1、基因工程基因工程酶工程酶工程细胞工程细胞工程发酵工程发酵工程产物产品产品产品产品抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、抗生素、生物制药、氨基酸、核苷酸、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、有机酸、饲料添加剂、微生态制剂、生物农药、生物肥料等生物农药、生物肥料等医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业医药、轻工、食品、农业、环保、能源等行业基因工程药物、疫苗及抗体产品基因工程药物、疫苗及抗体产品基因工程菌发酵基因工程菌发酵抗酒、面包、醋、堆肥抗酒、面包、醋、堆肥发酵现象发酵现象酿造食品工业酿造食品工业非食品工业非食品工业青霉素青霉素抗抗菌素发酵工业菌素发酵工业氨基酸氨基酸,核酸发酵（核酸发酵（代谢控制发
2、酵代谢控制发酵）基因工程菌基因工程菌动物细胞大规模培养动物细胞大规模培养植物细胞大规植物细胞大规模培养模培养藻类细胞大规模培养藻类细胞大规模培养转基因动物转基因动物涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题资源与能源等重大问题 第一节：工业常用微生物及来源q 微生物的特性及工业微生物的要求q 一些工业化产品生产菌种的特点q 菌种选育一.微生物的特性及工业微生物的要求1、微生物的特性q 有些微生物能在厌氧的条件下生长q 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长q 有些微生物能进行复杂的代谢q 有些微生物能利用较复
3、杂的化合物q 有些微生物能在极端的环境下生长2：工业化生产菌种的要求：工业化生产菌种的要求保藏单位保藏单位(简称简称)所在国家所在国家保藏范围保藏范围澳大利亚国家分析试验室(AGAL)澳大利亚微生物菌种比利时微生物保藏中心(BCCM)比利时大部分微生物菌种保加利亚菌种保藏库(NBIMCC)保加利亚微生物菌种中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中国几乎所有的培养物中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)中国普通菌种捷克微生物保藏所(CCM)捷克普通微生物菌种法国微生物保藏中心(CNCM)法国几乎所有的培养物德国微生物保藏中心(DSM)德国普通微生物菌种匈牙利国家农业和工业微生物保藏中心(NCAI
4、M)匈牙利工业菌种日本国家生命科学和人类技术研究所(NIBH)日本几乎所有的培养物荷兰真菌保藏所(CBS)荷兰真菌类韩国细胞系研究联盟(KCLRF)韩国动植物细胞系韩国微生物保藏中心(KCCM)韩国微生物菌种韩国典型培养物保藏中心(KCTC)韩国培养物俄罗斯微生物保藏中心(VKM)俄罗斯工业微生物俄罗斯科学院微生物理化所(IBFMVKM)俄罗斯所有培养物俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)俄罗斯工业菌种斯洛伐克酵母保存所(CCY)斯洛伐克酵母菌西班牙普通微生物保藏中心(CECT)西班牙普通微生物菌种英国藻类和原生物动物保藏中心(CCAP)英国藻类、原生动物欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)
5、英国动物细胞系等国际真菌学研究所(IMI)英国真菌、细菌等英国国家食品细胞保藏中心(NCFB)英国工业细菌英国国家典型培养物保藏中心(NCTC)英国普通微生物英国国家酵母菌保藏中心(NCYC)英国酵母菌英国国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB)英国工业及海洋细菌美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL)美国以微生物菌种为主美国典型培养物保藏中心(ATCC)美国几乎所有的培养物放线菌（链霉素四环素；红霉素等）真菌（青霉素、头孢等）一些产芽孢的细菌植物或动物来源1、抗生素生产有关的微生物抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢，目前发现的生物来源如下：二、已工业化产品生产菌的介绍2、氨基
6、酸生产有关的微生物代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。50,60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是发酵工业发展历史上的一个转折点：HD:高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成和异亮氨酸的合成调节机制调节机制 HT:高丝氨酸转乙酰酶高丝氨酸转乙酰酶AK:天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚，代谢途径比较简单谷氨酸发酵的菌种：其它氨基酸生产菌：棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小杆菌属的棒型
7、细菌常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌3、食品酶制剂生产有关的微生物开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于食品用酶，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。淀粉酶淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草：黑曲霉、米曲霉、米根霉、枯草 芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌纤维素酶：纤维素酶：木霉木霉红曲酶红曲酶;红曲霉红曲霉蛋白酶：蛋白酶：枯草芽孢杆菌、黑曲霉枯草芽孢杆菌、黑曲霉发酵罐：反应器水平,可以得出最 终优化的基 础配方表表15-3发酵过程的主要控制项目和方法发酵过程的主要控制项目和方法附一附一 温度变化及其控制温度变化及其控制
8、 一、温度对生长的影响一、温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0260C生长，嗜温菌适应于生长，嗜温菌适应于15430C生长，嗜生长，嗜热菌适应于热菌适应于37650C生长，嗜高温菌适应于生长，嗜高温菌适应于650C以上生长以上生长 二、温度影响发酵方向二、温度影响发酵方向四环素产生菌金色链霉菌四环素产生菌金色链霉菌1.当温度低于当温度低于300C时，合成金霉素能力较强；时，合成金霉素能力较强；2.温度提高，合成四环素的比例也提高，温度提高，合成四环素
9、的比例也提高，3.温度达到温度达到350C时，只产生四环素。时，只产生四环素。温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。过程中的温度要严格控制。最适温度的选择最适温度的选择1 1、根据菌种及生长阶段选择、根据菌种及生长阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。求的温度范围也不同。如黑曲霉生长温度为如黑曲霉生长温度为370C，谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为谷氨酸产生菌棒状杆
10、菌的生长温度为30320C，青霉菌生长温度为青霉菌生长温度为300C。在在发酵前期发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，大量的菌体，取稍高的温度取稍高的温度，促使菌的呼吸与代，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；谢，使菌生长迅速；在在中期中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低温度要稍低一些，一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得
11、比较严密有利于产物合成。利于产物合成。l根据生长阶段选择根据生长阶段选择2 2、根据培养条件选择、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。选择。通气条件差通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。营养利用快，会使菌过早自溶。3 3、根据菌生长情况、根据菌生长情况菌生长快菌生长快，维持在较高温度时间要短些；，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，菌生长慢，维持
12、较高温度时间可长些。维持较高温度时间可长些。培养条件适宜培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。定出最适温度。三、发酵过程引起温度变化的因素三、发酵过程引起温度变化的因素（一）发酵热（一）发酵热Q Q发酵发酵发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热就是发酵过程中释放出来的净发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量
13、。热量。在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，在发酵过程中产生菌分解基质产生热量，机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸机械搅拌产生热量，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。量。1 1、生物热、生物热Q Q生物生物 在发酵过程中，菌体不断利用培养基在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，提供
14、细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。来的热就叫生物热。微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。生的热多。l生物热与发酵类型有关生物热与发酵类型有关微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多多一摩尔葡萄糖彻底氧化成一摩尔葡萄糖彻底氧化成CO2和水和水好氧：产生好氧：产生287.2千焦耳热量，千焦耳热量，183千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 104.2千焦以热的形式释放千焦以热的形式释放厌氧：产生厌氧
15、：产生22.6千焦耳热量，千焦耳热量，9.6千焦耳转变为高能化合物千焦耳转变为高能化合物 13千焦以热的形式释放千焦以热的形式释放二个例子中转化为高能化合物分别为二个例子中转化为高能化合物分别为63.7和和42.6l 培养过程中生物热的产生具有强烈的时培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。间性。生物热大小与呼吸作用强弱有关生物热大小与呼吸作用强弱有关在培养初期，在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。呼吸作用缓慢，产生热量较少。菌体在对数生长期时菌体在对数生长期时，菌体繁殖迅速，呼，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热吸作用激烈
16、，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。量多，温度上升快，必须注意控制温度。2 2、搅拌热、搅拌热Q Q搅拌搅拌 在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅在机械搅拌通气发酵罐中，由于机械搅拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，拌带动发酵液作机械运动，造成液体之间，液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观液体与搅拌器等设备之间的摩擦，产生可观的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下的热量。搅拌热与搅拌轴功率有关，可用下式计算：式计算：Q搅拌搅拌P8604186.8（焦耳（焦耳/小时）小时）P搅拌轴功率搅拌轴功率 4186.8机械能转变为热能的热功当量机械能转变为热能的热功当量3 3、
17、蒸发热、蒸发热Q Q蒸发蒸发 通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量的热量叫蒸发热。此外，排气也会带走部分热量叫显热叫显热Q显热显热，显热很小，一般可以忽略不计。，显热很小，一般可以忽略不计。4 4、辐射热、辐射热Q Q辐射辐射发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温热通过罐体向外辐射。辐射热的大小取决于罐温与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般与环境的温差。冬天大一些，夏天小一些，一般不超过发酵热的不超过发酵热的5。
18、Q发酵发酵Q生物生物Q搅拌搅拌Q蒸发蒸发Q辐射辐射发酵热的测定发酵热的测定有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进有二种发酵热测定的方法。一种是用冷却水进出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过出口温度差计算发酵热。在工厂里，可以通过测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每测量冷却水进出口的水温，再从水表上得知每小时冷却水流量来计算发酵热。小时冷却水流量来计算发酵热。Q发酵发酵GCm(T出出T进进)Cm水的比热水的比热G冷却水流量冷却水流量另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发另一种是根据罐温上升速率来计算。先自控，让发酵液达到某一温度，然后停止加热或冷却，使罐温酵液达到某一温度，然后停
19、止加热或冷却，使罐温自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵自然上升或下降，根据罐温变化的速率计算出发酵热。热。附二、附二、发酵过程的发酵过程的pHpH控制控制 pH是微生物代谢的综合反映，又影响代是微生物代谢的综合反映，又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。谢的进行，所以是十分重要的参数。发酵过程中发酵过程中pH是不断变化的，通过观是不断变化的，通过观察察pH变化规律可以了解发酵的正常与变化规律可以了解发酵的正常与否否一、发酵过程一、发酵过程pHpH变化的原因变化的原因 1 1、基质代谢、基质代谢（1）糖代谢）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇
20、，使子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，下降。糖缺乏，pH上升，是补料上升，是补料的标志之一的标志之一（2）氮代谢）氮代谢 当氨基酸中的当氨基酸中的-NH2被利用后被利用后pH会下会下降；尿素被分解成降；尿素被分解成NH3，pH上升，上升，NH3利用后利用后pH下下降，当碳源不足时氮源当碳源利用降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。上升。（3）生理酸碱性物质利用后）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降会上升或下降2 2、产物形成产物形成 某些产物本身呈酸性或碱性某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液，使发酵液pH变变化。如有机酸类产生使化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁下降，红霉素、洁霉素、螺旋
21、霉素等抗生素呈碱性，使霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。上升。3 3、菌体自溶菌体自溶，pH上升，发酵后期，上升，发酵后期，pH上升。上升。二、二、pHpH对发酵的影响对发酵的影响（1）pH影响酶的活性。影响酶的活性。当当pH值抑制菌体值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行代谢的进行（3）pH值影响培养基某些成分和中
22、间代谢物值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离的解离，从而影响微生物对这些物质的利用从而影响微生物对这些物质的利用（4）pH影响代谢方向影响代谢方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉例如黑曲霉在在pH23时发酵产生柠檬酸，在时发酵产生柠檬酸，在pH近近中性时，则产生草酸。中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨乙酰谷氨酰胺酰胺三、三、pHpH在
23、微生物培养的不同阶段有不同在微生物培养的不同阶段有不同的影响的影响 生长生长合合成成pH对菌体生长影响比产物合成影响小对菌体生长影响比产物合成影响小例例 青霉素：菌体生长最适青霉素：菌体生长最适pH3.56.0,产物合成最适产物合成最适pH7.27.4 四环素：菌体生长最适四环素：菌体生长最适pH6.06.8，产物合成最适，产物合成最适pH5.86.0XpH四环素四环素四、四、pHpH的控制的控制 1 1、调节好基础料的、调节好基础料的pHpH。基础料中若含基础料中若含有玉米浆，有玉米浆，pH呈酸性，必须调节呈酸性，必须调节pH。若要控制利用后若要控制利用后pH在在6.0，利用前，利用前pH往
24、往往要调到往要调到6.56.82 2、在基础料中加入维持、在基础料中加入维持pHpH的物质的物质，如如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等酸缓冲液等3 3、通过补料调节、通过补料调节pHpH 在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调料与调pH没有矛盾时采用补料调没有矛盾时采用补料调pH如（如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH (2)当当NH2-N低，低，pH低时补氨水；低时补氨水；当当NH2-N低，低，pH高时补高时补(NH4)2SO44 4、当补料与调、当补料与调p
25、HpH发生矛盾时，加酸碱发生矛盾时，加酸碱调调pHpH 溶氧溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。素。附三、发酵过程中氧的控制25，一个大气压下，空气中氧在水中溶解度为，一个大气压下，空气中氧在水中溶解度为0.25mmolO2/L 在培养液中为在培养液中为0.2mmolO2/L最适氧浓度最适氧浓度临界氧浓度最低要求临界氧浓度最低要求 0.0030.005mmolO2/L描述微生物需氧的物理量描述微生物需氧的物理量比耗氧速度或呼吸强度（比耗氧速度或呼吸强度
26、（QO2）：单位时间内单位体积）：单位时间内单位体积重量的细胞所消耗的氧气，重量的细胞所消耗的氧气，mmol O2g菌菌-1h-1 摄氧率摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmol O2L-1h-1。r=QO2.X（三）发酵过程的控制一般策略：前期有利于菌体生长，中后期有利于产物的合成溶氧控制的一般策略：前期大于临溶氧浓度，中后期满足产物的形成。2、溶氧控制的实例、溶氧控制的实例GAXDO谷氨酸发酵谷氨酸发酵：要求：氧饱和度要求：氧饱和度1控制：控制：0-12小时小时 小通风小通风 12小时后小时后 增加通风增加通风原因：原因：0-
27、12小时菌体小时菌体量较小，采用小通风量较小，采用小通风12 一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。定要把握好。例：例：生产肌苷酸：生产肌苷酸：通气量不变通气量不变 17.15 mg/ml24小时增加小时增加 22.55 mg/ml30小时增加小时增
28、加 18.25 mg/ml36小时增加小时增加 12.34 mg/ml表15-4通常后处理的主要步骤、技 术和产品质量 间歇补料操作间歇补料操作连续补料操作连续补料操作循环分批操作循环分批操作指数速率补料培养指数速率补料培养恒速补料操作恒速补料操作变速补料培养变速补料培养分批培养分批培养补料分批培养补料分批培养连续培养连续培养循环间歇补料操作循环间歇补料操作循环连续补料操作循环连续补料操作补料分批培养的优缺点补料分批培养的优缺点优点优点 在这样一种系统中可以维持低的在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。补料速率，稳定最佳生产工艺。缺点缺点 由于没有物料取出，产物的积累最由于没有物料取出，产物的积累最终导致比生产速率的下降。由于有物料的终导致比生产速率的下降。由于有物料的加入增加了染菌机会加入增加了染菌机会表15-7固态发酵生产的实例表15-8固态发酵与液态发酵相比的优、缺点
