1、第五章质谱法测定分子结构二大分子2优选第五章质谱法测定分子结构二大分子 合成高分子是混合物，分子量是一种分布。不同的引发和终止反应所得的高分子有不同的端基。在随机共聚物中，高分子链的组成呈现某种化学分布。在嵌段共聚物中存在着不同的嵌段长度和顺序。非线性高分子，如环状、支链和树枝状高聚物。样品用量少、耗时短、速度快。仪器分辨率高使单体分析和端基分析成为可能。直接测定绝对分子量，而不是相对分子量，精度高于光散射和膜渗透方法。测定分子量时，不需要标准品或Mark-Houwink常数。由分子量分布可获得聚合反应的链增长常数。基质的作用：从激光脉冲中吸收能量。要求：基质对激光光源必须有很强的吸收。使被测
2、分子分离成单分子状态。要求：基质和被测高分子具有很好的相容性，同时不能有强的分于间的相互作用。使用不同种类的激光(IR，UV)电离，需要用不同类型的基质。紫外激光解离的基质 蒽三酚和银盐的混合是分析聚苯乙烯的首选，但是这个混合物不稳定，见表格。红外激光解离的基质 YAG激光(3.27m，相当于 3050 cm-1)激发C-H的伸缩振动。应用于UV-MALDI的基质也可用于IR-MALDI。Matrices PolymersHydrophilic2,5-dihydroxybenzoic acidPolypropylene glycol-Cyano-hydroxycinnamic acidPoly
3、vinyl acetateFerulic acid Polytetramethylene glycolIndoleacrylic acidPolymethylmethacrylateDithranolPolystyreneall trans-Retinoic acidPolybutadieneDiphenylbutadienePolydimethylsiloxaneHydrophobic红外激光与紫外激光电离的比较：红外激光有较强的穿透能力，一次红外激光照射能够解吸更多的样品，因此在一个样品点上获得的质谱图较少，要经常更换激光照射点。红外激光的脉冲较长。一般在 1020 s，而通常的紫外激光的
4、脉冲约在 35 s，这导致了IR-MALDI的分辨率较差。一般来讲，紫外激光器更适于分析合成高分子，红外激光器可用于一些卤代高分予的分析。基质的选取：极性相似原则！常见基质的极性比较基质Mr/cm-1(at 337nm)PA(kJ/mol)2,5-DHB1540.79105-841866854 14854 16-CHCA1890.79 105-841933 9766 8芥子酸(SA)2241.10 105-887894 13蒽三酚226-874 8IAA187-900 16HABA242-943766 8 高分子测定过程中的阳离子化不是质子转移反应，而是金属离子与高分子发生阳离子化反应，形成加
5、合的高分子正离子。一般用Na+、K+等作为加合离子。有时不需要特别加入这些金属，亦可以得到加合的正离子，这是由于容器上的Na+或K+所致。具有杂原子的合成高分子，在加钠盐、钾盐后产生加合金属阳离子的正离子。聚醚、聚酯、聚丙烯酸酯、聚酷胺等。没有杂原子的非极性合成高分子，如聚苯乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯在加入银盐或铜盐后能够成功的离子化，这些金属阳离于与高分子中的双键发生了作用。没有杂原子和双键的合成高分子如聚乙烯和聚丙烯目前仍较难被MAIDI分析，因为它们的金属阳离子结合能极低。简单混合法：在使用一个特定的样品制备方法时，必须先选择适用于基质、样品和阳离子化盐的溶剂，最理想的情况是使用一种溶剂
6、这样可以减少样品在靶上结晶时分层的危险。然而，盐类几乎不溶于用于非极性合成高分子的有机溶剂。一般来讲，盐可以先溶于一个中间溶剂如丙醇中，然后再用用于基质和样品的溶剂稀释。制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。电喷雾法 一个很有前途的样品制备方法是电喷雾沉积法，比起传统的干点甚或薄层法，电喷雾法的优点在于它可以形成小而均匀的结晶体。电喷雾沉积法制得样品的点点之间重复性好，并且信号强度较大，层式的电喷雾效果更好一些。压片法 对于不溶的高分子样品，如聚氨酯和大的多环芳香化台物，发展了一砷新的制样方法压片法即将样品和基质按一定比例混合后用球磨机研磨均匀，压成薄片进行MAL
7、DI-TOF-MS分析。计算公式：nwiiiiwiiinMMPDMnMnMnMnM/2 当分子量的分散度小于1.2时可获得符合Poisson分布的质谱图，与GPC的结果一致。Mn：数均分子量Mw：重均分子量PD：分布常数ni：第i个寡聚物的相对丰度Mi：第i个寡聚物的质量PS 2800的MALDI-TOF质谱图PEG 2000的MALDI-TOF质谱图PEG 3100的MALDI-TOF质谱图PS 29ku 的MALDI-TOF质谱图聚合物数均分子量Mn重均分子量Mw分子量分布PD测定方法PS4600046760473191.01MALDI-TOF42000435001.03GPCPS7000
8、073914745181.01MALDI-TOF66000675001.03GPCPEG1260012426124921.01MALDI-TOF11843123201.04GPCPEG23020022115221051.01MALDI-TOF20240212281.06GPCMALDI-TOF-MS方法与GPC方法所测分予量的比较SSNNC10H21C10H21nSNNRnR=C6H13 C8H17 C10H21123 含有联吡啶 的共轭高分子结构 聚合物的MALDI-TOF质谱(a)IAA为基质,(b)IAA为基质。并加入细AgTFA高分子化合物3(n=5)，环状寡聚物的实验结果(左)和理论
9、同位素分布(右)(a):(C28H32N2S)5+H+(b):(C28H32N2S)5+Ag+选取2142.1u的单同位素峰来计算端基的质量。重复单元的质量是428.2,代入2142.1/428.25，即428.2 52141。这个峰的质荷比等于5个重复单元加1个质子比时带上的氢原子的质量，因此可以椎测这个系列的高分子为环状高分子没有端基。NNNOC2H5NClNOC2H5NNNHHClnNNNOC2H5NClNOC2H5NNNHHOHnNNNOC2H5NHONOC2H5NNNHHOHnNNNOC2H5ClClH2NNH235u+158u+H+237u 6=1616u35u+140u+H+23
10、7u 6=1598u17u+140u+H+237u 6=1580un=6q一种寡聚物的MALDI-TOF质谱分析 两种单体：三嗪聚胺的MALDI-TOF的质谱 用MALDI分析不同种类的高分子混合物的文章很少也许是因为离子化效率的显著不同和其他一些歧视固素。例如二两种窄分布的标准品PS10200和和PMMA9200分别溶解在THF中，以几种体积比混合，接着以IAA为基质加甲酸钠或以蒽三酚为基质加三氟乙酸银。在第一套实验方案中，PS和PMMA的体积比从0:1增加到199:1，基质是IAA/Na，也就是对PMMA是最佳条件，试验结果十分令入惊奇，甚至PMMA是以0 5的不纯物存在干PS中，质谱图仍
11、然是PMMA的MNa+峰为主要峰。在第二套实验中，PS和PMMA的体积比从1:0到1:9，基质是蒽三酚/Ag也就是PS的最优化条件。在所有混合物实验中，PMMA是主要离子，而PS仅以相对干PMMA为10%的峰出现，质谱图上主要是PMMA的峰。当然，这种有利于PMMA的歧视效应也许可以用来检测PS中中痕量的PMMA但是从这些结果中也可看出，用MALDI分析高分子混合物还要走很远的一段路。嵌段共聚物之中嵌段和组成分布对于聚合物的最终性能有重要的影响。MALDI-TOF-MS也可以成功地应用于嵌段型高分子的研究。Dams等人用MALDI分析了-甲基苯乙烯和乙烯基吡啶的嵌段共聚物。Wilezek-Ve
12、ra等MALDI-TOF MS与1H NMR相结合，对苯乙烯/-甲基苯乙烯嵌段共聚物进行研究，测定了该共果物的组成分布和嵌段长度，我们研究组研究了荣乙二醇和聚苯乙烯的嵌段共聚物。用MALDI/TOF测得的分子量和以GPC测定的结果参见表。从表中可以青出，对干这类窄分布的高分子化合物，MALDI/TOF所得结果与GPC法所得结果比较接近。但是MALDI/TOF法更加迅速、方便，具有显著的优越性MnMwPD共聚物GPC357737561.05No.1MALDI/TOF320735601.11共聚物GPC571963481.11No.1MALDI/TOF614265281.06GPC法和 MALD/
13、TOF MS法测得的分子量比较C端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解三、MALDI-TOF方法测定高聚物的应用蛋白质序列研究的三个层次红外激光与紫外激光电离的比较：-Cyano-hydroxycinnamic acid搜索引擎不够完善成熟。Beta 牛乳糖 m/z 841.Program used代谢物是有效的还是有害的?蛋白质序列研究的三个层次一般用Na+、K+等作为加合离子。Polymers一、质谱方法分析高聚物的特点质谱测量在蛋白质组学中的作用制备样品时，应选择适当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。多光子电离(IR-10.高分子化合物3(n=5)，环状寡聚物的实验结果(左)
14、和理论同位素分布(右)GATTCGTAGCTACGAATC结合正常人肝组织的蛋白组图谱，可寻找到差异蛋白。Hydrophobic5.2 药物的质谱分析药物的质谱分析各种提取物的分析，HPLC/MS联用分析Methanolic 根部提取物024681012141618202224262830Time(min)0102030405060708090100Relative Abundance11.9411.088.703.172.0718.0213.4618.5414.0718.8316.9219.0015.1319.421.60 水-甲醇梯度 0.25 mL/min,C-18 Column 20
15、uL 进样LC-UV(215 nm)LC-MS,基峰离子流图2468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance9.494.814.5817.8811.896.7219.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.8720.026.257.975.093.5421.421.07UnknowOOOHOHOOHOHOHOH 水-甲醇梯度 0.25 mL/min,C-18 Column 20 uL 进样300350400450500550600m
16、/z58010203040501000102030405060708090Relative Abundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61 AV:8 NL:1.28E6AV:4 NL:7.42E5?OOOHOHOOHOHOHOH(M-H)(M-H)负离子ESI全扫描质谱图(Full Scan MS)+14 u120140160180200220240260280300320m/z1000102030405060708090480510152025303540Relative Abundance293.1149.2311.9219
17、.1180.5169.0294.2327.9121.1195.3144.9211.7275.2225.8164.0255.9244.5281.5324.9293.3193.3325.8219.2294.3308.3131.5200.5159.9276.1265.4233.3334.5246.5155.0285.1m/z 293310.9OOOHOHOOHOHOHOHNegative Ion ESI Data Dependant MS/MS Spectra +14 um/z 179300350400450500550600m/z5801020304050100010203040506070809
18、0Relative Abundance473.1493.7460.8386.5300.2487.1400.3RT:9.21-9.61 AV:8 NL:1.28E6RT:11.78-11.94 AV:4 NL:7.42E5OOOHOHOOHOHOHOHOOOHOHOOHOHOHOH(M-H)(M-H)Proposed Echinacoside Structure at m/z 487增加一个亚甲基RT:0.11-21.822468101214161820Time(min)05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance9.49
19、4.814.5817.8811.896.7211.3919.0819.553.1617.0114.3913.692.1415.408.1010.876.257.975.093.5421.421.07OOOHOHOOHOHOHOHOOOHOHOOHOHOHOHProposed EchinacosidesConfirmed Echinacoside大脑促眠素的发现与确证 从猫脑袋中取出脑髓液，用液相色谱分离各组分，用电喷雾串联质谱、气质联用、薄层层析、红外及核磁确定各组分的化学结构，目的目的是找出与睡眠规律有关的物质。在猫睡眠周期的不同时间点采取脑髓液样品，测定各样品的紫外吸收光谱，发现猫在处于即
20、将入睡状态时，脑髓液试样有一个特别显著的紫外吸收峰。电喷雾四极杆串联质谱分析各样品的色谱峰中有显著差异的组分，发现m/z282的离子。并证明是MH+离子，用快原子轰击磁质谱测得其分子式为C18H35NO。CID实验：m/z282的MS2和MS3。在低质量范围，m/z282的子离子谱显示长链烷烃的特征。质量数为17和35的中性丢失是母离子m/z282电离产生子离子m/z265，m/z247时产生的。在以上质谱分析的基础上，综合其它分析手段的表征结果，初步推测出这种催眠素的结构为 顺-9,10-十八碳烯酰胺。该化合物的合成和结构表征证实这一结构推测是正确的。大脑促眠素的MS/MS质谱确定大脑促眠素
21、的化学结构脑髓液中分离出的促眠素化学结构 结构分析：确定代谢途径，微量条件下进行。定量分析：确定生物利用度等，在复杂本底的条件下测定。OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHparentq 例：一种非胰岛素依赖型糖尿病药物的代谢分析(LC/MS/MS技术24681012141618202224Time(min)050100Relative Abundance23.878.7210.6511.8913.0116.7910 x100150200250300350400450500550m/z0102030405060708090100Relative Abundance5105122221992
22、79241123391532176399369150200250300350400450500m/z0102030405060708090100Relative Abundance369371395352492m/z 510 MS2质谱测量在蛋白质组学中的作用HPLC-MS、MS/MSPS 29ku 的MALDI-TOF质谱图左上角标表示，环中两根断裂键所连碳原子的编号(从环上氧原子开始计数，红色数字)，右下角的数字表示残基的序号。T:-p Full ms 450.c和z类型碎片增强。强极性，分离难，HPLC峰形不好。使被测分子分离成单分子状态。样品用量少、耗时短、速度快。制备样品时，应选择适
23、当的溶剂、合适的浓度及配比，才能获得较好的结果。On-line LC-MSn中能碰撞：1001000V，扇形电场磁场/TOF联用质谱(特制质谱)。谷氨酸(glutamic acid,Glu/E)纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性的限制，灵敏度显著升高。4(双电荷离子)的MS/MS谱图Carbamidomethylation(Cys-CAM)各种提取物的分析，HPLC/MS联用分析碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。27m，相当于 3050 cm-1)激发C-H的伸缩振动。代谢物是有效的还是有害的?Monoisotopic100120140160180200220240260280300320340
24、360m/z0102030405060708090100Relative Abundance169171304306288m/z 510 m/z 369 MS3m/z 369OCH3NHClOSNH2OOH+m/z 395OCH3NHClOSNHOOO+m/z 352OCH3NHClOSOO+m/z 304OCH3NHClONH2+m/z 288OCH3NHClO+m/z 169OOCH3Cl+m/z 510OCH3NHClOSNHNHOOOH+OHm/z 492+OCH3NHClOSNHNHOOOHMS1MS2MS3 远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位置，与质谱解析一章中裂解均与电荷或自由基
25、有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离MS/MS质谱。高能碰撞：210kV，磁质谱仪上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。中能碰撞：1001000V，扇形电场磁场/TOF联用质谱(特制质谱)。长链饱和化合物 1,4氢消除反应(1)两步均裂反应 (2)产生荷基异位离子 末端不饱和离子 长链不饱和化合物(a)近烯丙基键，记作Ap断裂，Proximal allyl bond。远烯丙基-乙烯基键 distal allylvin
26、yl bond,Avd近烯丙基-乙烯基键，记作Avp断裂，proximal allylvinyl bond。X=O+或 OLi2+。13-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的远电荷碎裂谱图十八烷酸CID-MIKES谱图，M-Ht2Li+(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z 293 (B)6,9-二烯十八烷酸 m/z 293高能碰撞,6kV给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。长链脂肪酸M-H+离子的ES-MS/MS 谱图(a)硬脂酸，m/z 283;(b)油酸,m/z 281;(c)亚油酸,m/z 279.谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。中能
27、碰撞，400eV特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。低能CID谱，M-Ht2Li+，(4,7,10,13,16,19)-六烯二十二烷酸(docosahexaenoic acid,m/z341)。低能碰撞，400eV信息较少，特殊情况使用。5.3 糖类的质谱分析糖类的质谱分析 糖：生命体的能源供给者，传统的认识。糖的生物活性：与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物”(glycoconjugate)，血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和新陈代谢平衡。寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，中药应用，生物
28、多糖，保健药物，保健品。糖结构的复杂性：单糖的组成为CnH2nOn(n=39)，其中n=5和6最为常见。每个单糖有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，连接的位置和构型多种多样。糖类分析的困难性：强极性，分离难，HPLC峰形不好。连接方式复杂，立体化学复杂。同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。电离效率不高、种类有限。16种单糖的常见结构1,核糖-D-呋喃核糖Rib2,阿戊糖-L-吡喃阿戊糖Ara3,戊醛糖-D-呋喃戊醛糖Xyl4,葡萄糖-D-吡喃葡萄糖Glc5,甘露糖-D-吡喃甘露糖
29、Man6,半乳糖-D-吡喃半乳糖Gal7,海藻糖L-吡喃海藻糖Fuc8,乙酰氨基葡萄糖N-乙酰基-(-D-吡喃葡萄糖酰胺)GlcNAc9,葡萄糖醛酸GlcA10,鼠李糖L-吡喃鼠李糖Rha11,乙酰神经氨糖酸NeuNAc12,胞壁酸2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脱氧-D-葡萄糖 Mur14,鸡纳糖6-脱氧-D-葡萄糖15,泰威糖Tyv16,D-果糖Fru一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征 触角 核心区 强极性，分离难，HPLC峰形不好。And there are still peptides unassigned to a proteinNumber of peptide used
30、in search多电荷峰转化成单电荷峰ESI：对于常规的ESI，天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。在实际生物体中，非同寻常的酶活性X=O+或 OLi2+。20种氨基酸残基（NH-HCR-C=O）和羟胺正离子的质量仪器鉴定率选取2142.非还原端用A,B,C表示。传统的低能量CADMS/MS 质谱图马心肌红蛋白胰酶酶切产物的ESI-Q-TOF肽指纹谱Number of missed cleavages重复单元的质量是428.Diphenylbutadiene质谱测量在蛋白质组学中的作用 在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。电离方式：FAB：
31、传统的电离方法，主要集中于低聚寡糖的分析。ESI：对于常规的ESI，天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制了ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。MALDI：低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定性，MALDI电离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可以用源后解离(PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。多糖碎片代号表示法非还原端用A,B,C表示。还原端用X,Y,Z表示。
32、左上角标表示，环中两根断裂键所连碳原子的编号(从环上氧原子开始计数，红色数字)，右下角的数字表示残基的序号。Z0Y0Z1Y1Z2Y2B1C1B2C2B3C3A10,2X11,5HOCH2ROOOHOHCH2OHOOOHOHOHCH2OHOOHOHO 还原端 非还原端123450OOOOHOHOOHHOOHOHOH+.OOHOHOOH.OHOOHOHOHO+Low activationbarrierOOOOOHOOHHOOHOHOM+.HOOOOOHOOHHOOHOHOM+.HHigh activationbarrierX-+HOOHOHOHOOOOHOHOHOHHOOHOHOHOOOHOHOH
33、HOHHOH+M+Cross-ringcleavage(c)HOOHOHOHOOOOHOHOHOH+M+HOOHOHOHOOHOOHOHOHOHOM+(a)Metal ion lossGlycosidic-bondcleavage(b)M+5.4 核苷酸核苷酸(Oligonucleotide)的质谱分析的质谱分析500600700800900100011001200m/z05101520253035404550556065707580859095100Relative Abundance919.1915.41098.61102.9787.81107.3922.5784.5686.1790.68
34、17.11147.9689.1851.6691.7956.7609.91070.71064.7905.3768.7617.31153.71061.7720.3959.3664.8901.71174.31040.0590.0549.1522.1 进样速度：3 uL/min 乙腈-甲醇-丙酮(70:20:10,v/v/v,5%TEA)毛细管温度:100 COLIGO22#209-213 RT:1.96-1.99 AV:5 NL:1.49E5T:-p Full ms 450.00-1200.00OLIGO22#217-225RT:2.03-2.09AV:8NL:1.63E5T:-p Full ms
35、450.00-1200.00650700750800850900950100010501100m/z0102030405060708090100Relative Abundance1102.91098.6918.8915.4787.5784.5689.3686.4611.2-5-6-7-8#1 RT:0.00P:-NL:3.85E5T:-p Full ms 450.00-1200.0048005000520054005600580060006200mass0102030405060708090100Relative Abundance5520.05498.05541.05565.05745.0
36、4788.05972.05579.05385.05017.05221.04908.05116.06086.05762.06206.04821.0Reported Avg.Mol.Wt:5500Monoisotopic Mass:5497.7OLIGO22#435-444 RT:4.86-4.98 AV:10 NL:1.29E5T:-c Full ms2 1098.0035.00 305.00-2000.00400600800100012001400160018002000m/z020406080100Relative Abundance926.81071.51134.41068.51236.0
37、817.91290.81167.9782.6610.11009.91347.11636.1850.3617.71388.0770.21480.01637.0481.21854.3506.1426.11997.7OLIGO22#495-507 RT:5.62-5.79 AV:13 NL:2.65E5T:-c Full ms2 784.0035.00 215.00-2000.00400600800100012001400160018002000m/z020406080100Relative Abundance765.3886.7875.8617.8923.21134.3610.3860.1673.
38、61014.81135.1461.51347.1549.31636.11235.1426.21413.1 1485.3306.31782.0 1880.25.5 蛋白质分析蛋白质分析小肽断裂碎片离子定义研究小肽的结构：MS/MS分析q例：一个五肽的分析 具有保护基的五肽的一级结构：BOCGlyAlaDValLeuIleOBz BOC=t-Butyloxy carbony,Bzl=benzyl.离子类型MH+MH-56+MH-100+y4y3y2y1b4b3b2b1m/z662606562505434335222441328229158(CH3)2CHCH2ONH CH COBzlOCCHNHO
39、BOCNH CH2CNH CH CNH CHOCH3OCHC(CH3)2b1b2b3b4y1y2y3y4yn=yn各离子的生成途径 MH-56+McLafferty重排 MH-100+m/z606CCH2+COHNH CCORHONOCOHNH CCORHNH+H+m/z562CH3COCNCH3CH3OH+NOOCH2H+CCH2+CO2HNH+BOCNH CCNH2CCOBzlOR2HOR1H+BOCNH CCOR1H+NH2CCOBzlOR2H+bnBOCNH CCNHCCOBzlOR2HOR1HH+BOCNH CCOR1+yn+NH3CCOBzlOR2HN-端NCH CNROHHHC-
40、端N-端NCH CRHOC-端N-端NCOCHRC-端NH2HNHH+1212bn系列离子yn系列离子 氨基酸名称单同位素相对分子量羟胺正离子质量氨基酸名称单同位素相对分子量羟胺正离子质量甘氨酸(glycine,Gly/G)57.0214630天冬氨酸(aspartic acid,Asp/D)115.0269487丙氨酸(alanine,Ala/A)71.0371144谷氨酰胺(glutamine,Gln/Q)128.05858101丝氨酸(serine,Ser/S)87.0320360赖氨酸(lysine,Lys/K)128.09496101脯氨酸(proline,Pro/P)97.0527
41、670谷氨酸(glutamic acid,Glu/E)129.04259102缬氨酸(valine,Val/V)99.0684172甲硫氨酸(methionine,Met/M)131.04049104苏氨酸(threonine,Thr/T)101.0476874组氨酸(histidine,His/H)137.05891110半胱氨酸(cysteine,Cys/C)103.0091976苯丙氨酸(phenylalanine,Phe/F)147.06841120异亮氨酸(isoleucine,Ile/I)113.0840686精氨酸(arginine,Arg/R)156.10111129亮氨酸(l
42、eucine,Leu/L)113.0840686酪氨酸(tyrosine,Tyr/Y)163.06333136天冬酰氨(asparagine,Asn/N)114.0429388色氨酸(tryptophan,Trp/W)186.0793115920种氨基酸残基（NH-HCR-C=O）和羟胺正离子的质量500600700800900100011001200130014001500160017001800m/z0100%998.2942.7893.2848.6808.3616.2771.5738.0617.21060.5999.61131.11061.81211.81132.51137.51305.
43、01413.71541.91696.3160001700018000m/z0100%16951.4去卷积deconvolution20 fmole 马心肌红蛋白马心肌红蛋白(Horse Heart Myoglobin)ESI 质谱图质谱图原始数据去卷积混合物：主要两种beta lactuglobulin人血红蛋白 MALDI-TOF 质谱图鸡蛋溶菌酶ESI质谱图m/z1=895m/z2=945肌红蛋白ESI质谱图5.6 蛋白质组学及应用蛋白质组学及应用 由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。研究基因组功能的重要途径。药物目标-在分子水平研究健康和疾病的相关。蛋白质组学是一门在整体水平上研
44、究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所有蛋白质。Why蛋白质组学?mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平 蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导 蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态 蛋白质没有可进行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。在生物处理过程中蛋白质是高度动态变化的。物理化学性质的多样性。动态范围的挑战：相对含量超过106范围(血清中可达1012)质谱是肽(不是蛋白质)的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。质谱是一种精确的定量工具，尤其是内标法定量(如对同位素比的 测量)。质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。质谱对已知肽和
45、蛋白质重复定量分析不是很有效。经典的氨基酸序列分析方法N端氨基酸单元的分析 最常用的有下列两种方法：桑格尔(Sanger F)方法：利用肽链N端游离氨基与2,4二硝基氟苯(DNP)发生芳香亲核取代反应，而将 肽链上的氨基酸逐个分解。埃德曼(Edman)方法：用异硫氰酸苯酯(PITC)和N端的 游离氨基反应，将肽链上的氨基酸逐个分解。C端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解D经典分析方法的缺点 工作量大、测序速度慢、样品用量大。仪器鉴定率 MALDI 50%(Peptide Mass Fingerprinter,PMF)LC/MS/MS 80%(Pept
46、ide Sequence Tag,PST)LC/MS/MS 80%(De Novo)Isotope-Coded Affinity Tags,ICAT)蛋白质序列研究的三个层次蛋白质组研究技术路线样品(组织、细胞等)凝胶图象分析蛋白质鉴定二维数据库酶解HPLC-MS、MS/MS数据库检索二维凝胶电泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指纹谱肽序列标签从新测序 PMF测定速度快。PMF灵敏。PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。1000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.7097
47、0.691013.801060.231061.261252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.261
48、252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.261252.971254.001570.171448.1
49、42313.692312.761621.141670.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.091000120014001600180020002200240026002800m/z0100%1619.28968.64836.58893.671251.93969.70970.691013.801060.231061.261252.971254.001570.171448.142313.692312.761621.141670
50、.251671.241672.141873.461853.382019.571876.412271.832036.572314.752315.802366.832367.902368.852369.912718.09分离的酶解的蛋白质96/384位样品靶数据处理和数据库检索质谱样品的准备MALDI质谱分析蛋白质一级结构结果PMF方法的一般流程 洗胶/去污 脱水 减少S-S键 洗涤/脱水 Multiprobe(4x96 Well Plat)样品体积0.5-100 L 板上加热和冷却 消化板加热 37oC 肽存储在-4oC冷却板 酶试剂存储在-4oC冷却板 修正-SH基 加入trypsin溶液 5
