产物蛋白活性增强，使细胞过度增殖，形成肿瘤，图肿瘤形成的外因n化学致癌物n生物因素n物理致癌普通光学显微镜荧光显微镜及其观察效果（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）激光共聚焦扫描显微镜（蓝色为
19、细胞核，绿色为微管）微分干涉差显微镜效果（硅藻）电子显微镜和超薄切片机将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜。所有细胞都有两种核酸：DNA和RNA散发性和遗传性Rb功能丧失的机理，图蓝藻含有叶绿素a，细菌有菌色素原癌基因的激活方式多种多样，概括起来有：基因本身或其调控区发生了变异，导致基因的过表达，或产物蛋白活性增强，使细胞过度增殖，形成肿瘤，图激光共聚焦扫描显微镜（蓝色为细胞核，绿色为微管）将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。荧光显微镜及其观察效果（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）病毒（多发性黏液瘤病毒、
20、流感病毒）2 植物细胞原生质体的制备与融合另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。干细胞能在未分化状态下通过细胞分裂的方式进行长期繁殖延续；细菌具有裸露的质粒DNA所有细胞增殖都以一分为二的方式进行分裂显微操作技术是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。冰冻蚀刻又称冰冻断裂。荧光显微镜及其观察效果（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）内质网透射电镜图（伪彩色）肌动蛋白纤维的负染电镜照片 冰冻蚀刻电镜照片 扫描电镜和类血细胞照片 尼康NT-88NE显微操作/注射仪 特征原核细胞真核细胞细胞膜有（多功能）有核膜无有染色体由一个环状DNA分子构成的单个染色体，DNA不与或很少与蛋白质结合2个染色体以上，染色体由线状DNA与蛋白质组成核仁无有线粒体无有内质网无有高尔基体无有溶酶体无有核糖体70S80S光合作用蓝藻含有叶绿素a，细菌有菌色素叶绿素a、b核外DNA细菌具有裸露的质粒DNA线粒体DNA、叶绿体DNA细胞骨架无有植物愈伤组织
