1、毒理实验全册配套毒理实验全册配套教学课件教学课件2实验一 小鼠经口急性毒性试验1.学习外源化学物急性毒性试验的学习外源化学物急性毒性试验的设计原则，了解实验基本程序；设计原则，了解实验基本程序；2.掌握小鼠经口灌胃技术；掌握小鼠经口灌胃技术；3.掌握计算掌握计算LD50的方法。的方法。动物一次或动物一次或24 h内多次接触外源化学内多次接触外源化学物后，观察急性毒性反应及其程度，中物后，观察急性毒性反应及其程度，中毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒毒死亡的原因及特征，了解受试动物毒性反应的剂量反应关系，求出性反应的剂量反应关系，求出LD50。1.药物与试剂药物与试剂 盐酸二甲硝咪唑盐酸二甲硝咪
2、唑、苦味酸酒精饱和溶液和中性红溶液、记号笔2.设备与器械设备与器械 吸管、烧杯、灌胃器、电子天平（感量0.1 g）、外科手术剪、5 mL注射器、10 mL注射器、干棉球 3.实验动物实验动物 成年健康小鼠，18-22g，雌雄各半1.剂量选择剂量选择：查阅文献，估计预期毒性中值；预试验，求出受试化学物的0100%或1090%大致致死范围，设计正式试验的剂量和分组。盐酸二甲硝咪唑盐酸二甲硝咪唑绝对致死剂量2500mg/kg，最低中毒剂量为800mg/kg 2.实验动物的标记和分组实验动物的标记和分组 染色法，染色法，苦味酸酒精饱和溶液和中性红溶液苦味酸酒精饱和溶液和中性红溶液分组分组，采用随机法，
3、采用随机法3.受试物的配制受试物的配制（1）溶剂的选择：选择原则是不与受试物反应，最常用的溶剂为水。助悬剂：淀粉液、明胶液等；助溶剂：吐温80、吐温60、聚乙二醇等。（2）配制方法的选择：等浓度稀释法和等容量稀释法。等浓度稀释法：将受试化学物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。等容量稀释法等容量稀释法u将受试化学物配制成将受试化学物配制成不同浓度不同浓度，不同剂量，不同剂量组实验动物单位体重所给受试化学物的组实验动物单位体重所给受试化学物的体体积相同积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓，剂量越大，受试化学物配制
4、的浓度越高。度越高。u为避免操作误差，等容量稀释的传统方法为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常用常用1K系列稀释法（系列稀释法（K=各组剂量比值）各组剂量比值）。u根据实验设计要求根据实验设计要求确定最高剂量组所需受确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液试化学物的浓度和总体积，配制母液。（3）等容量稀释法配制等容量稀释法配制6个剂量组的染毒溶液个剂量组的染毒溶液 求母液浓度求母液浓度C1 绝对致死剂量为2500mg/kg，最低中毒剂量为800mg/kg，每10g体重小鼠灌胃0.2mL C1=2500mg/kg10g/0.2mL125mg/mL 求公比求公比r ba6-12500
5、800=1.25r一般为1.2-1.5n为组数r=n-1式中，K：各组剂量的比值，K1/r。取母液m mL置一容器中，供最高剂量组染毒用；加入m mL溶剂，稀释后的浓度为C2，C1C21K，取出m mL供第二组动物染毒用；再加入m mL溶剂，稀释后的浓度为C3，C2C31K，取出m mL供第三组动物染毒用。依次类推，配制其它不同剂量组的试液。设：母液浓度为设：母液浓度为C1，各组所需要的量为，各组所需要的量为m mL，母液应配制的总量母液应配制的总量M为为：各组剂量比值各组剂量比值K1/r0.8母液总量：母液总量：Mm/(1-K)10/(1-0.8)=50mL受试化学物的质量为：受试化学物的质
6、量为：125mg/mL50mL6.25g 求母液应配制的总量求母液应配制的总量 称取称取盐酸二甲硝咪唑盐酸二甲硝咪唑6.25g，用生理盐水或用生理盐水或蒸馏水将药物溶解并稀释至蒸馏水将药物溶解并稀释至50mL，即为，即为母液母液(母液浓度为母液浓度为125mg/mL)；从母液中取从母液中取10mL供第供第1组动物染毒；组动物染毒；在剩下的母液中加入在剩下的母液中加入10mL溶剂，稀释后溶剂，稀释后 取取10mL供第供第2组染毒；组染毒；依次类推，配制依次类推，配制其它不同剂量组的试液其它不同剂量组的试液。药物溶液的配制药物溶液的配制4.灌胃给药灌胃给药（1）动物的禁食和复食：灌胃前禁食动物的禁
7、食和复食：灌胃前禁食610h，使，使动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝动物保持空腹状态，且不至因禁食时间过长影响肝脏，进而影响实验结果。灌胃后至少脏，进而影响实验结果。灌胃后至少23h后才能后才能复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长；复食，灌服油剂比水剂要求复食时间更长；（2）灌胃体积：小鼠每灌胃体积：小鼠每10g体重灌胃体重灌胃0.10.2mL，最多不超过最多不超过0.4mL。小鼠灌胃量的极限是。小鼠灌胃量的极限是0.51mL；（3）灌胃方法和注意事项。灌胃方法和注意事项。小鼠经口灌胃给药方法小鼠经口灌胃给药方法 保定动物：保定动物：用右手将小鼠尾巴提起，置于用右手将小鼠尾巴提起，
8、置于鼠笼或粗糙的平面上，当小鼠向前挣扎时，鼠笼或粗糙的平面上，当小鼠向前挣扎时，用左手的拇指和食指捏住小鼠用左手的拇指和食指捏住小鼠两耳后颈背两耳后颈背皮肤皮肤，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以，翻转小鼠置于掌心，拉直后肢，以小指小指压住小鼠尾巴即可。压住小鼠尾巴即可。在保定小鼠过程中，在保定小鼠过程中，不要用力过大不要用力过大，勿握勿握其颈部其颈部，以免窒息死亡。，以免窒息死亡。小鼠的捉拿、固定小鼠的捉拿、固定小鼠的捉拿法小鼠的捉拿法小鼠经口灌胃给药方法小鼠经口灌胃给药方法 给药：给药：以灌胃器轻轻压其头部，以灌胃器轻轻压其头部，使使口腔与食道成一条直线口腔与食道成一条直线;再将灌胃针沿再将灌
9、胃针沿上腭壁上腭壁轻轻轻轻进入食道进入食道;当灌胃针进入约当灌胃针进入约3cm左右左右时即达胃内。时即达胃内。小鼠灌胃法小鼠灌胃法 如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行如果灌胃针的位置插入正确，小鼠可自行吞服药；吞服药；灌胃针插入位置不正确，小鼠会灌胃针插入位置不正确，小鼠会强烈挣扎强烈挣扎，必须拔出重插，否则可能将药物灌入必须拔出重插，否则可能将药物灌入气管气管，造成小鼠死亡；造成小鼠死亡；注完药液后轻轻抽出灌胃针；注完药液后轻轻抽出灌胃针；小鼠一次最大灌胃量为：小鼠一次最大灌胃量为：0.4ml/10g.bw。灌胃时的注意事项灌胃时的注意事项注意事项注意事项 保定时：一定要固定好动物，使动物
10、保定时：一定要固定好动物，使动物头不头不要随意摆动要随意摆动，但不能挤捏颈部但不能挤捏颈部。灌胃器针头弧度面向前从动物灌胃器针头弧度面向前从动物右嘴角处插右嘴角处插入入，灌胃动作要，灌胃动作要轻柔轻柔。不能虐待动物不能虐待动物，尤，尤其是大鼠，否则，容易被其其是大鼠，否则，容易被其咬伤咬伤。插入灌胃针时，如果遇到阻力，不能用力插入灌胃针时，如果遇到阻力，不能用力继续进针，应继续进针，应停止进针停止进针，等待其自动吞咽，等待其自动吞咽时，迅速进针。否则，容易损伤动物时，迅速进针。否则，容易损伤动物食道食道。5.中毒症状观察和结果记录中毒症状观察和结果记录 染毒后认真观察中毒发生、发展过程，中毒反
11、应的特点和毒作用靶器官。准确结果：观察24 h。观察指标（观察指标（1）对于了解受试化学物的急性毒性特征及该化合物毒性作对于了解受试化学物的急性毒性特征及该化合物毒性作用的靶器官非常重要；用的靶器官非常重要；临床中毒反应和死亡时间可为临床中毒反应和死亡时间可为中毒机制中毒机制提供线索；提供线索；神经毒性神经毒性：染毒后立即惊厥、共济失调等；：染毒后立即惊厥、共济失调等；迟发性死亡迟发性死亡：化合物有肝、肾毒性；：化合物有肝、肾毒性；植物神经兴奋植物神经兴奋：腹泻、竖毛等；：腹泻、竖毛等；可能的中毒表现：可能的中毒表现：兴奋，兴奋，活动增加、骚动、窜跑、跳跃、呼吸加深加快；活动增加、骚动、窜跑、
12、跳跃、呼吸加深加快；抑制，抑制，活动减少、呆立、静卧、步态不稳、呼吸困难等；活动减少、呆立、静卧、步态不稳、呼吸困难等；刺激症状：刺激症状：搔鼻、尖叫、出汗、流涎、眼耳鼻等的出血。搔鼻、尖叫、出汗、流涎、眼耳鼻等的出血。观察指标（观察指标（2）观察期间的体重变化可以反映动物中毒观察期间的体重变化可以反映动物中毒后的整体变化，应后的整体变化，应3-5天测量一次；天测量一次；体重减轻体重减轻：可能是动物食欲下降、摄食：可能是动物食欲下降、摄食量减少；也可能是化合物干扰代谢系统，影量减少；也可能是化合物干扰代谢系统，影响食物吸收、利用；响食物吸收、利用；体重增加体重增加：低水平的化学毒物促进动物：低
13、水平的化学毒物促进动物生长，动物体重增长率大于对照组。生长，动物体重增长率大于对照组。观察指标（观察指标（3）十分重要的中毒机理研究信息；十分重要的中毒机理研究信息；重重点观察和记录各个剂量组动物的死亡数点观察和记录各个剂量组动物的死亡数；每只动物死亡的时间每只动物死亡的时间（尤其是最早出现（尤其是最早出现死亡的时间）。死亡的时间）。观察指标（观察指标（4）及时剖检：及时剖检：对死亡动物的对死亡动物的主要脏器主要脏器进行肉眼观察，进行肉眼观察，重点检查重点检查主要脏器主要脏器的大小、外观、色泽、有无充血、的大小、外观、色泽、有无充血、出血、水肿等；出血、水肿等；对有病理变化的组织及脏器做对有病
14、理变化的组织及脏器做组织病理学检查组织病理学检查；试验结束试验结束：对各个剂量组存活动物与对照组动物：对各个剂量组存活动物与对照组动物做大体病理解剖，必要时做组织病理学检查。做大体病理解剖，必要时做组织病理学检查。组别组别动物数动物数（只）（只）剂量剂量（mg/kg）对数对数剂量剂量死亡数死亡数（只）（只）死亡率死亡率 存活率存活率表表1 小鼠小鼠盐酸二甲硝咪唑盐酸二甲硝咪唑LD50测定结果测定结果实验结果记录（实验结果记录（5）6.LD50的计算的计算 用改良寇氏法计算LD50。i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差；Xm最大剂量对数；P各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)；p各剂量组死亡率之和
15、。LD50的标准误的标准误 Sx50logLD50的标准误的标准误 i组距，即相邻两组剂组距，即相邻两组剂量对数剂量之差量对数剂量之差 P各剂量组死亡率各剂量组死亡率（死死亡率均用小数表示亡率均用小数表示）q各组剂量存活率，各组剂量存活率，q=1-p n各组动物数各组动物数LD50 的的95%可信限计算公式可信限计算公式LD50 的的95%可信限可信限=log-1(log LD501.96Sx50)7.结果评定结果评定根据小鼠的中毒症状、死亡时间、根据小鼠的中毒症状、死亡时间、LD50 及急性毒作用特点，初步判断该受试物及急性毒作用特点，初步判断该受试物的毒性大小和毒性特征。的毒性大小和毒性特
16、征。注意事项注意事项 操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、操作时要小心仔细、大胆敏捷、熟练准确、不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜不能粗暴，不能恐吓动物，同时，要爱惜动物，使动物少受痛苦。动物，使动物少受痛苦。正确捉拿动物，防止被正确捉拿动物，防止被咬伤咬伤。实验药品实验药品不能带出不能带出实验室。实验室。防止操作者中毒。防止操作者中毒。实验二小鼠骨髓细胞微核试验2 实验原理 微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规微核是在细胞的有丝分裂后期染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在律地进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒细胞质中的染色单体或染色体的无着丝粒
17、断片或环。它在末期以后，单独形成一个断片或环。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质或几个规则的次核，被包含在细胞的胞质内而形成，由于比核小得多故称微核。内而形成，由于比核小得多故称微核。通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细通过检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（胞（PCEPCE）的微核出现率，间接反应骨髓细）的微核出现率，间接反应骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试药物是否具有致突变作用试药物是否具有致突变作用,主要用于测试主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。干扰细胞有丝分裂的物质。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核的形成小鼠骨髓嗜多
18、染红细胞微核的形成3 实验材料 3.1 3.1 器材器材 解剖器械，显微镜，载玻片等。3.2 3.2 试剂试剂 甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、Giemsa储备液、pH 6.8磷酸盐缓冲液、小牛血清、生理盐水 3.3 3.3 药物药物 环磷酰胺 3.4 3.4 动物动物 小鼠7-12周龄，体重20-30g，雌雄各半。4 操作步骤 4.1 4.1 给药给药 环磷酰胺生理盐水溶液按环磷酰胺生理盐水溶液按50mg/kg50mg/kg剂量腹剂量腹腔注射腔注射2 2次次，间隔，间隔24h24h。空白对照：生理盐水空白对照：生理盐水 4.2 4.2 骨髓液的制备和涂片骨髓液的制备和涂片 试验动物第二次染毒
19、试验动物第二次染毒6 6小时后用颈椎脱臼小时后用颈椎脱臼或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，或麻醉法将其处死，取胸骨，擦净血污，剔去肌肉。剔去肌肉。在洁净的玻片滴小牛血清在洁净的玻片滴小牛血清1 1滴，剪去骨骺，滴，剪去骨骺，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，用止血钳将骨髓挤到血清中，混匀，推片，干燥。干燥。4.3 4.3 固定固定 将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，甲醇液固定液固定5-10min5-10min，取出，晾干。不能及时染，取出，晾干。不能及时染色的涂片也应固定好保存。色的涂片也应固定好保存。4.4 4.4 染色染色 将固定晾干后的涂片，用新鲜
20、配制的将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的GiemsaGiemsa染液染液(Giemsa(Giemsa储备液储备液1 1份份+pH6.8+pH6.8的磷酸的磷酸盐缓冲液盐缓冲液9 9份份)染色染色10-15min10-15min，冲洗，晾干。，冲洗，晾干。1/15mol/L1/15mol/L磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(PH6.8)(PH6.8)磷酸二氢钾磷酸二氢钾(KH(KH2 2POPO4 4)4.50g4.50g磷酸氢二钠磷酸氢二钠(Na(Na2 2HPOHPO4 412H12H2 2O)O)11.81g11.81g加蒸馏水至加蒸馏水至 1000mL1000mL 嗜多染红细胞（嗜多染红细胞（PC
21、E）呈灰蓝色，正染红细胞（）呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，呈粉红色。典型的微核多为单个、圆形、边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。4.5 4.5 观察计数观察计数 低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，低倍镜下观察，选择细胞完整、分散均匀，着色适当的区域，再在油镜下观察计数。着色适当的区域，再在油镜下观察计数。计数计数10001000个个PCEPCE中含微核的中含微核的PCEPCE数，并且计数，并且计数至少数至少200200个细胞（个细胞（PCE+NCE200PCE+NCE200个）中个）中PC
22、EPCE与与NCENCE的比值。的比值。MNNCE5 结果记录表表 微核率统计微核率统计嗜多染红细胞微核率嗜多染红细胞微核率=有微核的嗜多染红细胞总数有微核的嗜多染红细胞总数/检查嗜多染红细胞数检查嗜多染红细胞数1000正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超正常小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常过千分之五为异常 。6 结果分析与评价 本试验中只计数本试验中只计数PCEPCE中微核，微核率以千中微核，微核率以千分率表示。分率表示。PCE/NCEPCE/NCE为评价细胞毒性的指标，受试组为评价细胞毒性的指标，受试组PCE/NCEPCE/NCE值与阴性对照组比较有
23、统计学意值与阴性对照组比较有统计学意义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结义表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。果不可靠。正常正常PCE/NCEPCE/NCE约为约为1 1（正常范围（正常范围0.6-1.20.6-1.2），如比），如比值小于值小于0.10.1，表示，表示PCEPCE形成受到严重抑制；如比值形成受到严重抑制；如比值小于小于0.050.05，表示受试物剂量过大，实验结果不可，表示受试物剂量过大，实验结果不可靠。靠。实验三 急性皮肤刺激试验 试验原理试验原理 试验目的试验目的 试验材料试验材料 试验方法试验方法 结果分析结果分析 方法评价方法评价 局部刺激试验是毒理学试验中的
24、一项重要局部刺激试验是毒理学试验中的一项重要内容，对可能具有局部刺激作用的化学物内容，对可能具有局部刺激作用的化学物必须进行此项试验，但对具有强酸（必须进行此项试验，但对具有强酸（pH2）或强碱或强碱（pH11.5）性质的化学物不需做）性质的化学物不需做本试验，因为这些化学物属于腐蚀性物质。本试验，因为这些化学物属于腐蚀性物质。另外，已知具有高毒性的化学物也不必进另外，已知具有高毒性的化学物也不必进行皮肤刺激试验行皮肤刺激试验。皮肤刺激试验皮肤刺激试验又称皮肤原发性刺激试验。又称皮肤原发性刺激试验。了解受试化学物对皮肤的直接刺激作了解受试化学物对皮肤的直接刺激作用以及刺激强度。用以及刺激强度。
25、实验动物：成年白色家兔或白色豚鼠，实验动物：成年白色家兔或白色豚鼠，首选首选白色家兔白色家兔。在皮肤刺激试验中，动物品种的选择在皮肤刺激试验中，动物品种的选择很重要。目前多选用兔和豚鼠，对于很重要。目前多选用兔和豚鼠，对于强刺激或无刺激作用的化学物选用家强刺激或无刺激作用的化学物选用家兔检测效果好，但对作用缓和的刺激兔检测效果好，但对作用缓和的刺激性化学物，选用豚鼠所获得的试验结性化学物，选用豚鼠所获得的试验结果较准确。果较准确。受试化学物：应用受试化学物受试化学物：应用受试化学物原液原液或或根据需要原液稀释成若干个不同浓度根据需要原液稀释成若干个不同浓度的的稀释液稀释液，也可应用受试化学物的
26、，也可应用受试化学物的细细粉粉。每小区皮肤的应用剂量为液体受试化每小区皮肤的应用剂量为液体受试化学物学物0.30.5 ml（84液液），粉状受试），粉状受试化学物化学物0.10.5 g（洗衣粉洗衣粉）。）。脱毛剂脱毛剂 大头针、纱布、棉球、胶布、塑料薄膜大头针、纱布、棉球、胶布、塑料薄膜 移液器、天平移液器、天平 在动物在动物脊柱两侧脊柱两侧或或躯干中部躯干中部用化学药用化学药品脱去被毛准备好脱毛区。品脱去被毛准备好脱毛区。脱毛方法：先将被毛剪短，然后在所脱毛方法：先将被毛剪短，然后在所需部位涂上一薄层脱毛剂，需部位涂上一薄层脱毛剂，23min后用玻璃棒刮去被毛，并用温水清洗后用玻璃棒刮去被毛
27、，并用温水清洗脱毛剂，纱布擦干。脱毛剂，纱布擦干。采用采用局部全封闭斑贴法局部全封闭斑贴法或或局部半封闭局部半封闭斑贴法斑贴法进行皮肤刺激试验。进行皮肤刺激试验。当以当以动物背部脊柱两侧的皮肤动物背部脊柱两侧的皮肤做受试部做受试部位时，先将其两侧脱毛区分成若干个小位时，先将其两侧脱毛区分成若干个小区，小区面积的总和应约为动物体表面区，小区面积的总和应约为动物体表面积的积的1/10。将其中一侧的各个小区，分。将其中一侧的各个小区，分别用大头针在皮肤上划一别用大头针在皮肤上划一“#”字形擦伤，字形擦伤，以观察受试化学物对以观察受试化学物对损伤皮肤损伤皮肤的刺激作的刺激作用；另一侧用以观察受试化学物
28、对用；另一侧用以观察受试化学物对完整完整皮肤皮肤的刺激作用。的刺激作用。将受试化学物将受试化学物原液原液及不同浓度的及不同浓度的稀释液稀释液，分别直接涂敷于受试皮肤的若干个小区，分别直接涂敷于受试皮肤的若干个小区，然后在各区皮肤上放一块然后在各区皮肤上放一块46层的纱布层的纱布块或其他半吸水性惰性物（块或其他半吸水性惰性物（1cm1cm或直径为或直径为1cm）。）。固体药剂固体药剂可直接加到皮肤上，再用湿纱布覆可直接加到皮肤上，再用湿纱布覆盖或是放于预先浸湿的皮肤上，也可将糊状盖或是放于预先浸湿的皮肤上，也可将糊状受试化学物涂于纱布块上，再将其贴于皮肤受试化学物涂于纱布块上，再将其贴于皮肤上，
29、然后在纱布块上覆盖一层较大的上，然后在纱布块上覆盖一层较大的不透气不透气的塑料薄膜的塑料薄膜，用胶布和绷带固定。，用胶布和绷带固定。经经48h后，除去斑贴物，后，除去斑贴物，每每24h观察一次观察一次各各小区皮肤的局部反应，连续观察小区皮肤的局部反应，连续观察4d，按皮肤，按皮肤刺激反应评分（表刺激反应评分（表1），定量地评定受试化学），定量地评定受试化学物对皮肤局部刺激作用的强度。物对皮肤局部刺激作用的强度。红斑红斑通过肉通过肉眼观察，眼观察，水肿水肿通过轻轻触摸的方法来评分。通过轻轻触摸的方法来评分。表表1 皮肤刺激强度反应评分皮肤刺激强度反应评分皮肤反应强度皮肤反应强度评分评分A.红斑和
30、焦痂形成无红斑0极轻微红斑（勉强可见）1边界清晰的红斑（明显红斑，淡红至鲜红色）2中等至严重的红斑（鲜红至深红色）3极严重红斑（深红至紫红色），并有焦痂形成（真皮层受损）4B.水肿形成无水肿0极轻微水肿（勉强可见）1轻度水肿（边缘明显地高出周围皮肤）2中度水肿（水肿区高出边缘皮肤约1mm）3严重水肿（水肿区高出边缘皮肤1mm以上，面积超出斑贴区）4 本法与局部全封闭斑贴法不同之处在于：本法与局部全封闭斑贴法不同之处在于：1.每组的白色家兔数不应少于每组的白色家兔数不应少于3只；只；2.采用纱布作斑贴物，在无刺激作用的前采用纱布作斑贴物，在无刺激作用的前提下，用提下，用半封闭敷料半封闭敷料固定；
31、固定；3.斑贴斑贴不需要在擦伤皮肤上不需要在擦伤皮肤上进行；进行；4.斑贴斑贴4h，然后去掉斑贴并清洗皮肤，观，然后去掉斑贴并清洗皮肤，观察察0.5h、1h、24h、48h和和72h后后的的皮肤反应。皮肤反应。皮肤刺激反应评分同全封闭法。皮肤刺激反应评分同全封闭法。将表将表1中中A项和项和B项评分结果相加，凡总分低项评分结果相加，凡总分低于于2分者可视为无刺激性或轻度刺激性；分者可视为无刺激性或轻度刺激性；26分之间者具有中等刺激性；分之间者具有中等刺激性；6分以上者分以上者具有强刺激性。具有强刺激性。刺激性极强刺激性极强的物质，试用前需经的物质，试用前需经适当稀释适当稀释后再进行斑贴，如稀释
32、用的溶剂本身具有后再进行斑贴，如稀释用的溶剂本身具有刺激作用，则需作溶剂对照试验。刺激作用，则需作溶剂对照试验。另外，也可按表另外，也可按表2中的标准来判断试验结果。中的标准来判断试验结果。表表2 皮肤刺激强度分级标准皮肤刺激强度分级标准皮肤刺激强度分级皮肤刺激强度分级皮肤局部反应皮肤局部反应评分评分无刺激性无异常改变0轻度刺激性充血、红斑6 皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关，皮肤刺激试验的结果不仅与检测技术有关，也与试验过程中的质量控制相关。也与试验过程中的质量控制相关。凡是杀虫剂、杀真菌剂、杀鼠剂以及具有刺凡是杀虫剂、杀真菌剂、杀鼠剂以及具有刺激性的兽药等化学物均需进行局部皮肤刺激激性
33、的兽药等化学物均需进行局部皮肤刺激试验，以保护接触人员的健康。试验，以保护接触人员的健康。试验药物的量一般以试验药物的量一般以0.5ml或或0.5g为宜，评为宜，评价固体受试化学物时不一定要将其配成溶液，价固体受试化学物时不一定要将其配成溶液，具体可酌情而定。具体可酌情而定。实验四实验四 胶体金免疫层析试纸条胶体金免疫层析试纸条检测药物残留检测药物残留一、概述一、概述 胶体金免疫层析技术（胶体金免疫层析技术（GICA）是在酶联免疫吸附试验、）是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、胶体金免疫技术和新材料技术基础上，继三大标记技术（荧
34、光素、放射性同位素料技术基础上，继三大标记技术（荧光素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，用于体外诊和酶）后发展起来的固相标记免疫测定技术，用于体外诊断断/检测。检测。具有简单、快速、成本低、可通过肉眼判定结果、无需特具有简单、快速、成本低、可通过肉眼判定结果、无需特殊设备、携带方便和无污染等优点。殊设备、携带方便和无污染等优点。自自20世纪世纪8090年代以来，得到了广泛的应用。年代以来，得到了广泛的应用。类别类别应用领域应用领域检测的物质检测的物质人 类 医人 类 医学学各 级 医 院,血站,CDC,防疫站,诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统.传染病（乙肝五
35、项,HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠 hCG(早孕)毒品（吗啡,K粉,摇头丸,冰毒）农牧业农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸,农牧类院系和研究所传染病（禽流感,链球菌等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境环境环保监测部门,研究机构有害物质超标食 品 安食 品 安全全食品安全检测中心,各监管部门农兽药残留（磺胺类、瘦肉精、氯霉素等），大肠杆菌，黄曲霉素衬板样品垫金标垫吸收垫膜GICA试纸条的构成二、基本原理二、基本原理GICA有三种反应模式：竞争抑制法，夹心法，间接法。竞争抑制夹心法间接法T CT CT C试纸条（瘦肉精、磺胺）试纸条（瘦肉精、磺胺）奶样、猪尿奶样、猪尿三、实验材料三、实验材料取出试纸条，平放在实验台上取出试纸条，平放在实验台上样品样品100微升滴在样品垫上微升滴在样品垫上58分钟内观察结果分钟内观察结果四、实验步骤四、实验步骤竞争抑制法竞争抑制法
