1、青霉素青霉素-87菌种的优化选育菌种的优化选育发表人：王发表人：王 茹茹华北制药股份有限公司华北制药股份有限公司102102车间菌种车间菌种QCQC小组小组20062006年年6 6月月河北省第二十七次河北省第二十七次QCQC小组小组代表会议交流材料代表会议交流材料 概述概述n 20052005年，我车间在青霉素年，我车间在青霉素-87-87菌种的生产菌种的生产中取得了巨大成绩，胜利地完成了股份公司中取得了巨大成绩，胜利地完成了股份公司下达的攻关任务，成本最低降至下达的攻关任务，成本最低降至3939元元/十亿，十亿，而且在多项技术指标中已经赶超国内同行业而且在多项技术指标中已经赶超国内同行业其
2、它厂家。其它厂家。菌种是抗生素生产的基础，其优菌种是抗生素生产的基础，其优劣决定着生产水平的高低，而菌种的优良特劣决定着生产水平的高低，而菌种的优良特性只有通过不断的优化选育才能稳定在一个性只有通过不断的优化选育才能稳定在一个高水平。本课题围绕着高水平。本课题围绕着优化选育青霉素菌种优化选育青霉素菌种展开展开。小组简介小组简介注册注册编号编号2005.7课题课题类型类型攻关型攻关型小组小组人数人数11人人TQMTQM教育教育52h/52h/人人活动活动周期周期2005.1-2005.1-2005.122005.12活动活动次数次数1313次次出勤出勤率率98%98%表表1.1.小组成员一览表小
3、组成员一览表序序号号姓姓 名名年龄年龄职称职称组内分工组内分工1王王 群群32工程师工程师QC组长组长2康自力康自力44技师技师工作实施整理工作实施整理3付应艳付应艳48技师技师工作实施工作实施4王世雯王世雯45技师技师工作实施工作实施5付付 娟娟33技师技师工作实施工作实施6张张 伟伟34技师技师工作实施工作实施7饶阳宾饶阳宾36技师技师工作数据统计工作数据统计8王王 茹茹30中技中技工作实施工作实施9张小双张小双26助工助工实验数据整理实验数据整理10张张 弘弘34高工高工实验进度安排实验进度安排11祁桂玲祁桂玲40主任高工主任高工工艺指导工艺指导小组小组成员成员菌种优化选育工艺流程图菌种
4、优化选育工艺流程图砂土孢子砂土孢子双碟菌落双碟菌落斜面孢子斜面孢子摇瓶接种摇瓶接种摇瓶培养摇瓶培养菌种验证菌种验证n 我车间青霉素的发酵水平与同行业我车间青霉素的发酵水平与同行业其他厂家相比还有很大差距。其他厂家相比还有很大差距。车间方针目标：车间方针目标：优化选育新菌种优化选育新菌种 力争产率力争产率1:1.61:1.6图图1.1.我车间与其他厂家发酵单位对比图我车间与其他厂家发酵单位对比图调查调查结果结果20052005年我车间开始使用年我车间开始使用-87-87菌种，生产水平稳步提高，菌种，生产水平稳步提高，1-61-6月份平均发酵单位月份平均发酵单位5997159971u u/mlml
5、，但与国内其他厂家相比，但与国内其他厂家相比，还存在不小差距。还存在不小差距。52000520005400054000560005600058000580006000060000620006200064000640006600066000680006800005-1月05-1月2月2月3月3月4月4月5月5月6月6月哈药哈药华星华星鲁抗鲁抗川药川药平均单位平均单位:59971平均单位平均单位:62959调查调查1 120052005年上半年车间月平均发酵单位情况年上半年车间月平均发酵单位情况 调查调查结果结果青霉素青霉素-87-87菌种的孢子形态杂，弱孢子比例偏多，而且菌种的孢子形态杂，弱孢子
6、比例偏多，而且菌落的放射线纹发散，说明菌种高产基因并没有得到充菌落的放射线纹发散，说明菌种高产基因并没有得到充分体现分体现.因此要想完成车间的攻关目标，就必须因此要想完成车间的攻关目标，就必须对青霉素对青霉素-87-87菌种进行优化选育。菌种进行优化选育。图图2.孢子镜检形态孢子镜检形态图图3.菌落形态菌落形态调查调查2 2孢子显微镜和菌落形态观察孢子显微镜和菌落形态观察 59971611705900059000600006000061000610006200062000发酵发酵单位单位u/mlu/ml活动前活动前目标值目标值2%2%目标值确定依据：目标值确定依据：在保证产品质量和收在保证产品
7、质量和收率的前提下，青霉素率的前提下，青霉素生产菌种发酵水平必生产菌种发酵水平必须较原菌种提高须较原菌种提高2%2%以以上，方可鉴定升级为上，方可鉴定升级为新菌种新菌种。菌种控制程序菌种控制程序HY/QP 09HY/QP 0901-200001-2000新菌种标准新菌种标准华北制药股份华北制药股份有限公司有限公司目目标标可可行行性性分分析析 菌种优化选育是一项周期长、难度大、成功率低的工作。菌种优化选育是一项周期长、难度大、成功率低的工作。尽管车间在菌种选育工作投入较多，自尽管车间在菌种选育工作投入较多，自20022002年以来一直没有选年以来一直没有选育出新菌种。育出新菌种。1.1.菌种通过
8、自发突变和诱发突变，其基因将产生可稳定遗菌种通过自发突变和诱发突变，其基因将产生可稳定遗 传的变异。再通过菌种筛选和菌种优化，选育到高单位突变传的变异。再通过菌种筛选和菌种优化，选育到高单位突变菌株是可行的。菌株是可行的。2.2.从车间生产实际来看，组织了多次技术攻关。生产菌种优从车间生产实际来看，组织了多次技术攻关。生产菌种优化选育后，发酵单位同比都有化选育后，发酵单位同比都有2%2%以上的提高。以上的提高。3.3.小组成员由车间主任、工艺员、种子组组长及技术员小组成员由车间主任、工艺员、种子组组长及技术员、技、技师等组成，专业技术素质高，选种经验丰富，管理到位，责师等组成，专业技术素质高，
9、选种经验丰富，管理到位，责任心强。任心强。挑战性挑战性可行性可行性 为了提高优化选育效率，我们小组成员对影响优化选育的因素进行了为了提高优化选育效率，我们小组成员对影响优化选育的因素进行了认真的分析和讨论，绘制出因果分析系统图。认真的分析和讨论，绘制出因果分析系统图。优优化化选选育育效效率率低低选育效率低选育效率低优化效率低优化效率低出 发 菌 株 不 纯出 发 菌 株 不 纯 诱 变 对 象 不 适诱 变 对 象 不 适诱变方法选择不适诱变方法选择不适摇瓶筛选周期不适摇瓶筛选周期不适培 养 基 成 分 不 适培 养 基 成 分 不 适操作误差大操作误差大样品检测精度不高样品检测精度不高筛 选
10、 工 艺 不 适筛 选 工 艺 不 适针对系统图的针对系统图的7条末端因素，小组成员逐项进行了验证。条末端因素，小组成员逐项进行了验证。验证一：出发菌种不纯验证一：出发菌种不纯 我们对我们对0405年度所用过的出发菌种进行了纯度试验，结果显示所用过的出发菌年度所用过的出发菌种进行了纯度试验，结果显示所用过的出发菌种的纯度均高于种的纯度均高于95%。表表2 菌种纯度试验表菌种纯度试验表菌种号菌种号87-21-1087-21-1087-26-8687-26-8687-32-3487-32-3487-35-1287-35-1287-40-3687-40-3687-44-11787-44-117纯度纯
11、度98.3%98.6%96.9%97.8%97.7%97.4%验证人：王群 付应艳结论：不是要因。结论：不是要因。验证二：诱变方法选择不适验证二：诱变方法选择不适 我们对我们对0405年度所做过的诱变育种结果统计分析，年度所做过的诱变育种结果统计分析，-87谱系菌种的选育谱系菌种的选育随着三种随着三种诱变方法使用次数的增加，致死率也随着下降，说明三种诱变方法对诱变方法使用次数的增加，致死率也随着下降，说明三种诱变方法对-87谱系菌种具谱系菌种具有了一定的饱和效应，造成诱变效果的降低。有了一定的饱和效应，造成诱变效果的降低。表表3 3 致死率统计表致死率统计表87-21-1087-21-1087
12、-26-8687-26-8687-32-3487-32-3487-35-1287-35-1287-40-3687-40-3687-44-11787-44-117UV致死率(42cm,1min)95.79%93.81%92.83%92.74%92.09%91.38%N-m致死率(1mg/ml,5min)90.58%89.39%87.46%87.01%87.19%86.83%UV+N-m复合致死率99.94%98.62%97.53%98.16%97.44%96.52%验证人：张小双 王世雯结论：是要因。结论：是要因。验证三：诱变对象不适验证三：诱变对象不适 -87谱系菌种诱变处理对象一直采用休眠孢
13、子。小组成员以谱系菌种诱变处理对象一直采用休眠孢子。小组成员以87-44-117菌种的菌种的萌发孢子、不同生长阶段的菌丝、单菌落作为诱变对象，得到的变异率都明显萌发孢子、不同生长阶段的菌丝、单菌落作为诱变对象，得到的变异率都明显低于休眠孢子。低于休眠孢子。表表4 -874 -87菌种在不同状态下的诱变结果表菌种在不同状态下的诱变结果表菌丝菌丝（20小时）小时）菌丝菌丝（110小时）小时）单单菌落菌落萌发孢子萌发孢子休眠孢子休眠孢子变异率变异率UV,1min,42cm1.98%2.46%3.25%3.76%5.02%验证人：康自力 王世雯结论：不是要因。结论：不是要因。验证四：操作误差大验证四：
14、操作误差大 操作人员共进行了操作人员共进行了4批次、每批批次、每批30瓶的相同菌株发酵对照实验。以连续瓶的瓶的相同菌株发酵对照实验。以连续瓶的发酵单位作为样本经统计计算并分别做平均值发酵单位作为样本经统计计算并分别做平均值-极差控制图，未出现超出控制界限极差控制图，未出现超出控制界限的点子，也未出现点子排列有非随机的迹象，可认为操作误差处于受控状态。的点子，也未出现点子排列有非随机的迹象，可认为操作误差处于受控状态。图4 平均值控制图12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20UCL 平均值中心值(CL)LCL图图5 极差控制图极差控制图123456789
15、10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20UCL极差中心值(CL)LCL验证人：王群 康自力结论：不是要因。结论：不是要因。验证五：验证五：摇瓶筛选周期不适摇瓶筛选周期不适 -87菌种原有摇瓶筛选实验的周期是菌种原有摇瓶筛选实验的周期是6天，我们对天，我们对87-44-117菌种在菌种在5天、天、6天、天、7天、天、8天的筛选结果进行了比对，发现摇瓶实验中天的筛选结果进行了比对，发现摇瓶实验中7天的发酵单位同最终筛选结天的发酵单位同最终筛选结果的吻合率最高。果的吻合率最高。表表5 吻合率统计表吻合率统计表 5 5天天6 6天天7 7天天8 8天天复筛吻合率复筛吻合率%38
16、.6%45.2%55.4%38.1%验证人：王群 付娟结论：是要因。结论：是要因。验证六：验证六：培养基成分不适培养基成分不适 小组成员小组成员对对-87-87菌种在现有培养基的代谢情况进行了考察。菌种在现有培养基的代谢情况进行了考察。由上图可知，试验菌种的碳源利用全程快于对照菌种。由上图可知，试验菌种的碳源利用全程快于对照菌种。图6 残糖量代谢折线图05101520356710天g/ml试验菌种对照菌种图7 残氮量代谢折线图0.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.01.21.21.41.43 35 56 67 71010天天g/Lg/L试验菌种对照菌种由上图可知
17、，试验菌种的氮源利用全程快于对照菌种。由上图可知，试验菌种的氮源利用全程快于对照菌种。图8 发酵单位代谢折线图图8 发酵单位代谢折线图491824640225081889712623205111740611670432624708050001000015000200002500030000356710(天)(u/ml)试验菌种对照菌种 可见，试验菌种的碳、氮源利用都全程快于对照菌种。所以培养基可见，试验菌种的碳、氮源利用都全程快于对照菌种。所以培养基中碳、氮源的不足，是造成试验菌种发酵后期单位增长缓慢的直接原因中碳、氮源的不足，是造成试验菌种发酵后期单位增长缓慢的直接原因。验证人：张伟 付娟结
18、论：是要因。结论：是要因。验证七：验证七：样品检测精度不高样品检测精度不高 实验室现用美国实验室现用美国O.I.Analytical公司公司ALPKEMALPKEM牌牌FS-FS-IV型流体分析仪来测量型流体分析仪来测量效价，允许误差范围在效价，允许误差范围在1%之内。用标定好的青霉素溶液（之内。用标定好的青霉素溶液（25000u/ml）分）分成一百个相同样品进行检测，均值为成一百个相同样品进行检测，均值为24862u/ml，标准差为标准差为25.6 u/ml,过程能过程能力指数力指数为为1.42，说明过程能力充分，具备表达试验正确结果的能力，说明过程能力充分，具备表达试验正确结果的能力。验证
19、人：饶阳宾 付娟结论：不是要因。结论：不是要因。经调查论证，最终确定优化选育效率低的主要原因是：经调查论证，最终确定优化选育效率低的主要原因是：针对影响优化选育效率的主要原因，制定了相应的对策。针对影响优化选育效率的主要原因，制定了相应的对策。序序号号要因要因对策对策目标目标措施措施地点地点负责人负责人完成日期完成日期1诱变方法诱变方法选择不适选择不适寻找新的寻找新的菌种诱变菌种诱变方法方法通过优化育种，通过优化育种，获得稳定高产获得稳定高产菌种。菌种。引入新诱变剂，引入新诱变剂，进行复合诱变进行复合诱变处理，再对菌处理，再对菌种纯化稳定。种纯化稳定。北师大北师大本岗位本岗位王王 群群付应艳付
20、应艳王世雯王世雯 2005年年7月月2摇瓶筛选摇瓶筛选周期不适周期不适设计适宜设计适宜的有定向的有定向筛选作用筛选作用的摇瓶试的摇瓶试验验选择最佳摇瓶选择最佳摇瓶周期，保证复周期，保证复筛吻合率达到筛吻合率达到50%以上。以上。延延 长长 摇摇 瓶瓶 周周 期期本岗位本岗位张小双张小双王王 茹茹付付 娟娟2005年年7月月3培养基培养基成分不适成分不适改改 变变培 养 基 配培 养 基 配方方确定最优的确定最优的培养基配方培养基配方用正交试验的用正交试验的方法调整培养方法调整培养基中的碳、氮基中的碳、氮源比例，优化源比例，优化配方。配方。本岗位本岗位康自力康自力张张 伟伟饶阳宾饶阳宾2005年
21、年7月月表表6 6 对策表对策表实施一：确定适宜的优化育种方法实施一：确定适宜的优化育种方法 第一步：第一步：以现生产菌种以现生产菌种87-44-117为出发菌种，先加入化学诱变因子为出发菌种，先加入化学诱变因子5-FU，再，再 通过高能电子照射，然后分离到含有一定青霉素浓度的固体培养基上培养，进行通过高能电子照射，然后分离到含有一定青霉素浓度的固体培养基上培养，进行复合诱变处理。复合诱变处理。斜面孢子斜面孢子分分 离离高能电子诱变高能电子诱变5-FU含有青霉素的培养基含有青霉素的培养基培培 养养分离新菌种分离新菌种图图9 9 菌种复合处理示意图菌种复合处理示意图自然培养自然培养新菌种分离新菌
22、种分离斜面孢子斜面孢子砂土孢子砂土孢子图图10 10 菌种纯化过程菌种纯化过程 第二步：第二步：通过自然分离培养的方法，结合摇瓶筛选试验，通过自然分离培养的方法，结合摇瓶筛选试验，对复合诱变得到的高产菌株进行优化稳定。对复合诱变得到的高产菌株进行优化稳定。实施一：实施一：第一步第一步 复合处理所复合处理所得高产菌落形态得高产菌落形态第二步第二步 通过自然优化通过自然优化后的菌落形态后的菌落形态效果：效果：优化后菌种的高产特性非常明显，菌落形态纹优化后菌种的高产特性非常明显，菌落形态纹理细密，呈现螺旋状。理细密，呈现螺旋状。图图11 11 菌落形态示意图菌落形态示意图实施一：实施一：图图12 1
23、2 孢子形态镜检图孢子形态镜检图效果：效果：优化后菌种的孢子形态大小整齐，弱孢子比例优化后菌种的孢子形态大小整齐，弱孢子比例明显减少，显示高产特性更加稳定。明显减少，显示高产特性更加稳定。为了使优化选育后的生产菌种具有代谢快、生长周期长、耐低通气量等优良性为了使优化选育后的生产菌种具有代谢快、生长周期长、耐低通气量等优良性状，决定延长初筛摇瓶发酵周期（从原有的状，决定延长初筛摇瓶发酵周期（从原有的6-7天延长到天延长到7-8天）；将原有的摇瓶装天）；将原有的摇瓶装量从量从50ml/瓶增加到瓶增加到60ml/瓶。瓶。实施二：设计具有定向选育功能的摇瓶试验实施二：设计具有定向选育功能的摇瓶试验出发
24、菌种原方案复筛吻合原方案复筛吻合率（率（%）新方案复筛吻合率（%）87-40-3639.652.787-44-11741.855.4实验菌种44.163.9表表7 7 筛选结果统计筛选结果统计效果：效果：新方案的定向选育效率高，吻合率达到50%以上。实施三：优化选育培养基配方实施三：优化选育培养基配方 为了寻找合适的培养基配方，我们设计了为了寻找合适的培养基配方，我们设计了L9L9（3 34 4）正交试）正交试验，对发酵培养基配方中的碳、氮源进行了调整。验，对发酵培养基配方中的碳、氮源进行了调整。项目项目水平水平乳糖（%）玉米浆（%）硫酸铵（%）硫酸亚铁（%）1A1B1C1D12A2B2C2D
25、23A3B3C3D3表表8 8 因素水平表因素水平表ABCD摇瓶发酵单位摇瓶发酵单位(u/ml)1A1B1C3D2 213202A2B1C1D1 236223A3B1C2D3 212064A1B2C2D1 256675A2B2C3D3 218536A3B2C1D2 206037A1B3C1D3 226438A2B3C2D2 245629A3B3C3D1 22282k1 69630 6614866868 71571K=k1+k2+k3=203758k2 70037 6812371435 66485k3 64091 6948765455 65702极差极差R5946333959805869表表9
26、9 正交试验结果分析表正交试验结果分析表由上表正交试验结果可得1 1、直观最佳组合直观最佳组合A A1 1B B2 2C C2 2D D1 1为配方为配方1 12 2、通过计算所得的最佳组合、通过计算所得的最佳组合A A2 2B B3 3C C2 2D D1 1为配方为配方2 23 3、各因素间的主次顺序由其极差、各因素间的主次顺序由其极差R R可知为可知为CADBCADB效果：效果：依验证试验结果确定依验证试验结果确定配方配方2 2为最优培养基成分。为最优培养基成分。247692476924756247562454824548250022500223918239182362423624238
27、8023880242492424922500230002350024000245002500025500实验1实验2实验3实验平均配方2配方2配方1配方1图图13 验证试验验证试验1 1菌种的生产能力提高，完成小组目标。菌种的生产能力提高，完成小组目标。菌种菌种初筛初筛复试一复试一复试二复试二复试三复试三7天天(u/ml)比较比较%7天天(u/ml)比较比较%8天天(u/ml)比较比较%7天天(u/ml)比较比较%优化后优化后21658提高提高10.920006提高提高7.622029提高提高8.822000提高提高14.8优化前优化前19529185932024719164表表10 10 摇
28、瓶试验结果摇瓶试验结果1 1菌种的生产能力提高，完成小组目标。菌种的生产能力提高，完成小组目标。月份月份活动前活动前目标值目标值实施期实施期 巩固期巩固期 2005.72005.7 8 89 91010 11111212发酵单位发酵单位u/mlu/ml59971599716117061170614576145763654636546232562325634976349763364633646447764477发酵指数发酵指数4.44884.44884.53784.53784.7314.7314.8104.8104.6874.6874.7404.7404.7944.7944.9624.962批批
29、 数数211211-323237374444464649494848表表11 11 优化选育前后生产菌种的发酵单位对比优化选育前后生产菌种的发酵单位对比通过对生产菌种通过对生产菌种-87-87的优化选育，其摇瓶单位较实施前的优化选育，其摇瓶单位较实施前提高提高10.5%10.5%，发酵单位也较实施前提高，发酵单位也较实施前提高4.6%4.6%，巩固期，巩固期较实施前提高较实施前提高6.6%6.6%。结论1 1菌种的生产能力提高，完成小组目标。菌种的生产能力提高，完成小组目标。表表12 12 优化前后优化前后-87-87菌种数理统计检验表菌种数理统计检验表菌种菌种样本数样本数平均单位平均单位标准
30、差标准差优化后优化后256631292968.76优化前优化前211599712610.8F=F=S S1 12S S22=1.29=1.29(1)F(1)F检验：设检验：设H H0 0：1 12 2=2 22 2查表查表F F/2/2（200200，200200）1.6431.643 FFFUUU0.0050.005 拒绝拒绝H H0 0 菌种在优化前后有极显著差异。菌种在优化前后有极显著差异。结论1 1菌种的生产能力提高，完成小组目标。菌种的生产能力提高，完成小组目标。图14 实施前后发酵单位对比图图14 实施前后发酵单位对比图6392163921627336273361170599715
31、8000580005900059000600006000061000610006200062000630006300064000640006500065000活动前活动前目标目标实施期实施期巩固期巩固期单位 u/ml单位 u/ml 2005 2005年年7 7月月-12-12月月G-87G-87菌种共放罐菌种共放罐256256批，滤液产量批，滤液产量3680836808亿单位亿单位/罐批，提炼收率罐批，提炼收率80.17%80.17%，结晶收率，结晶收率91.41%91.41%1-61-6月单位成本：月单位成本：43.72943.729元元/十亿，成果期成本：十亿，成果期成本：43.34043
32、.340元元/十亿。十亿。经济效益经济效益=(=(活动前成本活动前成本-活动后成本）活动后成本）工业盐产量工业盐产量 =（43.729-43.34043.729-43.340）690538.31=26.86690538.31=26.86万元万元 本课题系数为本课题系数为0.70.7，则经济效益为：，则经济效益为：26.86 26.86 0.7=18.80.7=18.8万元万元 利润利润=18.818.8万元万元 2 2效益效益此效益已获公司此效益已获公司财务部门认证财务部门认证项目项目措措 施施负责人负责人完成时间完成时间 工工 作作标准化标准化1.1.将新诱变方法确定为诱变育种的新方将新诱变
33、方法确定为诱变育种的新方法。法。2.2.将新的摇瓶设计固定为定向选育新菌将新的摇瓶设计固定为定向选育新菌种的筛选方法。种的筛选方法。3.3.将培养基优化配方确定为新的选种配将培养基优化配方确定为新的选种配方。方。全部写入工艺规程全部写入工艺规程Q/HY J 05Q/HY J 05010101-01-20042004王王 群群20052005年年1212月月人人 员员培培 训训 对岗位操作人员进行技术培训并举办年对岗位操作人员进行技术培训并举办年度操作比赛，巩固成绩。度操作比赛，巩固成绩。康康 自自 力力20052005年年1212月月表表13 13 巩固措施表巩固措施表 通过开展通过开展QC小组活动，使我们深深体小组活动，使我们深深体会到它是提高企业竞争力的一个有效途径。会到它是提高企业竞争力的一个有效途径。通过全员参加，激发了员工掌握科学技术的通过全员参加，激发了员工掌握科学技术的积极性，积极性，灵活运用数理统计工具解决生产中灵活运用数理统计工具解决生产中一个又一个问题，实现了高质量，低成本，一个又一个问题，实现了高质量，低成本，同时提高了小组成员的质量意识、参与意识、同时提高了小组成员的质量意识、参与意识、改进意识。改进意识。QC小组下一个课题是小组下一个课题是优化单菌优化单菌落的挑选，提高生产水平落的挑选，提高生产水平，进一步降低成，进一步降低成本，增加效益本，增加效益。
