1、本章内容一、核酸的概念与重要性二、核酸的组成成分 三、DNA的结构五、RNA的结构和功能六、核酸的性质七、核酸的序列测定 DNADNA有酸性磷酸基及碱性碱基，为两性大分子，有酸性磷酸基及碱性碱基，为两性大分子，但但偏于酸性偏于酸性。DNADNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNARNA为白色粉末；微溶于为白色粉末；微溶于水，不溶于一般有机溶剂。水，不溶于一般有机溶剂。DNADNA的粘度极高，的粘度极高，RNARNA要小的多；要小的多；RNARNA在室温被稀碱水解成核苷酸而在室温被稀碱水解成核苷酸而DNADNA（因其（因其2 2，位没有位没有OHOH基）对碱稳定。基）对碱稳定。D D核糖（
2、核糖（RNARNA组分）与浓盐酸和苔黑酚共热产生组分）与浓盐酸和苔黑酚共热产生绿色绿色；D D2 2脱氧核糖（脱氧核糖（DNADNA组分）与酸和二苯组分）与酸和二苯胺共热产生胺共热产生蓝紫色蓝紫色，可区别二者及定量测定。，可区别二者及定量测定。一般理化性质一般理化性质核酸的紫外吸收性质核酸的紫外吸收性质 UVUV吸收吸收 ：核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在而具有紫外吸收的的性质，在260260nmnm处核处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸紫外吸收最强。核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。酸定量测定的基础。核酸的光吸收比其各核苷酸成
3、分的光核酸的光吸收比其各核苷酸成分的光吸收值之和要吸收值之和要少少30304040，这是双螺，这是双螺旋中碱基紧密堆积在一起造成的。旋中碱基紧密堆积在一起造成的。核酸结构的稳定性核酸结构的稳定性1 1、碱基对间的氢键碱基对间的氢键 在核酸双螺旋区，碱基对间形成氢键；在核酸双螺旋区，碱基对间形成氢键；氢氢键是一种较弱的非共价键，但许多氢键的集合键是一种较弱的非共价键，但许多氢键的集合能量是很大的。能量是很大的。2 2、碱基堆积力碱基堆积力 疏水性的碱基堆积在双螺旋内部，形成疏水疏水性的碱基堆积在双螺旋内部，形成疏水核心；螺旋外围的核糖和磷酸基上的亲水基团，核心；螺旋外围的核糖和磷酸基上的亲水基团
4、，使环境中的水在螺旋外围形成水壳，也有助于使环境中的水在螺旋外围形成水壳，也有助于螺旋的稳定。螺旋的稳定。3 3、环境中的正离子环境中的正离子 环境中的正离子与核酸的带负电荷的磷酸基环境中的正离子与核酸的带负电荷的磷酸基团结合，消除静电斥力，稳定核酸结构。团结合，消除静电斥力，稳定核酸结构。DNADNA的变性、复性与分子杂交的变性、复性与分子杂交 DNADNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释释DNADNA的重要特性变性与复性。的重要特性变性与复性。（一）（一）DNADNA变性变性 1 1、DNADNA变性的概念变性的概念：指
5、：指DNADNA分子中的双螺旋结构解链分子中的双螺旋结构解链 为为无规则线性结构无规则线性结构的现象。的现象。2 2、DNADNA变性的本质变性的本质：维持双螺旋稳定性的：维持双螺旋稳定性的氢键断裂氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的，但不涉及到其一级结构的改变。改变。3 3、导致导致DNADNA变性的因素：变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的素，如加热、极端的pHpH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性4 4、变性后变性后DNADN
6、A其它理化性质变化：其它理化性质变化：紫外吸收增强紫外吸收增强 （OD260OD260增高）、粘度下降、浮增高）、粘度下降、浮 力密度升高、生物活性部分或全部丧失力密度升高、生物活性部分或全部丧失 增色效应增色效应：指指DNADNA变性后其变性后其紫外吸收明显增强的效应紫外吸收明显增强的效应。DNADNA分分子中碱基间电子的相互作用使子中碱基间电子的相互作用使DNADNA分子具有吸收分子具有吸收260260nmnm波长紫外光的特性。在波长紫外光的特性。在DNADNA双螺旋结构中碱基双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时藏入内侧，变性时DNADNA双螺旋解开，于是碱基外露，双螺旋解开，于是碱基外露，碱
7、基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。生增色效应。DNA DNA变性的本质是氢键的断裂变性的本质是氢键的断裂 对双链对双链DNADNA进行进行加热变性，当温加热变性，当温度升高到一定高度升高到一定高度时，度时，DNADNA溶液溶液在在260260nmnm处的吸处的吸光度光度突然明显上突然明显上升至最高值升至最高值，随，随后即使温度继续后即使温度继续升高，吸光度也升高，吸光度也不再明显变化。不再明显变化。若以温度对若以温度对DNADNA溶液的紫外吸光溶液的紫外吸光率作图，得到的率作图，得到的典型典型DNADNA变性曲变性曲线呈线呈S S
8、型。型。5 5、熔解温度熔解温度(TmTm）：）：由上图可见，由上图可见，DNADNA变性是在一个变性是在一个很窄的温度范围内很窄的温度范围内发发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的到最大值的50%50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的熔解相类似，又称一现象和结晶的熔解相类似，又称熔解温度熔解温度（一般在（一般在8080100100）。在在TmTm时，核酸分子内时，核酸分子内50%50%的双螺旋结构的双螺旋结构被破坏。被破坏。影响因素：影响因素：（1 1）G GC C含量：含量：
9、特定核酸分子的特定核酸分子的TmTm值与其值与其G GC C所占所占 总碱基数的百分比成正相关。总碱基数的百分比成正相关。（2 2）溶液的离子强度溶液的离子强度：离子强度较低的介质中，离子强度较低的介质中，TmTm较低。较低。（3 3）溶液的溶液的pHpH值值：pHpH过高过低引起过高过低引起DNADNA变性。变性。（4 4）变性剂变性剂的使用可使的使用可使TmTm降低：降低：(G+C)%=(G+C)%=（Tm Tm 69.369.3）2.44 2.44(二二)DNADNA的热变性与复性的热变性与复性 指经加热变性的指经加热变性的DNADNA在适当条件下，二条互补在适当条件下，二条互补链全部或
10、部分链全部或部分恢复恢复到天然双螺旋结构的现象，它到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程。热变性是变性的一种逆转过程。热变性DNADNA一般经一般经缓慢缓慢冷却冷却后即可复性，此过程称之为后即可复性，此过程称之为退火退火。一般认为一般认为比比Tm Tm 低低2525左右的温度是复性的最佳条件。这左右的温度是复性的最佳条件。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后见后)。影响因素：影响因素：（1 1）单链片段浓度（）单链片段浓度（2 2）单链片段大小）单链片段大小（3 3）片段内的重复序列（）片段内的重复序列（4 4）溶液的离子强度）溶液的离子强度*复
11、性过程中的碱基配对：复性过程中的碱基配对：（三）分子杂交：（三）分子杂交：不同来源不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基碱基互补配对的片段互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的间，即形成所谓的杂化双链杂化双链，这个过程称为这个过程称为杂交杂交。杂交可以发生于杂交可以发生于DNADNA与与DNADNA之间，也可以发生于之间，也可以发生于RNARNA与与RNARNA之间和之间和DNADNA与与RNARNA之
12、间。之间。核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入检验核酸的缺失、插入，还可用来，还可用来考察考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系定它们在进化中的关系，其主要应用如下图所示，其主要应用如下图所示 ：核酸杂交核酸杂交 .变性、复性和杂交变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同。粗细线分别代表不同DNADNA。A A是杂化双链是杂化双链.突变体的鉴别突变体的鉴别。B B代表天然代表天然DNADNA；C C是是B B的缺失
13、突变体；的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分；虚线框内是已缺失的部分；D D是显示从天然是显示从天然DNADNA链鼓出小泡链鼓出小泡 .粗线代表粗线代表探针探针，粗线上的，粗线上的X X表示放射性标记表示放射性标记SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(酶法测序）酶法测序）（1 1）以以DNADNA的酶促合成原理为基础的酶促合成原理为基础：DNADNA的合成需要模板、引物、底物（的合成需要模板、引物、底物（dNTPdNTP）、聚合酶等）、聚合酶等条件。在引物的条件。在引物的33末端，依据碱基配对的原则，生成末端，依据碱基配对的原则，生成新的新的3,53,5磷酸二酯键，进行延伸。磷
14、酸二酯键，进行延伸。（2 2）测序时，四组反应平行进行，每组反应均使用相）测序时，四组反应平行进行，每组反应均使用相同的模板、引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应同的模板、引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸（双脱氧核苷酸（ddNTPddNTP），使其随机地接入使其随机地接入DNADNA链中，使链合成终止，产生相应的链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的四组具有特定长度的、不同长短的DNADNA链。这四组链。这四组DNADNA链再经过链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经按链的长短分离开，经过过放射自显影放射自显影显示区带，就可以显示区带，就可以直接读出被测直接读出被测DNADNA的核的核苷酸序列苷酸序列,如下图所示：如下图所示：核酸的序列测定核酸的序列测定
