1、第三章薄层色谱法基础优选第三章薄层色谱法基础薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀地铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相,使被分离的物质展开。一.前言定义:常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴属于吸附色谱的范畴继柱色谱和纸色谱之后发展起来的方法继柱色谱和纸色谱之后发展起来的方法薄层色谱与液相色谱法比较薄层色谱与液相色谱法比较 HPLCTLC每次只能分析一个样品每次只能分析一个样品 在一块板上点上多个样品在一块板上点上多个样品同时进行分离同时进行分离 对样品制备要求高，必
2、须不对样品制备要求高，必须不含可吸留在柱上的杂质，否含可吸留在柱上的杂质，否则柱性能受损则柱性能受损 用毕一次弃去，可直接用用毕一次弃去，可直接用样品的粗提物点样样品的粗提物点样 可用检测器种类较少可用检测器种类较少 展开后可用多种手段检测展开后可用多种手段检测特点薄层色谱与柱层析和纸层析比较薄层色谱与柱层析和纸层析比较(1)快速(数十秒数十分钟)(2)分离效率高(多柱路)(3)灵敏度高 (斑点扩散小,比纸色谱高10100倍)(4)显色方法多样(腐蚀性显色剂)(5)图象易保存o比移值（比移值（Rf）Rf=原点至组分点中心的距离原点至组分点中心的距离/原原点至流动前沿的距离点至流动前沿的距离 组
3、分组分A的的Rf=a/c 组分组分B的的Rf=b/co 相对比移值，即相对于某一物质相对比移值，即相对于某一物质x的的Rf值，用值，用Rx表示。表示。其定义为：其定义为：Rx组分的组分的Rf值物质值物质x的的Rf值值 组分组分A相对于物质相对于物质B的的“相对比移值相对比移值”RB=a/b二二.基本参数基本参数三.薄层色谱的操作o 吸附剂的选择o 薄层板的制作o 展开剂的选择o 点样o 展开o 定位与显色o 薄层层析的定量测定(一一)薄层层析用的吸附剂薄层层析用的吸附剂o 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。o 吸附剂的选择首先决定于样品成分的性质，即它们的溶解性、酸碱性、极
4、性以及是否与吸附剂起化学反应等；o 其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快，0.烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸(2)分离效率高(多柱路)中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角A指向极性物质，则角B指向活度小的吸附剂，角C就指向选用极性展开剂；(1)近水平展开将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.(1)近水平展开将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法。总之点样量随分离目的而定。组分A的Rf=a/c一般
5、来说，样品量最小为几ng，常用量为几至几十g，制备型的分离可以点样到mg量。(2)比色法选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度。(2)分离效率高(多柱路)优选第三章薄层色谱法基础常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类高效薄层色谱（HPTLC）层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀中性氧化物、
6、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀地涂在在薄层板（玻璃板、金属板或弹性塑料板）上，干燥地涂在在薄层板（玻璃板、金属板或弹性塑料板）上，干燥（110活化）后即可使用。活化）后即可使用。(二)薄层板的制作1）洗板2）搅拌3）涂板4）晾干(三)薄层层析中展开剂的选择 主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。各种展开剂按其极性不同排序为 烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸 透射法扫描 反射法扫描Rf=原点至组分点中心的距离/原点至流动前沿的距离(2)双波长扫描是采用两种不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差。酶检出法实际上是一种酶抑制技术
7、，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。优选第三章薄层色谱法基础紫外光常用两种波254nm与365nm。点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的灵敏度有关。2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。(1)紫外分光光度法洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。(2)双波长扫描是采用两种不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差。(3)热板色谱(Hot plates Chromatography)最好是直径35mm的圆点。在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度。25mm厚、2020cm的薄层板在50%相对湿度中约3分钟就失
8、去活性的一半，而15分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点样速度的快慢，空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及重现性。Rf=原点至组分点中心的距离/原点至流动前沿的距离为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。(1)快速(数十秒数十分钟)由荧光减弱的程度测出斑点中化合物的含量为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。选择薄层条件的简图选择薄层条件的简图 图2 化合物的极性、吸附剂的活度及展开剂极性间的关系 Stahl设计的用以选择设计的用以选择薄层条件的简图薄层条件的简图 （1）为被分离化合物的极性（）为
9、被分离化合物的极性（2）为吸附剂的活度（为吸附剂的活度（3）为展开剂的）为展开剂的极性。若将这三个因素各自固定在极性。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角三角形，如果角A指向极性物质，指向极性物质，则角则角B指向活度小的吸附剂，角指向活度小的吸附剂，角C就指向选用极性展开剂；如转到就指向选用极性展开剂；如转到A，B，C处则又要作另外的选择组合。处则又要作另外的选择组合。极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，使极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，
10、使Rf值降低。值降低。中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。中等极性的溶剂往往起着使极性相差较大溶剂混合均匀的作用。在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度。高分离度。用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度，用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度，加快展开速度。加快展开速度。例如环己烷丙酮二乙胺水（例如环己烷丙酮二乙胺水（10:5:2:5）这个系统中，）这个系统中，水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可水是极性大的溶剂，环己烷是极性小的溶剂，后者的加入可以降低
11、分离物质的以降低分离物质的Rf值，丙酮起着混匀整个系统及降低展开剂值，丙酮起着混匀整个系统及降低展开剂粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的粘度的作用，少量二乙胺的加入控制了展开剂的pH值以使分离值以使分离后的斑点不致拖尾，分离清晰。后的斑点不致拖尾，分离清晰。多元展开剂中各种溶剂的作用多元展开剂中各种溶剂的作用 在具体工作中，展开剂的选择还必须进一步通过实践，一般可用下列三种方法：(1)查阅文献 (2)微型薄层：用小玻片铺上薄层，用各种经初步选择认为可能应用的展开剂展开，从而选择适当的展开剂，再用于一般的薄层层析。用微型薄层，节省材料和时间。(3)微量圆环技术 将试样溶液点于已准备好的薄
12、层上，点成同样大小的圆点，用毛细管吸取各种经初步选择认为可能应用的展开剂，加到试样点中心，让展开剂自毛细管中慢慢流出进行展开。微量圆环技术微量圆环技术 1 用环己烷展开用环己烷展开 2用苯展开用苯展开 3用氯仿展开用氯仿展开(四四)点点 样样1.样品溶液 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂溶解试样，配成0.5%1%的试液。2.点样量 点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用量为几至几十g，制备型的分离可以点样到mg量。总之点样量随分离目的而定。3.点样方式 最好是直径35mm的圆点。常用的点样方式常用的点样方
13、式a 一般点样一般点样b 径向点样径向点样c 条状点样条状点样d 线形小孔点样线形小孔点样e 样品填入沟槽样品填入沟槽 径向展开与普通展开的区别4.点样容器 定容毛细管 微量注射器 点样器(五五)展展 开开1.水蒸气的影响2.溶剂蒸气的影响3.展开槽4.展开方式5.几种新型的展开技术6.展开操作1.水蒸气的影响水蒸气的影响 在吸附薄层色谱的展开过程中，空气的相对湿度以及展在吸附薄层色谱的展开过程中，空气的相对湿度以及展开槽中的水蒸气必须严格控制，微量的水也能对色谱分离结开槽中的水蒸气必须严格控制，微量的水也能对色谱分离结果产生较大的影响。果产生较大的影响。硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快，硅胶薄
14、层板吸附水蒸气的速度很快，0.25mm厚、厚、2020cm的薄层板在的薄层板在50%相对湿度中约相对湿度中约3分钟就失去活分钟就失去活性的一半，而性的一半，而15分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点分钟时吸附的水分已达到最大值，因此，点样速度的快慢，空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及样速度的快慢，空气相对湿度的大小，都可以影响分离以及重现性。重现性。适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。2.溶剂蒸气的影响 “边缘效应”Stahl在用氯仿甲醇（955）为展开剂展开麦角生物碱时发现，对同一种生物碱，在薄层板中部的Rf值比在边缘的Rf值小，称此
15、现象为“边缘效应”（edge effect）。展开槽中被展开剂蒸气饱和后再进行展开就可以消除。图5 在未饱和展开槽中薄层板上出现的“边缘效应”3.展开槽 普通展开槽 双底展开槽 水平展开槽4.展开方式展开方式(1)近水平展开将点样后的薄层板下端浸入展开近水平展开将点样后的薄层板下端浸入展开剂剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层与水平成，薄层上端垫高使薄层与水平成510的角。的角。(2)上行展开将点样后的薄层放在盛有展开剂的上行展开将点样后的薄层放在盛有展开剂的直立型的展开槽中，展开剂由薄层下端借毛直立型的展开槽中，展开剂由薄层下端借毛细管作用上升至前沿。细管作用上升至前沿。(3)下行展开下行展开(
16、4)双向展开双向展开指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。图5 在未饱和展开槽中薄层板上出现的“边缘效应”高效薄层色谱（HPTLC）在展开剂中加入少量酸、碱可以使某些极性物质斑点集中，提高分离度。根据对光测定方式的不同，可分为三种(1)近水平展开将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.(六)薄层层析的定性检测优选第三章薄层色谱法基础图2 化合物的极性、吸附剂的活度及展开剂极性间的关系紫外光常用两种波254nm与365nm。(2)比色法选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。优选第三章薄层色谱法基础(5)程序多次展开（programmed Multiple Deve
17、lopment，PMD）用粘度太大的溶剂时需要加入一种溶剂以降低展开剂的粘度，加快展开速度。酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。(1)紫外分光光度法洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。2 斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。优选第三章薄层色谱法基础极性较小的溶剂降低极性大的溶剂的洗脱能力，使Rf值降低。主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。(6)阶式展开（stepwise development）薄薄层层板板玻璃板玻璃板上涂吸附剂层上涂吸附剂层SiO2Al2O3上行法上行法薄层板薄层板层层析析缸缸展开剂展开剂层层析析缸缸展开
18、剂展开剂滤纸条滤纸条下行法下行法薄层板薄层板几种新型的展开技术几种新型的展开技术(1)程序蒸气展开（程序蒸气展开（Vaporprogrammed，VP）(2)圆形色谱（圆形色谱（Radial Chromatography）(3)热板色谱热板色谱(Hot plates Chromatography)(4)多次展开（多次展开（Multiple Development）(5)程序多次展开（程序多次展开（programmed Multiple Development，PMD）(6)阶式展开（阶式展开（stepwise development）(7)梯度展开（梯度展开（gradient developm
19、ent）6 展开操作展开操作1.展开槽的密闭展开槽的密闭 目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂组成不变。组成不变。2.展开槽的饱和展开槽的饱和 为避免为避免“边缘效应边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气，在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。饱和有时是必要的。3.展开距离展开距离 常规薄层最长展距为常规薄层最长展距为20cm;高效薄层展距最高效薄层展距最长为长为10cm。4.展开温度展开温度展距对结果的影响，硅胶展距对结果的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油，分离洋甘菊油，a）3 cm、b）5 cm、c）7 cm、d）9 cm。展距对结果的影响展距对结果
20、的影响(六六)薄层层析的定性检测薄层层析的定性检测 展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划出或小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定各个斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含有哪些组分。有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。对于无色物质，可根据化合物的性质，用进行显色。1 物理检出法物理检出法 1.1.紫外光紫外光 一般来说，对于未知化合物，展开后在用显色剂以前，都应先一般来说，对于未知化合物，展开后在用显色剂以前，都应先在紫外灯下进行察看。紫外光常用两种波在紫外灯下进行察看。紫外光常用两种波254nm254nm与与365nm365nm。如果化合物能吸收紫外光同时放出荧
21、光，可用此荧光定位。如果化合物能吸收紫外光同时放出荧光，可用此荧光定位。2.2.碘碘 元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定元素碘的最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态，位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态，有利于薄层的进一步处理。有利于薄层的进一步处理。3.3.水水 水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性水可作为一种非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，当许多憎水性化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上，显化合物展开后，用水喷薄层板，对光观察，在半透明的薄层板上
22、，显出白色不透明的斑点。出白色不透明的斑点。2.化学检出法化学检出法 化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂显色剂 一般分为两类，即通用显色剂和一般分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。专属性显色剂。1 通用显色剂通用显色剂 (1)浓硫酸或50%的硫酸溶液极大多数有机物质，喷此种显色剂后立刻或在加热到110120并经数分钟后出现棕色到黑色斑点。(2)酸碱指示剂溶液例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景上显现黄色斑，表示
23、是脂肪族羧酸。常用的通用显色剂还有5%磷钼酸乙醇、碱性高锰酸钾溶液、硝酸银氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。2 专属性显色剂 指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。例如2%2，4二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120加热10分钟，醛酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。3 原位化学衍生化原位化学衍生化 在色谱分析的综合技术中，尤其对痕量组分的在色谱分析的综合技术中，尤其对痕量组分的检测，衍生化反应已成为重要手段之一。检测，衍生化反应已成为重要手段之一。在薄层色谱中，有些化合物本身无色，又无紫在薄层色谱中，有些化合物本身无色，又无紫外吸收与荧光，同时也找不到合适的显色剂，或者外吸收与荧光，同时也找不到合适
24、的显色剂，或者有性质近似的化合物共存很难分离，这时可考虑在有性质近似的化合物共存很难分离，这时可考虑在原位进行适当的化学反应，使之产生紫外吸收、荧原位进行适当的化学反应，使之产生紫外吸收、荧光、显色，或使性质发生较大差异以利于分离。光、显色，或使性质发生较大差异以利于分离。4 生物与酶检出法生物与酶检出法(bioautography)生物检出法又称生物自显影法是用生物检定法生物检出法又称生物自显影法是用生物检定法检出薄层上具有生物效应的物质如抗生素的方法。检出薄层上具有生物效应的物质如抗生素的方法。基于检出物质的生物活性，将薄层板与已培养有适基于检出物质的生物活性，将薄层板与已培养有适当微生物
25、的琼脂表面接触，并置适宜温度的培育箱当微生物的琼脂表面接触，并置适宜温度的培育箱内，经过一段时间后观察抑菌点，有抗生素斑点处内，经过一段时间后观察抑菌点，有抗生素斑点处的培养基微生物生长受到抑制，整个琼脂板出现了的培养基微生物生长受到抑制，整个琼脂板出现了抑菌点，由此抑菌点可对该抗生素组分定位。抑菌点，由此抑菌点可对该抗生素组分定位。酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。层色谱检出某些有机磷农药。5 放射显影显影法（Autoradiography）就是用含放射性同位素的化合物在薄层上显就是用含放射性同位素的化合物在薄层上显示位置的
26、方法。具体方法是使薄层上同位素的辐射示位置的方法。具体方法是使薄层上同位素的辐射线透过照相底片，显影以后由于银粒而显出潜影，线透过照相底片，显影以后由于银粒而显出潜影，在一定剂量范围内，放射性物质斑点使底片所呈暗在一定剂量范围内，放射性物质斑点使底片所呈暗度与斑点中放射性物质的浓度成正比，因此不仅可度与斑点中放射性物质的浓度成正比，因此不仅可定位，还可定量定位，还可定量。薄层色谱与液相色谱法比较常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一，转动圆盘正中的三角形，如果角A指向极性物质，则角B
27、指向活度小的吸附剂，角C就指向选用极性展开剂；展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符合一定的线性关系。展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。优选第三章薄层色谱法基础酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。高效薄层色谱（HPTLC）薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法。(2)微型薄层：用小玻片铺上薄层，用各种经初步选择认为可能应用的展开剂展开，从而选择适当的展开剂，再用于一般的薄层层析。酶检出法实际上是一种酶抑制技术，用于薄层色谱检出某些有机磷农药。极性较大的溶剂可以使化合物在薄层上移动。薄层色谱与液相色谱法比较元素碘的
28、最大特点是与物质的反应往往是可逆的，当化合物定位以后在空气中放置时，碘即升华挥去，可以回到组分的原来状态，有利于薄层的进一步处理。(2)比色法选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量，是比较常用的方法。展距对结果的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油，a）3 cm、b）5 cm、c）7 cm、d）9 cm。例如2%2，4二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120加热10分钟，醛酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。(七七)薄层层析的定量测定薄层层析的定量测定o 展开后，薄层分离所得斑点中化合物可进一步定量，其测定方法可分为两大类o 一类为洗脱测定法，将所需测定的斑点中的组分用适当溶剂洗脱，再选用适当方法定量
29、；o 另一类为直接测定法，色谱分离后，直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。1 洗脱测定法洗脱测定法 1 斑点的定位斑点的定位2 斑点的洗脱斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下，用吸集器将斑点位置的吸附吸下，然后用洗脱溶剂洗脱。然后用洗脱溶剂洗脱。3 测定测定(1)紫外分光光度法洗脱液调整至一定体积，在此紫外分光光度法洗脱液调整至一定体积，在此化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。(2)比色法选择灵敏度高、专属性好的比色反应测比色法选择灵敏度高、专属性好的比色反应
30、测定化合物含量，是比较常用的方法。定化合物含量，是比较常用的方法。(3)其它方法极谱、库仑滴定、荧光测定等。其它方法极谱、库仑滴定、荧光测定等。吸集器及减压洗脱装置 吸集器 减压洗脱2 直接测定法1 目测法 样品经色谱分离后，直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近似地判断样品中所测成分的含量。2 测面积法 展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符合一定的线性关系。3 仪器测定法3 仪器测定法仪器测定法 用用光密度计光密度计或称或称薄层扫描仪薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量，）扫描定量，该方法已成为薄层定量的主要
31、方法。该方法已成为薄层定量的主要方法。1.吸收测定法吸收测定法 展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸展开后的薄层，用一定波长单色光束进行扫描，记录其吸光度的变化，得到扫描曲线。光度的变化，得到扫描曲线。利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出利用样品扫描曲线上峰高或面积与标准品相比较，可得出样品含量。样品含量。2.荧光测定法荧光测定法 化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可化合物本身有荧光或经过适当处理后生成荧光化合物者可测量其荧光强度而进行定量。测量其荧光强度而进行定量。3.荧光淬灭法荧光淬灭法 由荧光减弱的程度测出斑点中化合物的含量由荧光减弱的程度测出斑
32、点中化合物的含量 吸收测定法的分类 根据对光测定方式的不同，可分为三种透射法反射法透射反射法 透射法扫描 反射法扫描 L 光源；MC 单色器；P 薄层板；S 斑点；PD 光电检测器仪器测定法的两个重要参数 o 扫描波长o (1)单波长扫描使用一种波长的光线对薄层进行扫描。o (2)双波长扫描是采用两种不同波长的光束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两波长吸光度之差。o 扫描轨迹o 直线扫描、锯齿状扫描、圆形扫描 化合物斑点的吸收光谱 单波长与双波长扫描曲线的比较四四 特殊的薄层特殊的薄层1.高效薄层色谱（HPTLC）2.棒状薄层色谱（RodTLC）3.超薄层色谱 （Ultra Thinlaye
33、r Chromatography）1.高效薄层色谱高效薄层色谱（HPTLC）HPTLC是在普通薄层基础上发展起来的一种是在普通薄层基础上发展起来的一种更为灵敏、精细的薄层技术。高效薄层是采用小颗更为灵敏、精细的薄层技术。高效薄层是采用小颗粒吸附剂制备的均匀薄层，分离效率比普通薄层提粒吸附剂制备的均匀薄层，分离效率比普通薄层提高三倍，检出灵敏度增加，分析时间缩短。高三倍，检出灵敏度增加，分析时间缩短。高效薄层色谱由于吸附剂颗粒小，流动相展开高效薄层色谱由于吸附剂颗粒小，流动相展开速度慢，平衡易于达到，质量传递的阻滞作用往往速度慢，平衡易于达到，质量传递的阻滞作用往往可以忽略不计，展开后斑点的大小
34、主要由化合物分可以忽略不计，展开后斑点的大小主要由化合物分子扩散系数决定。化合物展开后只要不走在溶剂前子扩散系数决定。化合物展开后只要不走在溶剂前沿，均呈小而圆整的斑点。沿，均呈小而圆整的斑点。2.棒状薄层色谱（RodTLC）将样品点在薄层棒上，经点样、展开后将样品点在薄层棒上，经点样、展开后将被分离后的色谱棒通过适当的机械传动装将被分离后的色谱棒通过适当的机械传动装置，水平地穿过检测氢火焰的中心，使化合置，水平地穿过检测氢火焰的中心，使化合物燃烧裂解，形成离子碎片和自由电子，再物燃烧裂解，形成离子碎片和自由电子，再由电极收集它们并产生与化合物量成正比的由电极收集它们并产生与化合物量成正比的电流信号而测出各物质的含量。电流信号而测出各物质的含量。
