1、 第二章第二章 药物的鉴别试验药物的鉴别试验(Identification)通过理化方法判别已知药物真伪通过理化方法判别已知药物真伪.第一节第一节 药物鉴别试验的定义与目的药物鉴别试验的定义与目的 药物的鉴别试验是药物的鉴别试验是根据药物的分子结构、根据药物的分子结构、理化性质,采用物理、化学或生物学方法来判理化性质,采用物理、化学或生物学方法来判断断已知已知药物的真伪,它是药品质量检验工作中药物的真伪,它是药品质量检验工作中的首项任务。的首项任务。ChP2010ChP2010凡例中对药物鉴别的定义为:鉴凡例中对药物鉴别的定义为:鉴别项下规定的试验方法,仅反映该药品某些物别项下规定的试验方法,
2、仅反映该药品某些物理、化学或生物学等性质的特征,不完全代表理、化学或生物学等性质的特征,不完全代表对该药品化学结构的确证。对该药品化学结构的确证。一一.性状性状(Description)(Description)1.1.外观外观:晶型晶型,色泽色泽,气味等气味等.2.2.溶解度溶解度:可反映药品纯度可反映药品纯度,并作为选择溶剂并作为选择溶剂的依据的依据.方法:除另有规定外,称取研成细粉的供方法:除另有规定外,称取研成细粉的供试品或量取液体供试品,于试品或量取液体供试品,于2525 22一定容量一定容量的溶剂中,每隔的溶剂中,每隔5 5分钟强力振摇分钟强力振摇3030秒钟;观察秒钟;观察303
3、0分钟内的溶解情况,如无目视可见的溶质颗分钟内的溶解情况,如无目视可见的溶质颗粒或液滴时,即视为完全溶解。粒或液滴时,即视为完全溶解。第二节第二节 鉴别试验的项目鉴别试验的项目3.物理常数物理常数:(1)熔点)熔点:定义定义固体药品从初熔到全熔的固体药品从初熔到全熔的T,T,熔融熔融分解分解T,T,药品从固态到液态的药品从固态到液态的T.T.方法方法毛细管法毛细管法,包括第一法包括第一法,第二法第二法和第三法和第三法.例例 雌二醇的熔点为雌二醇的熔点为175175180180;格列本;格列本脲的熔点为脲的熔点为170170174174,熔融时同时分解熔融时同时分解。(2 2)比旋度)比旋度:反
4、映手性药物特性及纯度反映手性药物特性及纯度.定义定义一定一定,T T下,偏振光通过长下,偏振光通过长1dm1dm,手手性药物含量为性药物含量为1g/ml1g/ml的溶液时测得的的溶液时测得的旋光度。旋光度。=100 /lC(g/100ml)(3 3)吸收系数:吸收系数:一定一定,T T和溶剂下,药物在单位浓度及液和溶剂下,药物在单位浓度及液层厚度(层厚度(1cm1cm)时的吸收度。)时的吸收度。C=1%(w/v)时时E ,C=1mol/L时时 .E M /101%1cm1%1cm20D 二二 一般鉴别试验一般鉴别试验:一类药物一类药物 1.有机氟化物有机氟化物 样品样品氧瓶燃烧氧瓶燃烧,H2O
5、/NaOH吸收吸收(F-),pH4.3缓冲液缓冲液,茜素氟蓝茜素氟蓝/Ce(NO3)3蓝紫色配蓝紫色配位化合物位化合物,max=610nm.2.有机酸有机酸盐盐:水杨酸水杨酸酚酚OH与与FeCl3(弱酸性弱酸性)作用作用紫色紫色.酒石酸酒石酸加加AgNO3/NH3H2O 银镜银镜.3.芳伯氨基芳伯氨基重氮化重氮化-偶合反应偶合反应.NH2RNaNO2 2HClN+Cl-R2NaClH2O2+N+Cl-R2+OH+NaOHNRNOHNaClH2O+4.托烷类生物碱托烷类生物碱发烟硝酸发烟硝酸/KOH(s)紫色紫色 5.Na,K,Ca 焰色反应焰色反应.6.铵盐铵盐:OH-/NH3,红色石蕊变蓝。
6、,红色石蕊变蓝。7.无机酸根:无机酸根:Cl-加加AgNO3 AgCl SO42-加加BaCl2 BaSO4 水解HOOCOHNO2O2NNO2KOH(C2H5OH)莨菪酸HOOCOH3HNO3三硝基衍生物NO2HOOCOHO2NNOOHROOHO托烷类KOHNO2HOOCOHO2NNOOK深紫色 三三 专属鉴别试验专属鉴别试验 原理:依据特有化学结构采用特殊灵敏的原理:依据特有化学结构采用特殊灵敏的定性反应。适于:证明是哪定性反应。适于:证明是哪一种一种药物药物 如司可巴比妥鉴别如司可巴比妥鉴别:1.丙二酰脲类鉴别试验丙二酰脲类鉴别试验一般一般 2.与碘液反应与碘液反应专属专属 第三节第三节
7、.鉴别方法鉴别方法一一.化学法化学法反应快反应快,现象明显现象明显,专属性差专属性差.1.显色显色FeCl3显色显色(酚羟基酚羟基),异羟肟酸铁反应异羟肟酸铁反应(芳酸及酯芳酸及酯),双缩脲反应双缩脲反应(氨基醇氨基醇),重氮化重氮化-偶合反应偶合反应(芳伯氨基芳伯氨基),氧化还原反应氧化还原反应.2.沉淀沉淀与重金属离子反应与重金属离子反应,与生物碱沉淀剂反应与生物碱沉淀剂反应.3.荧光荧光药物在光照(药物在光照(UV或或VIS)下发出荧光)下发出荧光;药物发生反应后光照下发出荧光药物发生反应后光照下发出荧光4.气体气体如如NH3,CO2等等5.氧化还原反应使试剂退色(如氧化还原反应使试剂退
8、色(如VitC).6.测定测定衍生物衍生物mp.二二 光谱法光谱法1.UV-Vis(Ultraviolet and Visible spectrophotometry)适于含共轭结构的药物适于含共轭结构的药物.可供鉴别的参数可供鉴别的参数:max,min,A,E,经化学处理经化学处理后,测定其反应产物的吸收光谱特性后,测定其反应产物的吸收光谱特性,A1/A2,如如:VitB2的鉴别的鉴别:其其 max为为267nm,375nm和和444nm;A375/A267 的比值应为的比值应为0.31-0.33;A444/A267 的比值应为的比值应为0.36-0.39;BP2009BP2009阿替洛尔的
9、阿替洛尔的UVUV鉴别:取本品鉴别:取本品0.100g0.100g用用甲醇溶解并稀释至甲醇溶解并稀释至100ml100ml,取上述溶液,取上述溶液10.0ml10.0ml用用甲醇稀释至甲醇稀释至100ml100ml。在。在230230350nm350nm波长范围内测波长范围内测定,溶液显示在定,溶液显示在275nm275nm和和282nm282nm处有最大吸收峰,处有最大吸收峰,其吸收度比值为其吸收度比值为1.151.151.201.20。2.IR(Infrared spectrum):专属性强专属性强,应用广泛应用广泛,ChP2010采用采用标准图标准图谱对照法谱对照法,USP32则采用对照
10、品法。则采用对照品法。制样方法制样方法:(1)压片法压片法,取供试品约取供试品约1mg,置,置玛瑙研钵中,加入干燥的溴化钾或氯化钾细粉玛瑙研钵中,加入干燥的溴化钾或氯化钾细粉约约200mg,充分研磨混匀,充分研磨混匀,压片压片,测定时扣除用测定时扣除用同法制成的空白同法制成的空白 (2)糊法和膜法糊法和膜法,(3)溶液法溶液法.原料药鉴别原料药鉴别采用标准图谱对照采用标准图谱对照.ChP2010也也收载了制剂的收载了制剂的IR鉴别法鉴别法,注意辅料的干扰注意辅料的干扰。OOHCC H炔诺酮炔诺酮OC CH OH 3.NIR(Near-infrared spectrophotometry)根据被
11、测物质在近红外谱区根据被测物质在近红外谱区7502500nm(128004000cm-1)的特征光谱并利用适宜的化的特征光谱并利用适宜的化学计量学方法提取相关信息后,对被测物质进学计量学方法提取相关信息后,对被测物质进行定性、定量分析的一种技术。具有快速、准行定性、定量分析的一种技术。具有快速、准确、对样品无破坏的检测特性,不仅可用于确、对样品无破坏的检测特性,不仅可用于“离线离线”供试品的检验,还能直接对供试品的检验,还能直接对“在线在线”样品进行检测。样品进行检测。(1)建立参考谱库建立参考谱库,(2)数据预处理数据预处理,(3)数据数据评估评估,(4)数据库验证数据库验证.4.AAS(A
12、tomic Absorption spectrophotometry)基态原子蒸汽吸收由同一元素作阴极制基态原子蒸汽吸收由同一元素作阴极制成的空心阴极灯发出的特征谱线成的空心阴极灯发出的特征谱线.专属性高专属性高.5.NMR(Nuclear Magnetic Resonance)根据样品指定基团的质子峰的化学位移根据样品指定基团的质子峰的化学位移和偶合常数来鉴别和偶合常数来鉴别.ChP2010附录也列入该方法,在新药的附录也列入该方法,在新药的研制中,如药物结构确证,更是重要的定性研制中,如药物结构确证,更是重要的定性分析方法之一分析方法之一。6 MS(Mass Spectrometry)真空
13、状态下真空状态下,将样品离子化将样品离子化(EI,CI,FAB)并并进一步打成碎片进一步打成碎片,按正离子的质荷比按正离子的质荷比(m/z)大小大小分离而实现结构分析分离而实现结构分析.ChP2010、USP32、BP2009均收载了质谱均收载了质谱法。质谱广泛应用于药物的定性鉴别。法。质谱广泛应用于药物的定性鉴别。解析重点:分子离子,碎片离子,同位素解析重点:分子离子,碎片离子,同位素离子峰,亚稳离子峰,准分子离子峰。离子峰,亚稳离子峰,准分子离子峰。7 X射线粉末衍射射线粉末衍射 当当X X射线照射到晶格排列整齐的晶体上时,射线照射到晶格排列整齐的晶体上时,在一些方向产生反射在一些方向产生
14、反射XX射线衍射,由布拉格射线衍射,由布拉格方程求出晶面间距,并求出键长方程求出晶面间距,并求出键长,键角,最后键角,最后画出分子结构画出分子结构 2d2dhklhklsinsin =n=n 衍射角衍射角2 2 ,面间距面间距d dhklhkl;hkl为晶面指数,为晶面指数,即晶面与晶轴截距的倒数之比,也叫密勒指即晶面与晶轴截距的倒数之比,也叫密勒指数。数。三三 色谱法色谱法1.TLC(Thin-layer Chromatography)(1)一般用同浓度对照品对照法一般用同浓度对照品对照法,比较比较Rf值值(2)样液样液+同体积对照液同体积对照液 应显单一斑点应显单一斑点(3)样液和结构相近
15、的对照药物分别点样样液和结构相近的对照药物分别点样,两者两者的的Rf值应不同值应不同.(4)样液样液+结构相近的对照药物后点样结构相近的对照药物后点样,应显二个应显二个分离的斑点分离的斑点.分离效能:在对照品与结构相似药物的对分离效能:在对照品与结构相似药物的对照品制成混合对照溶液的色谱图中,应显示两照品制成混合对照溶液的色谱图中,应显示两个清晰分离的斑点。个清晰分离的斑点。Rf=l/l02.HPLC(High Pressure Liquid Chromatography)和和GC(Gas Chromatography).(tR)四四 显微鉴别法显微鉴别法 显微鉴别主要用于中药及其制剂的鉴别,
16、显微鉴别主要用于中药及其制剂的鉴别,通常采用显微镜对药材的(饮片)切片、粉末、通常采用显微镜对药材的(饮片)切片、粉末、解离组织或表面制片,以及含饮片粉末的制剂解离组织或表面制片,以及含饮片粉末的制剂中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别中饮片的组织、细胞或内含物等特征进行鉴别的一种方法的一种方法。五五 生物学法生物学法.利用微生物或者实验动物进行鉴别利用微生物或者实验动物进行鉴别.主要用主要用于抗生素、生化药物以及中药的鉴别。于抗生素、生化药物以及中药的鉴别。六、指纹图谱与特征图谱鉴别法六、指纹图谱与特征图谱鉴别法 中药中药色谱色谱指纹图谱是一种综合的、可量化指纹图谱是一种综合的、可量化的
17、色谱鉴定手段。借以鉴定真伪,评价药材和的色谱鉴定手段。借以鉴定真伪,评价药材和成品质量均一性和稳定性。基本属性是成品质量均一性和稳定性。基本属性是“整体整体性性”和和“模糊性模糊性”。不强调个体的绝对唯一性,。不强调个体的绝对唯一性,而强调同一药材群体的而强调同一药材群体的相似性相似性。相似性是通过。相似性是通过色谱的整体性和模糊性来体现,这是中药色谱色谱的整体性和模糊性来体现,这是中药色谱指纹图谱分析的最基本的属性。指纹图谱分析的最基本的属性。分析色谱指纹图谱强调的是分析色谱指纹图谱强调的是“准确的辨准确的辨认认”(accurate recognitionaccurate recogniti
18、on)而不是)而不是“精精密的计算密的计算”(precise calculationprecise calculation);比较);比较图谱强调的是相似(图谱强调的是相似(similaritysimilarity)而不是相)而不是相同(同(identityidentity)。在不可能将中药复杂成分)。在不可能将中药复杂成分都搞清楚的情况下,指纹图谱的作用主要是都搞清楚的情况下,指纹图谱的作用主要是反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均反映复杂成分的中药及其制剂内在质量的均一性和稳定性。一性和稳定性。第四节第四节.鉴别试验条件和方法验证鉴别试验条件和方法验证(一一)浓度浓度与方法灵敏度有关与方
19、法灵敏度有关,影响所观察的现影响所观察的现象象.(二二)温度温度影响反应速度影响反应速度,药物稳定性药物稳定性.(三三)酸碱度酸碱度影响药物离解度影响药物离解度.(四四)时间时间改变条件使反应尽快完成改变条件使反应尽快完成.(五五)鉴别方法的验证鉴别方法的验证 1.1.专属性:在其他成分(其他药物成分、杂专属性:在其他成分(其他药物成分、杂质、降解产物、辅料等)存在的情况下,采用的质、降解产物、辅料等)存在的情况下,采用的鉴别方法能否正确地鉴别出被测物质的特性。鉴别方法能否正确地鉴别出被测物质的特性。2.2.耐用性耐用性:是指测定条件发生小的变动时,是指测定条件发生小的变动时,测定结果受到的影响程度。测定结果受到的影响程度。小结1.药物鉴别试验的定义.2.mp,E3.UV,IR,TLC等的应用.4.指纹图谱鉴别