1、 第十四章DNA的生物合成的生物合成The Replication of DNA 新陈代谢和遗传变异新陈代谢和遗传变异是生命的两个基本特是生命的两个基本特征。征。DNA是生物遗传信息的携带者，并且可以是生物遗传信息的携带者，并且可以进行自我复制（进行自我复制（self-replication），也正因），也正因为如此，才保证了在细胞分裂时，亲代细胞的为如此，才保证了在细胞分裂时，亲代细胞的遗传信息正确无误地传递到两个子代细胞中。遗传信息正确无误地传递到两个子代细胞中。这种以亲代这种以亲代DNA分子为模板合成两个完全分子为模板合成两个完全相同的子代相同的子代DNA分子的过程称为复制分子的过程称为
2、复制（replication）。）。遗传的中心法则遗传的中心法则nDNA通过复制将遗传信息加倍，再分裂通过复制将遗传信息加倍，再分裂是均分给两个子代细胞，在子代中通过是均分给两个子代细胞，在子代中通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型，是子代分子，从而决定生物的表现型，是子代具有和亲代相同或相近的性状。具有和亲代相同或相近的性状。DNA的的复制、转录和翻译过程就构成了复制、转录和翻译过程就构成了遗传学遗传学的中心法则的中心法则。n在在RNA病毒中，其遗传信息贮存在病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中，遗传信息的流向是分子中，遗传信息的
3、流向是RNA通过复通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给过反转录将遗传信息传递给DNA，再由，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质。通过转录和翻译传递给蛋白质。DNA dependent DNA polymeraseDDDPDNA dependent RNA polymeraseDDRPRNA dependent RNA polymeraseRDRPRNA dependent DNA polymeraseRDDP 复复制制（D DD DD DP P）转转录录（D DD DR RP P）翻翻译译 D DN NA A R RN NA A
4、蛋蛋白白质质 反反转转录录（R RD DD DP P）R RN NA A 复复制制（R RD DR RP P）中心法则中心法则 DNA的双螺旋结构是复制的结构基础，的双螺旋结构是复制的结构基础，碱基互补配对原则是遗传信息传递真实性的碱基互补配对原则是遗传信息传递真实性的保证。保证。第一节第一节 DNA复制的特点复制的特点 一、半保留复制一、半保留复制 DNA在复制时，以亲代在复制时，以亲代DNA的每一的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子股作模板，合成完全相同的两个双链子代代DNA，每个子代，每个子代DNA中都含有一股亲中都含有一股亲代代DNA链，这种现象称为链，这种现象称为DNA的半保留的
5、半保留复制复制(semi-conservative replication)。12半保留复制nDNA以半保留方式进行复制，是在以半保留方式进行复制，是在1958年由年由M.Meselson 和和 F.Stahl 所完成的实验所证明。所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含该实验首先将大肠杆菌在含15N（NH4CI 重氮）重氮）的培养基中培养约十五代，的培养基中培养约十五代，使其使其DNA中的中的碱基碱基氮氮均转变为均转变为15N。n将大肠杆菌移至将大肠杆菌移至只含只含14N（NH4CI 轻氮）的培轻氮）的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DN
6、A，作密度梯度离心，作密度梯度离心，可得到下列结果：可得到下列结果：半保留复制的证明 266页 19561956年年 KornbergKornberg在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNADNA的合成，证明的合成，证明DNADNA的复制是一个非常复杂的过程，包含着许的复制是一个非常复杂的过程，包含着许多种酶的参与。多种酶的参与。获得了获得了19591959年的诺贝尔奖年的诺贝尔奖)19581958年年 MeselsonMeselson和和StahlStahl用用1515N N同同位素标记及密度梯度超速离心证明位素标记及密度梯度超速离心证明DNADNA复制是一种半
7、保留复制。复制是一种半保留复制。出现上述三条带结果与半保留复制模式假设出现上述三条带结果与半保留复制模式假设是完全符合的。是完全符合的。HHHHL L15NH4CI中培养的DNA14NH4CI中培养的第一代DNA14NH4CI中培养的第二代DNA亲代第一代第二代n DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些在复制时，需在特定的位点起始，这是一些 具有特定核苷酸排列顺序（特定的位点）的片段，具有特定核苷酸排列顺序（特定的位点）的片段，即即 复制起始点（复制原点复制起始点（复制原点 ori）。n 在在DNA复制时，两条亲代链在复制起点处部分分复制时，两条亲代链在复制起点处部分分开，此时形成一种开
8、，此时形成一种动态的动态的Y字型字型结构，称之结构，称之复制叉，复制叉，即复制正在发生的部位，同时进行着解链和合成。n 在原核生物中，复制起始点通常为在原核生物中，复制起始点通常为一个一个，而在真而在真核生物中则为核生物中则为多个多个，如果蝇，如果蝇6000个个复制原点复制原点。二、复制过程中的一些基本要点二、复制过程中的一些基本要点（一）复制起始点（一）复制起始点（二）（二）复制终止点复制终止点n在复制子的末端，由一段特殊的序列，称为复制的终止位点（ter），完成复制的终止。n由一个复制起始点进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制，即复制单位。n对于双向复制的DNA来说，复制子是指从
9、一个复制起始点开始向两端逐渐扩大。一个复制子就是一个复制子就是DNADNA上的上的一个独立复一个独立复制制DNADNA单位（单位（DNADNA复制的功能单位）复制的功能单位）。一个复制子只含有一个一个复制子只含有一个专一的复制起专一的复制起点和复制结束的终点点和复制结束的终点。一个完整的复制子在一个完整的复制子在一个细胞周期只一个细胞周期只复制复制一次一次(真核真核)（曼夫332）。原核生物可以连续起始复制。真核生物往往采用更多的复制原点。(三三)复制子复制子 DNA复制单位亦称为复制单位亦称为在环形在环形DNA中，整个结构象字母中，整个结构象字母 在电镜下观察犹如一只眼睛，在电镜下观察犹如一
10、只眼睛，称为复制眼。对于环状称为复制眼。对于环状DNA，复制眼使其成为复制眼使其成为结构。结构。n 染色体染色体DNA复复制方式（真核生制方式（真核生物）物）n 多复制子复制多复制子复制，即，即DNA上先形成多个上先形成多个复制眼，双向复制。复制眼，双向复制。“眼眼”扩大互相相扩大互相相连，形成连，形成“大眼睛大眼睛”最后完成整个最后完成整个DNA的复制，形成两个的复制，形成两个DNA分子分子 原核生物原核生物染色体和质粒都是染色体和质粒都是独立独立（只有（只有单一个）复制子；单一个）复制子；真核细胞真核细胞染色体中有染色体中有多个多个复制子组成。复制子组成。在环型E.coli的染色体双向复制
11、，复制的终止位点是在两个复制叉的会合处，即在复制起点对面的终止点（曼夫335页）。（四）需要引物（四）需要引物 n参与参与DNA复制的复制的DNA聚合酶，必须以一聚合酶，必须以一段具有段具有3端自由羟基（端自由羟基（3-OH）的）的RNA作为引作为引物物(primer)，才能开始聚合子代才能开始聚合子代DNA链。链。nRNA引物的大小，在原核生物中通常为引物的大小，在原核生物中通常为510个核苷酸个核苷酸，RNA引物的碱基顺序，引物的碱基顺序，与其模板与其模板DNA的碱基顺序相配对。的碱基顺序相配对。DNARNA引物AUTOH5 5每一DNA片段都有自己的RNA的引物 复制正在发生的位点（复制
12、叉）35 3A（五）复制的方向性（五）复制的方向性 （1）单向复制,也可以是双向复制 复制有固定的起始点，从起始点开始，可以是单向复制也可以是双向复制n 单向复制单向复制：即只形成一个复制叉（：即只形成一个复制叉（replication fork）n 双向复制双向复制：即形成：即形成两个复制叉两个复制叉。如。如E.coliDNA等。等。都是都是5 33 方向合成方向合成原核生物原核生物 （2）复制的5 3方向 从原点开始，新链合成的方向：5 3方向，造成DNA复制中一股链是不连续的 半不连续复制半不连续复制 （六）半不连续复制（六）半不连续复制 复制过程中，催化复制过程中，催化DNA DNA
13、合成的合成的DNADNA聚合酶聚合酶只能催化核苷酸从只能催化核苷酸从5 5 33 方向合成。方向合成。以以3 3 5 5 链链为模板时，新生的为模板时，新生的DNADNA以以5 5 33 方向连续合成；方向连续合成；以以5 5 33 为模板只能合成若干为模板只能合成若干反向互补的反向互补的冈崎片段冈崎片段（？）（？），这些片段再相连成完整的，这些片段再相连成完整的新链，故称新链，故称半不连续复制半不连续复制。冈崎片段n 日本科学家Okazaki（冈崎）用实验证明在复制过程中产生了这种小片段，所以这些片段被命名为冈崎片断。n 顺着解链方向合成的子链，复制是连续进行的，这股链称为前导链这股链称为前
14、导链(leading(leading strand)strand)。n 另一股新链的复制方向与解链方向相反，复制是不连续进行的，这条不连续合成的链称为随从链(lagging strand)(lagging strand)。冈崎片段在原核生物中约为1000 个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。前导链和后随链后随链后随链前导链前导链冈崎片段冈崎片段复制叉前进的方向复制叉前进的方向 方向？方向？第二节第二节 参与参与DNA复制的复制的 主要酶类与蛋白因子主要酶类与蛋白因子 一、原核生物一、原核生物 复习两点复习两点 1.底物（原料）底物（原料）DNA复制是以四种脱氧核糖核苷酸为底物，即复制是
15、以四种脱氧核糖核苷酸为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi 聚合反应机理聚合反应机理5 3 OPGOPA模板链CTA35引 物3355OHOPGOPAOOHTP模板链CTA35引 物333555POOHTPP35PPi 2.模板模板(template)nDNA复制是模板依赖性的，必须要以亲复制是模板依赖性的，必须要以亲代代DNA链作为模板。链作为模板。n亲代亲代DNA的两股链解开后，可分别作为的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。模板进行复制。（一）引发酶（一）引发酶（primase）（引物合）（引物合成酶）成酶）分子量约为分子
16、量约为60kDa的单肽链，每个细胞约有的单肽链，每个细胞约有50-100个分子，该酶单独存在时活性低，只有与个分子，该酶单独存在时活性低，只有与其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活其他蛋白质相互作用结合成一个复合体时才有活性，性，这种复合体称为引发体（这种复合体称为引发体（primosome）。）。合成的引物是长约合成的引物是长约5-10个核苷酸的个核苷酸的RNA。一。一旦旦RNA引物合成，就可以由引物合成，就可以由DNA聚合酶聚合酶在它的在它的3-OH上继续催化上继续催化DNA新链的合成。新链的合成。（引发体（引发体(primosome)由引发前体与引物酶（由引发前体与引物酶（prim
17、ase）组装而成。）组装而成。引发前体引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。）是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。）引物酶本质上是一种依赖引物酶本质上是一种依赖DNA的的RNA聚合酶（聚合酶（DDRP），），该酶以该酶以DNA为模板，为模板，聚合一段聚合一段RNA短链引物短链引物(primer)，以提供，以提供自由的自由的3-OH，使子代，使子代DNA链能够开始聚链能够开始聚合。合。引物酶（引物酶（primase）功能：以功能：以DNA为模板，催化合成一为模板，催化合成一小段与小段与DNA互补的互补的RNA，即引物。引物：，即引物。引物：510个核苷酸个核苷酸（二）（二）DNA聚合酶聚合酶(
18、DDDP)n在大肠杆菌中，目前发现的在大肠杆菌中，目前发现的DNA聚合酶聚合酶（DNA polymerase）有三种有三种：DNA聚合酶聚合酶（pol）DNA聚合酶聚合酶（pol）DNA聚合酶聚合酶（pol）这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。n参与参与DNA复制的主要复制的主要是是poll 和和pol。DNA聚合酶是以聚合酶是以DNA为模板，催为模板，催化底物（化底物（dNTP）合成）合成DNA的酶类，普的酶类，普遍存在于生物体内。遍存在于生物体内。它们的作用方式基本相同它们的作用方式基本相同:都需要都需要dNTP、Mg2+、模板、模板DNA和引物
19、。和引物。在在DNA模板指导下，催化底物加模板指导下，催化底物加到引物的到引物的3-OH上，形成上，形成3，5磷酸二磷酸二酯键，由酯键，由53方向延长方向延长DNA链。引链。引物是物是DNA合成所必需的。合成所必需的。DNA聚合酶聚合酶 Arthur Kornberg于于1957年分离出年分离出来，因此来，因此获得获得1959年的若贝尔奖。年的若贝尔奖。分离工作十分艰巨，用了分离工作十分艰巨，用了100kg细菌细菌分离到分离到500mg的纯酶（的纯酶（polymerase），），或称或称Kornberg酶。酶。它是一个多功能酶。它是一个多功能酶。原核生物中的三种原核生物中的三种DNA聚合酶聚合
20、酶 n p po ol l p po ol l p po ol l 5 5 3 3 聚聚合合酶酶活活性性 +5 5 3 3 外外切切酶酶活活性性 +-3 3 5 5 外外切切酶酶活活性性 +生生理理功功能能 去去除除引引物物 未未知知 D DN NA A复复制制 修修复复损损伤伤 校校正正错错误误 校校正正错错误误 填填补补缺缺口口 又称又称校对校对作用作用 pol npol 由十种亚基组成由十种亚基组成，其中其中亚基具有亚基具有53聚合聚合DNA的酶活性，的酶活性，因而具有复制因而具有复制DNA的的功 能，每 分 钟 速 度功 能，每 分 钟 速 度6000个碱基。个碱基。n亚基亚基具有具有
21、35外切外切酶 的 活 性，因 而 与酶 的 活 性，因 而 与DNA复制的校正功能复制的校正功能有关。有关。教材261页，曼夫331页文字 DNA聚合酶的校对作用聚合酶的校对作用曼夫曼夫330页文字页文字 DNA DNA连接酶连接酶(DNA ligase(DNA ligase)可催化两段可催化两段DNADNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNADNA连连接起来。接起来。DNADNA连接酶催化的条件是：连接酶催化的条件是：需一段需一段DNADNA片段具有片段具有3-OH3-OH，而另一，而另一段段DNADNA片段具有片段具有5-Pi5-Pi基；基；未封闭的
22、缺口位于双链未封闭的缺口位于双链DNADNA中，即其中，即其中有一条链是完整的；中有一条链是完整的；需要消耗能量，在原核生物中由需要消耗能量，在原核生物中由NADNAD+供能，在真核生物中由供能，在真核生物中由ATPATP供能。供能。（三）（三）DNA连接酶连接酶 DNA连接酶连接酶（ligase）功能：将复制过程中形成的功能：将复制过程中形成的DNA片段用片段用3 5磷酸磷酸 二二酯键连接起来酯键连接起来。ATGCATGCPPOHPATGCATGCPPPATP 或NADPPi 或NMNAMPAMP酶ATGCATGPPOHCPP核糖腺嘌呤酶酶（部分细菌）单链单链DNA结合蛋白（结合蛋白（sin
23、gle strand binding protein，SSB）又称螺旋降稳蛋白（又称螺旋降稳蛋白（HDP）。能）。能够与单链够与单链DNA结合的蛋白质因子，结合的蛋白质因子，其作用为：其作用为：使解开双螺旋后的使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，单链能够稳定存在，即稳定单链即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代，便于以其为模板复制子代DNA；防止防止DNA链重新结合。链重新结合。保护单链保护单链DNA，避免核酸酶的降解。，避免核酸酶的降解。（四）（四）单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 （五）（五）DNA解螺旋酶解螺旋酶(helicase)（解链酶）（解链酶）功能：功能：DNA的双螺旋解链的
24、双螺旋解链（解（解DNA双链），解开一双链），解开一对碱基，需对碱基，需2分子分子ATP，作用点：作用点：DNA上局部单链上局部单链处，向双链方向解链。处，向双链方向解链。5353rep 要将要将DNA双链解开，主要依赖于双链解开，主要依赖于DNA解旋酶（也称为解链酶）。解旋酶（也称为解链酶）。蛋白因子：蛋白因子：还需要参与起始反应的多种蛋白因子，还需要参与起始反应的多种蛋白因子，如如DnaA。DnaA能够能够识别大肠杆菌复制原识别大肠杆菌复制原点点OriC富含富含A/T的的3个个13个个bp的重复序列的重复序列区区，使双链，使双链DNA连续变性，启动解链过程。连续变性，启动解链过程。附附:原
25、核生物复制起始点的结构原核生物复制起始点的结构nE.coliE.coli的复制起点的复制起点OriOri大约长大约长245bp245bp，它是决定和，它是决定和控制控制E.coliE.coli染色体复制的唯一片段。染色体复制的唯一片段。（介绍）介绍）n包括两个关键序列（包括两个关键序列（二个必需区域二个必需区域：13bp13bp的序列的序列和和9bp9bp序列序列 9bp9bp重复序列重复序列，重复出现重复出现4 4次，能与起始蛋次，能与起始蛋白白dnaAdnaA特异结合特异结合，当当dnaAdnaA蛋白（约蛋白（约2020种）结合于种）结合于oriori的的4 4个部位上时个部位上时复制开始
26、复制开始。对于对于DNADNA复制的起始复制的起始十分重要十分重要,有利于有利于双螺旋双螺旋DNADNA局部解旋局部解旋并暴露两条并暴露两条复制模板链。复制模板链。dnaAdnaA蛋白还能识别蛋白还能识别 另一另一3 3个连续出个连续出现的现的13bp13bp序列区序列区，每一个顺序都由每一个顺序都由GATCGATC开始，开始，富含富含A A和和T T，有助于螺旋解开有助于螺旋解开，控控制复制何时开始。制复制何时开始。dnaAdnaA蛋白（一种专一的蛋白）和蛋白（一种专一的蛋白）和oriori结合后，双螺旋解开形成复制叉。结合后，双螺旋解开形成复制叉。故故dnaAdnaA蛋白与启动解链有关蛋白
27、与启动解链有关（曼夫（曼夫332332页），页），dnaAdnaA蛋白是起始的关键成分。蛋白是起始的关键成分。DNA复制的起始 ()666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666666661111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111188888888888888888888888888888888888888888888888888888888888888889999999999999999999999999999999999999999
28、9999999999999999999999 999大肠杆菌大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列复制起点成串排列的重复序列GATCTNTTNTTT成串排列的成串排列的三个三个13bp序列序列共有序列共有序列共有序列共有序列TTATCCACA DnaA蛋白结合位点蛋白结合位点四个四个9bp序列序列n 因随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部因随着复制叉的前进，将引起整个分子非复制部分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。分旋转的更紧出现正超螺旋，以致复制叉无法前进。n 作用作用：它能够使：它能够使DNA产生拓扑学上的种种变化。产生拓扑学上的种种变化。最常见的是产生最常见的是产生负超螺旋和消
29、除超螺旋。负超螺旋和消除超螺旋。n 可使可使DNA双链中的一或二条链切断，松开双螺双链中的一或二条链切断，松开双螺旋后再将旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。链连接起来，从而避免出现链的缠绕。维持双螺旋维持双螺旋DNA必须是负超螺旋状态。必须是负超螺旋状态。（六）拓扑异构酶（六）拓扑异构酶（topoisomerase）（DNA促旋酶）促旋酶）曼夫曼夫333图与图与 周书周书199一致一致 老片老片DNA拓扑异构酶拓扑异构酶 有有和和两种类型两种类型 型拓扑异构酶型拓扑异构酶:首先在大肠杆菌中被发现，首先在大肠杆菌中被发现，称为称为拓扑异构酶拓扑异构酶，可使，可使DNA的一条链发生断
30、裂的一条链发生断裂和再连接，反应无需供给能量，和再连接，反应无需供给能量，DNA复制时复制时消消除负超螺旋，除负超螺旋，(而后解链酶再解双螺旋而后解链酶再解双螺旋,我我)但它对正超螺旋无作用。但它对正超螺旋无作用。型拓扑异构酶型拓扑异构酶(旋转酶旋转酶;gyrase）由两个由两个A亚基和两个亚基和两个B亚基组成，即亚基组成，即A2B2。它能使。它能使DNA的两条链同时发生断裂的两条链同时发生断裂和再连接；和再连接；消除复制叉前进带来的扭曲张消除复制叉前进带来的扭曲张力（正超螺旋力（正超螺旋)，引入负超螺旋，需要由，引入负超螺旋，需要由ATP提供能量。提供能量。两种拓扑异构酶在两种拓扑异构酶在D
31、NA复制、转录和复制、转录和重组中均发挥重要作用重组中均发挥重要作用。端粒酶特点端粒酶特点（真核生物）（真核生物）是一种核糖核蛋白酶，是一种特殊的是一种核糖核蛋白酶，是一种特殊的DNA聚合酶，聚合酶，属于反转录酶。由属于反转录酶。由RNA和蛋白质和蛋白质构成，构成，以其中一段以其中一段RNA序列为模板，通过延伸染序列为模板，通过延伸染色体的色体的3端解决端解决DNA复制时引起的末端隐缩。复制时引起的末端隐缩。端粒酶端粒酶RNA亚单位的结构在不同真核生物亚单位的结构在不同真核生物之间差别很大。其蛋白质组分至少有两个以上多之间差别很大。其蛋白质组分至少有两个以上多肽亚单位组成。肽亚单位组成。端粒酶
32、能把端粒序列加到染色体末端，端粒酶能把端粒序列加到染色体末端，以补充染色体末端的自然丢失。以补充染色体末端的自然丢失。在缺乏在缺乏有效延伸机制时，端粒在历经每次细胞有效延伸机制时，端粒在历经每次细胞分裂之后即缩短。分裂之后即缩短。端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 TTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒
33、合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAACCCC AAAACCCC AAAACCCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸 第三节第三节 DNA复制过程复制过程（综合上述）（综合上述）（一）（一）DNA复制的起始点和方向复制的起始点和方向 在大肠杆菌的环状染色体在大肠杆菌的环状染色体DNA中，只有一中，只有一个复制原点，因此是个复制原点，因此是单复制子单复制子。复制方向
34、大多是双向的，即分别向两侧进行复制方向大多是双向的，即分别向两侧进行复制，形成两个复制叉复制，形成两个复制叉（replication fork）或称）或称为生长点（为生长点（growing point）。也有一些生物也有一些生物DNA的复制是单向的，只形成的复制是单向的，只形成一个复制叉。一个复制叉。通常复制是对称的，两条链同时进行复制。通常复制是对称的，两条链同时进行复制。有些则是不对称的，一条链复制后再进行另一条链的复制。有些则是不对称的，一条链复制后再进行另一条链的复制。（二）复制的主要阶段（二）复制的主要阶段 1.DNA双螺旋的解开双螺旋的解开 (1)在大肠杆菌中，解链酶在复制叉内在大
35、肠杆菌中，解链酶在复制叉内解开亲代双螺旋解开亲代双螺旋;(2)拓扑异构酶拓扑异构酶II作用作用 不论线状或环状不论线状或环状DNA分子，局部解链会分子，局部解链会导致超螺旋应力的增加，阻碍解链的前进。导致超螺旋应力的增加，阻碍解链的前进。因此必须放出超螺旋应力。在大肠杆菌中是因此必须放出超螺旋应力。在大肠杆菌中是由由拓扑异构酶拓扑异构酶II，即旋转酶切开环状超螺旋，即旋转酶切开环状超螺旋的两股，释放出超螺旋应力，的两股，释放出超螺旋应力，而后再封口，而后再封口，除去环状除去环状DNA分子中的超螺旋。分子中的超螺旋。(3)单链单链DNA结合蛋白结合蛋白 由拓扑异构酶和解由拓扑异构酶和解螺旋酶作用
36、，使酶作用，使DNA的的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链形成两条单链DNA。单链单链DNA结合蛋白结合蛋白（single strand binding protein，SSB）结合在结合在 两条单链两条单链DNA上，形成复制叉。上，形成复制叉。防止链内退火重新复性防止链内退火重新复性成为双链，使局部解开的两条单链可以作为复成为双链，使局部解开的两条单链可以作为复制模板。制模板。2.RNA引物的合成引物的合成 在合成在合成DNA链之前链之前合成一段引物合成一段引物。引物就是在引物就是在DNA模板链上装配的一小段互补模板链上装配的一小段互
37、补RNA，而末端有一个游离的，而末端有一个游离的3-OH。DNA聚合酶只能把底物（聚合酶只能把底物（dNTP）转移到引）转移到引物游离的物游离的3-OH上去。上去。1.半不连续复制半不连续复制(semicontinuous replication)前导链（领头链）和滞后链（随前导链（领头链）和滞后链（随从链）合成从链）合成由由DNADNA聚合酶聚合酶催化，酶催化，酶进入复制叉在引物上延伸，以进入复制叉在引物上延伸，以3535方向的亲代方向的亲代DNADNA链为模板，从链为模板，从5353方向聚合子代方向聚合子代DNADNA链。链。（二）复制的延伸（长）（二）复制的延伸（长）（1）DNA酶酶作用
38、作用（2）在引物上加入底物）在引物上加入底物 dNTP（3）方向）方向 5 3（4）半不连续性复制）半不连续性复制 前导链和后随链后随链后随链前导链前导链冈崎片段冈崎片段复制叉前进的方向复制叉前进的方向 方向？方向？先导链与后随链的矛盾如何解决？先导链与后随链的矛盾如何解决？根据计算，每一复制叉仅含根据计算，每一复制叉仅含1个个DNA聚合酶聚合酶全酶，全酶，这说明前导链和随后链这说明前导链和随后链上的上的DNA合成是由同一复制体负责的。合成是由同一复制体负责的。但但DNA两股链上的两股链上的DNA合成合成不是同步不是同步进进行的，并且方向相反，那么复制体是怎行的，并且方向相反，那么复制体是怎样
39、工作的呢？样工作的呢？为此为此提出了模型认为：提出了模型认为：当当前导链上前导链上开始开始DNA合成和复制叉向前移动时，合成和复制叉向前移动时，随随后链即向后后链即向后回折成环回折成环。5533355335回环模型回环模型2.引发体移动引发体移动n 引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行引物，继续进行链的延长。链的延长。（三）复制的终止（三）复制的终止 在单方向复制的环状分子中，在单方向复制的环状分子中，复制的终点就复制的终点就是它的复制原点，是它的复制原点，在双方向复制的环状分子
40、中，在双方向复制的环状分子中，大多数是两个生长点的简单碰撞。大多数是两个生长点的简单碰撞。1.去除引物，填补缺口去除引物，填补缺口 2.连接冈崎片段连接冈崎片段 1.去除引物，填补缺口去除引物，填补缺口 在原核生物中，由在原核生物中，由DNA聚合酶聚合酶来水解去来水解去除除RNA引物，并由引物，并由该酶该酶催化延长引物缺口处的催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。在真核生物中，在真核生物中，RNA引物的去除，由一种引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚聚合酶来延长。合酶来延长。在在D
41、NA连接酶的催化下，形成最后一个磷连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。长链。复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚聚合酶合酶III解链酶解链酶RNA引物引物引物体引物体DNA聚聚合酶合酶ISSB3 3 5 前导链前导链随后链随后链3 5 复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5 RNA引物引物3 3 为保证复制的准确性，细胞以下列机为保证复制的准确性，细胞以下列机制提供相应的保障：制提供相应的保障：DNA聚合酶聚合酶和和的的53的的聚合作用聚合作用 DNA聚合酶聚合
42、酶和和在模板引导下，按在模板引导下，按53进行进行DNA聚合时，可以严格按照碱聚合时，可以严格按照碱基互补配对的原则进行合成，所以说，碱基互补配对的原则进行合成，所以说，碱基互补配对原则是基互补配对原则是 DNA复制的基础复制的基础。三、三、DNA复制的保真性复制的保真性 DNA聚合酶35外切酶活性 DNA聚合酶聚合酶可对已经加上去的核可对已经加上去的核苷酸进行校对，苷酸进行校对，当新合成的互补链上有当新合成的互补链上有错误的核苷酸时，错误的核苷酸时，即行使即行使35外切酶外切酶活性，将连接上的错误核苷酸从活性，将连接上的错误核苷酸从3端切端切除，直至正确配对处为止，然后再继续除，直至正确配对
43、处为止，然后再继续合成。合成。切除引物切除引物 由于刚开始聚合时较易发生错由于刚开始聚合时较易发生错配，所以生命体选择先合成一段配，所以生命体选择先合成一段RNA引物，然后由引物，然后由DNA聚合酶聚合酶的的53外切外切酶活性将引物切除，酶活性将引物切除，再由再由DNA聚合酶的聚合酶的53聚合酶活聚合酶活性在切除引物处补平。性在切除引物处补平。聚合时的方向聚合时的方向 现在已知现在已知DNA的聚合都是的聚合都是53，为，为什么不能从什么不能从35端聚合呢？端聚合呢？如果按如果按53聚合，一旦出现碱基错聚合，一旦出现碱基错配，可由配，可由DNA聚合酶聚合酶从从3端切除聚合上端切除聚合上的错误的核
44、苷酸，的错误的核苷酸，剩下剩下3-羟基，后者可以羟基，后者可以接受由以接受由以dNTP为原料而生成的单核苷酸，为原料而生成的单核苷酸，即即dNTP可以和上一个核苷酸的游离可以和上一个核苷酸的游离3-羟羟基生成基生成3，5-磷酸二酯键。磷酸二酯键。dNTP自身水解掉焦磷酸。自身水解掉焦磷酸。遗传物质的复制遗传物质的复制几乎是一个完美几乎是一个完美的过程，一个的过程，一个E.ColiE.Coli的基因组有的基因组有10107 7核核苷酸，苷酸，1/101/101010bpbp（只有一个碱基配错）（只有一个碱基配错）的错配率相当于每的错配率相当于每10001000个细菌细胞，每个细菌细胞，每代只有一
45、个错误碱基的掺入，真核细胞代只有一个错误碱基的掺入，真核细胞同样如此。同样如此。二、二、真核生物真核生物 （了解）（了解）（一）（一）拓扑异构酶拓扑异构酶（topoisomerase）拓扑异构酶拓扑异构酶 分子量约为分子量约为95kDa的单体蛋白。的单体蛋白。虽然它所虽然它所催化的反应与原核生物的酶相似，催化的反应与原核生物的酶相似，但它同样但它同样能使正、负超螺旋能使正、负超螺旋DNA松弛。松弛。松弛作用不依赖于松弛作用不依赖于ATP，能发生于有，能发生于有EDTA存在的条件下，存在的条件下，Mg2+能提高该酶的活能提高该酶的活力。力。（三）端粒酶（三）端粒酶（telomerase）端粒（端
46、粒（telomere）是真核生物线）是真核生物线性染色体末端的特殊结构，性染色体末端的特殊结构，由成百个由成百个6个核苷酸的重复序列所组成（人为个核苷酸的重复序列所组成（人为TTAGGG，四膜虫为四膜虫为TTGGGG）。）。端粒（酶）的功能端粒（酶）的功能 1.稳定染色体的末端结构；稳定染色体的末端结构；2.防止染色体间末端连接；防止染色体间末端连接；3.补偿补偿5-末端在消除末端在消除RNA引引物后造成的空缺。物后造成的空缺。复制可使端粒复制可使端粒5末端缩短，而末端缩短，而端粒酶可外加重复单位到端粒酶可外加重复单位到5-末端上末端上，结果使端粒维持一定的长度。结果使端粒维持一定的长度。端粒
47、酶（端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段。如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清。了澄清。端粒酶是一种含端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，逆转录酶，它能催化互补于它能催化互补于RNA模板模板的的DNA片段的合成片段的合成
48、，使复制以后的线形，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。分子的末端保持不变。初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。认识。5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒酶端粒合成的一种模型端粒合成的一种模型3 5 TTTTGGGGTTTTG5
49、 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3 5 TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3 5 AATTTTG5 3 AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG 整合和整合和杂交杂交移位和移位和再杂交再杂交端粒合成的完成端粒合成的完成TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGTTTT5 3 nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTCCCCT nAA3 TTTTGGGG TTTTGGGG TTTTGGGGT5 3 TTAAAACCCC AAAACCCC AAAAC
50、CCCT n进一步加工进一步加工继续继续延伸延伸 第五节第五节 DNADNA的反转录合成的反转录合成 逆转录逆转录（RNA指导的指导的DNA合成）合成）胞膜蛋白胞膜蛋白双分子层双分子层衣壳蛋白衣壳蛋白RNA (病病毒基因）毒基因）人类免役缺陷病毒人类免役缺陷病毒人类免役缺陷病毒人类免役缺陷病毒（Human immunodeficiency virus HIV)获得性免役缺陷综合获得性免役缺陷综合（Acquired immuno deficiency syndrome,AIDS,艾滋病）艾滋病）（）见我师261页（）RNA病毒病毒病毒颗粒（病毒颗粒（viron）由病毒由病毒RNA基因组和包被在外
