1、第四章酶活力第四章酶活力(hul)的测定的测定第一页，共21页。第四章第四章 酶活力酶活力(hul)(hul)的测定的测定第一节 酶的结构(jigu)与性质(略)第二节 酶活力测定方法第二页，共21页。第二节第二节 酶活力酶活力(hul)(hul)测定方测定方法法一、酶活力(hul)二、酶活力(hul)的测定第三页，共21页。一、酶活力一、酶活力(hul)(hul)l 酶活力(hul)是指酶催化某一化学反应的能力，酶活力(hul)的大小可以用在一定条件下所催化的某一化学反应的反应速率来表示，两者呈线性关系。酶反应速率越大，酶活力(hul)越高，反之越低。l 酶催化的反应速率可用单位时间内底物的
2、减少量或产物的增加量来表示。在实际酶活性测定中一般以测定产物的增加量为准。l 酶活力(hul)的测定就是测定酶促反应的初速率。1.概念概念(ginin)第四页，共21页。一、酶活力一、酶活力(hul)(hul)l 酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示,即酶单位(activity unit，U)。l 酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物(chnw)所需的酶量。这样酶的含量就可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，即“U/g”或“U/mL”。l 世界各地实际应用的酶活力单位的定义各不相同。同一种酶往往有几种不同的单位。l 例如，1IUlmol/min；
3、1Kat=1mol/s 2.酶活力酶活力(hul)单位单位第五页，共21页。一、酶活力一、酶活力(hul)(hul)l 酶活力的测定要在最适条件下进行，即最适温度、最适pH、最适底物浓度和最适缓冲液离子强度等，只有在最适条件下测定才能真实反映酶活力大小。l 测定酶活力大小时，通常要求底物浓度足够大，测定底物浓度的变化在起始浓度的5以内的速率，这样可以保证所测定的速率是最初(zuch)速率。此结果能比较可靠地反映酶的含量。第六页，共21页。一、酶活力一、酶活力(hul)(hul)3.酶的比活力酶的比活力(hul)l 酶的比活力代表酶的纯度，通常用下式表示：l 酶比活力=酶活力单位数(U)/蛋白质
4、量(mg)l 有时也采用每克(g)酶制剂或每毫升(mL)酶制剂含有多少个活力单位来表示。l 比活力的大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。比活力是酶学研究及生产(shngchn)中经常使用的指标。第七页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定1.酶活力的测定酶活力的测定(cdng)步骤步骤要求要求(yoqi)酶活力的测定方法：快速、简便、准酶活力的测定方法：快速、简便、准确。确。l 酶活力测定均包括两个阶段：首先要在一定的条件下，酶与其作用底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。第八页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定酶
5、活力酶活力的测定的测定(cdng)步骤步骤 底物底物(d w)(d w)反应条件反应条件 反应时间反应时间 底物或产物底物或产物变化量变化量第九页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定底物：根据酶的专一性，选择底物：根据酶的专一性，选择(xunz)(xunz)适宜的底物，并适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，配制成一定浓度的底物溶液。要求所使用的底物均匀一致，达到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可达到一定的纯度。有些底物溶液要求新鲜配制，有些则可预先配制后置冰箱保存备用。预先配制后置冰箱保存备用。反应条件：据资料或试验结果，确
6、定酶促反应的温度、反应条件：据资料或试验结果，确定酶促反应的温度、pH等条件。温度可选在室温等条件。温度可选在室温(25)、体温、体温(37)、酶促反、酶促反应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进行。应最适温度或其他选用的温度，一般在恒温装置内进行。pH应是酶促反应的最适应是酶促反应的最适pH，采用一定浓度和一定，采用一定浓度和一定pH的缓的缓冲溶液来保持。反应条件一经冲溶液来保持。反应条件一经(yjng)确定，在反应过程中确定，在反应过程中应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其他条应尽量保持恒定不变。有些酶促反应要求激活剂等其他条件，应适量添加。件，应适量添加。第十页，共21
7、页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的反底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的反应液，运用应液，运用(ynyng)各种生化检测技术，测定产物增加量各种生化检测技术，测定产物增加量或底物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽或底物的减少量。为了准确地反应酶促反应的结果，应尽量采用快速、简便、准确的方法测出结果。量采用快速、简便、准确的方法测出结果。反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶反应时间：在一定条件下，将一定量的酶液与底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。反应到一定时液混合均匀，适时记下反应开始的时间
8、。反应到一定时间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、间及时终止反应。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。常用(chn yn)：加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、：加热、添加酶变性剂、加入酸液或碱液、冰浴等。冰浴等。第十一页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定2.酶活力酶活力(hul)的测定的测定方法方法l 测定反应液中物质的变化量，可采用光学检测法、化学检测法等生化检测技术。l 一种酶可能有多种测定方法，要根据(gnj)实际情况选用。第十二页，共21页。二、酶活力
9、二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定1.分光(fn un)光度法2.荧光法酶酶 活活 力力 的的 测测 定定 方方 法法3.同位素测定法4.电化学方法(fngf)5.其他方法第十三页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定1.分光(fn un)光度法l 分光光度法主要(zhyo)利用底物和产物在紫外光或可见光部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。其优点是简便、节省时间和样品，可检测到nmol/L水平的变化。该方法可以连续地读出反应过程中光吸收的变化，已成为酶活力测定中一种重要的方法之一。几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。第十四页
10、，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定l 由于分光光度法有其独特的优点，因此可以把一些原来没有光吸收变化的酶反应通过与一些能引起光吸收变化的酶反应偶联，使第一个酶反应的产物转变成为第二个酶的具有(jyu)光吸收变化的产物来进行测量。这种方法称为酶偶联测定法。第十五页，共21页。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。终止酶促反应的方法要根据酶的特性、反应底物或产物的性质以及检测方法等加以选择。概念(ginin)酶单位的定义：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物(chnw)所需的酶量。二、酶活力(hul)的测定分光(fn
11、 un)光度法几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。底物或产物的变化量：反应到一定时间，取出适量的反应液，运用(ynyng)各种生化检测技术，测定产物增加量或底物的减少量。确定酶促反应条件：pH、温度等几乎所有的氧化还原酶都可以用此法测定。辐射猝灭会引起(ynq)测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。如葡萄糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定(cdng)。酶 活 力 的 测 定 方 法分光光度法主要(zhyo)利用底物和产物在紫外光或可见光部分的光吸收度的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。二、酶活力(hul)的测定反应条件一经(yjng)确定，在反应过程中应尽
12、量保持恒定不变。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定2.荧光法l 荧光法主要是根据底物或产物荧光性质的差别来进行测定。由于荧光方法的灵敏度往往比分光光度法要高若干个数量级，而且荧光强度和激光的光源有关，因此在酶学研究中越来越多地被采用，特别是一些(yxi)快速反应的测定方法。l 该法缺点：易受其他物质干扰，有些物质如蛋白质能吸收和发射荧光，这种干扰在紫外区尤为显著，故用荧光法测定酶活力时，应尽可能选择可见光范围的荧光进行测定。第十六页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定3.同位素测定法l 用带有放射性同位素标记的底物经酶作用后得到(d do)产物，通
13、过适当的分离，测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位。l 已知六大类酶几乎都可以用此方法测定。l 通常用于底物标记的同位素有3H、14C、32P、35S和131I等。第十七页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定l 优点：反应灵敏度极高，可直接用于酶活力的测定，也可用于体内酶活性测定。特别是适用于低浓度的酶和底物的测定。l 缺点：操作繁琐，样品需分离，反应过程无法连续跟踪，且同位素对人体有损伤作用。辐射猝灭会引起(ynq)测定误差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。第十八页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定4.电化学方法(fngf)l
14、 电化学方法包括：pH测定法和离子选择电极法等。l pH测定法最常用(chn yn)的是玻璃电极，配合一高灵敏度的pH计，跟踪反应过程中H+变化的情况，用pH的变化来测定酶的反应速率。也可以用恒定pH测定法，在酶反应过程中，所引起的H+的变化用不断加入碱或酸来保持其pH恒定，用加入的碱或酸的速率来表示反应速率。用此法可以测定许多酯酶的活力。第十九页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定l 在使用离子选择电极法测定(cdng)某些酶的酶活力时,用氧电极可以测定(cdng)一些耗氧的酶反应。如葡萄糖氧化酶的活力就可用这个方法很方便地测定(cdng)。第二十页，共21页。二、酶活力二、酶活力(hul)(hul)的测定的测定5.其他(qt)方法l 除上述方法外，还有一些测定酶活力的方法，例如旋光法、量气法、量热法和层析法等，但这些方法使用(shyng)范围有限，灵敏度较差,只是应用于个别酶活力的测定。第二十一页，共21页。
