1、分子诊断在感染性疾病中的应用分子诊断在感染性疾病中的应用 袁艳军q 感染是病原体感染是病原体在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程在宿主的个体内进行有害的复制、繁殖过程.q 病原体病原体:细菌、真菌、病毒、细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫支原体、衣原体、螺旋体、寄生虫q 条件致病菌条件致病菌微生物人体微生物人体不不同同的的感感染染状状态态共共生生状状态态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生 一般性策略一般性策略（检出病原体的（检出病原体的DNA/RNA）：）：判断有无感染判断有无感染 是何种病原体感染是何种病原体感染
2、常用方法：常用方法：PCR 分子探针杂分子探针杂交交 完整性策略完整性策略 检出检出病原体病原体 分型（分类）亚型耐药性分型（分类）亚型耐药性 常用方法：杂交、常用方法：杂交、PCR、基因芯片、基因芯片、DNA测序测序 分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要分子生物学检验技术在感染性疾病中的应用主要包括对病原生物进行包括对病原生物进行鉴定、分型、耐药诊断鉴定、分型、耐药诊断和治和治疗过程中的疗过程中的疗效监测疗效监测等等 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据病情预后评价提供客观的依据 目前已经应用于一些重要的感染性疾
3、病，如结核目前已经应用于一些重要的感染性疾病，如结核病、病毒性肝炎、艾滋病、病、病毒性肝炎、艾滋病、SARSSARS、人禽流感等、人禽流感等一、感染性疾病的诊断和治疗监测一、感染性疾病的诊断和治疗监测（一）结核分枝杆菌（一）结核分枝杆菌（二）肝炎病毒（二）肝炎病毒（三）人类免疫缺陷病毒（三）人类免疫缺陷病毒（五）（五）SARSSARS冠状病毒冠状病毒（四）（四）HPV病毒病毒 感染方式感染方式 呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入呼吸道、消化道或皮肤损伤侵入机体机体 所致疾病所致疾病 疾病种类多样化疾病种类多样化 以以肺肺结核为主结核为主结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)生物学主
4、要特点：生物学主要特点：1.结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质2.引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿引起的疾病都呈慢性，并伴肉芽肿3.抗酸染色阳性抗酸染色阳性结核分枝杆菌结核分枝杆菌(M.tuberculosis)实验室诊断现状分子生物学检测方法 近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。现代现代分子生物学分子生物学快速诊断快速诊断基因结构分子诊断共价封闭环状结构共价封闭环状结构 标准株结核
5、分枝杆菌标准株结核分枝杆菌 基因组全长基因组全长4.4kb,4.4kb,包含包含40004000个蛋白质编码基因个蛋白质编码基因和和5050个个RNARNA编码基因编码基因 基因组特点基因组特点分枝杆菌核酸检测分枝杆菌菌种鉴定结核分枝杆菌耐药基因检测MDR早期诊断分枝杆菌分子诊断系统菌种鉴定筛查、鉴别诊断 实时荧光PCR 基因芯片快速检测平台 高 效：一个样本可同时检测结核分枝杆菌和NTM 快 速：4周（菌培）3 小时 灵 敏：10 个菌/反应（TB）；102 个菌/反应（NTM）13功能：TB快速筛查；TB/NTM鉴别诊断 高 效：同时检测 17 种分枝杆菌（包括TB）快 速：4周（菌种鉴定
6、）6 小时 灵 敏：103 个菌/反应检测范围：结核、胞内、鸟、戈登、堪萨斯、偶然、瘰疬、浅黄、土、龟-脓肿、草、不产色、海-溃疡、金色、苏尔加、蟾蜍、耻垢。14 通 量：两个一线抗结核药（MDR）速 度：8周（药敏）6 小时 灵敏度：103 个菌/反应基于rpoB（利福平）和katG/inhA（异烟肼）的基因突变，对耐多药结核病做出快速诊断。15 全世界有全世界有3.5亿慢性携带者，亿慢性携带者，75%在亚太地区在亚太地区 每年有一百万人死于每年有一百万人死于HBV感染，感染，是全球范围内第是全球范围内第9位死因位死因 中国：中国：50%70%的人受过感染，的人受过感染，8%10%是是HBV
7、携带者携带者 世界其它地区世界其它地区q DNA 病毒病毒q 双链（非环状）双链（非环状）q DNA不等长不等长q 正链（正链（2/3）q 负链负链q 最常见的血清型为最常见的血清型为adw、adr和和aywq 亚型的地区分布不同，我国以亚型的地区分布不同，我国以adr为主，为主，adw次之，而次之，而ayw见于新疆、西藏和内见于新疆、西藏和内蒙古等地蒙古等地 pre-S1 pre-S1蛋白蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白蛋白 S HBsAg pre-C HBeAg C HBcAg P DNAP X HBxAg编码编码HBsAgpre-S2pre-S1基因重叠基因重叠HBV 检测窗口期检测
8、窗口期血清学（血清学（HBsAg）：）：56天天PCR：33天天缩缩短短23天（平均天（平均6-15天）天）扩增位置扩增位置引物序列引物序列扩增片段大小扩增片段大小(bp)P、X基因特基因特异片段异片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-32785-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3基因特异基因特异片段片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-34775-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3基因特异基因特异片段片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-32585-ATGGGATCCCTGGATG
9、CTGGGTCTTCCAAA-3HBV-DNA检测（检测（PCR）PCR 引物是引物是PCR扩增的关键，决定扩扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。增的特异性和敏感度。PCR引物常根据引物常根据其其S、C、P和和X基因中的基因中的高度保守序列高度保守序列来设计。来设计。部分常用的引物序列部分常用的引物序列 1样本处理（样本处理区）样本处理（样本处理区）2核酸扩增核酸扩增 2.1 试剂配置（试剂配置（PCR前准备区）前准备区）2.2 加样（样本处理区）加样（样本处理区）2.3 PCR扩增（检测区）扩增（检测区）试剂制备试剂制备标本处理标本处理扩增扩增检测检测 结果判断：结果判断：FQ-PCR进行
10、进行HBV DNA的定量检测，检测范围为的定量检测，检测范围为2.51022.5109 copies/ml 检测样本中检测样本中5102 copies/mlHBV DNA5107 copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数 检测样本中检测样本中HBV DNA5107 copies/ml，既可直接报告为，既可直接报告为5107copies/ml，也可用正常人血清按，也可用正常人血清按10倍剃度做相应稀倍剃度做相应稀释，使其拷贝数落在释，使其拷贝数落在1105-5107 copies/ml范围内，再重范围内，再重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正
11、新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正 检测样本检测样本HBV DNA10000HIV感染者数感染者数截至截至20052005年年1212月底月底Step 1:BindingStep 2:Reverse TranscriptionStep 3:IntegrationStep 4:ReplicationStep 5:TranslationStep 6:Viral Assembly 基因组为基因组为RNA双分子，与其它逆转录病毒基本相同双分子，与其它逆转录病毒基本相同 其正链其正链RNA分子大小为分子大小为 HIV-1 9.3 kb 有有3 组共组共8个基因个基因 HIV-2 9.7 kb 有有3
12、组共组共9个基因个基因 5端有帽子结构，端有帽子结构，3端有端有poly(A)结构结构 第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序第一组：逆转录病毒共同的结构基因和侧翼末端重复顺序 gag（group of antigen)基因：编码核心蛋白基因：编码核心蛋白 pol（polymerase）基因：编码逆转录酶，）基因：编码逆转录酶，DNA聚合酶聚合酶 env（envelop）基因：编码包膜蛋白）基因：编码包膜蛋白 LTRs：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性：不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性 第二组：参与基因表达的调节基因第二组：参与基因表达的
13、调节基因 tat（trans-acting transcriptional gene）rev（regulator of expression of viral protein）nef（negative regulator factor）第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因第三组：负调控病毒的感染性，成熟或释放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U）vpr（viral protein R）高度变异区在高度变异区在env基因内，相当于基因内，相当于gp120的五的五个区段个区段 HIV疫苗研发难度大疫苗研发难度大窗口期：窗口
14、期：检测抗体检测抗体 2-12周周检测检测p24抗原抗原 2-3周周 检测检测RNA 11天天 主要有三种技术：主要有三种技术：RT-PCR（最低检测限为（最低检测限为50copies/ml）bDNA（最低检测限为（最低检测限为50copies/ml）NASBA（最低检测限为（最低检测限为20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）基于核酸等温扩增技术基于核酸等温扩增技术 方法方法检测范围检测范围实验内标准差（实验内标准差（lg）抗凝剂抗凝剂RT-PCR4 102-5 0.15 0.33ACD/EDTAbDNA4 1
15、02-50.08 0.33EDTANASBA4 102-50.13 0.33ACD/EDTA/HEP 病毒基因组是双链病毒基因组是双链DNA.具有宿主和组织特异性：人是具有宿主和组织特异性：人是HPV惟一自然宿主惟一自然宿主 传播途径：主要通过接触感染传播途径：主要通过接触感染 经经性接触传播性接触传播 新生儿可经产道感染新生儿可经产道感染 不同型的不同型的HPV侵犯的部位和所致疾病也不同侵犯的部位和所致疾病也不同 HPV的免疫防御机制尚不十分清楚的免疫防御机制尚不十分清楚 HPV的的致癌潜力致癌潜力分为分为 高危型：主要包括高危型：主要包括HPV 16、18、31、33、45、35、39、5
16、1、52和和58等（其中等（其中HPV 16和和HPV 18与子宫颈癌发生与子宫颈癌发生密切相关）密切相关）低危型：主要包括低危型：主要包括HPV6和和HPV11 中国妇女人乳头状瘤病毒（中国妇女人乳头状瘤病毒（HPV）感染和宫颈）感染和宫颈癌流行病学调查癌流行病学调查 大规模的人群专项调查发现：我国城乡妇女高危型大规模的人群专项调查发现：我国城乡妇女高危型HPV感染率均较高，并在感染率均较高，并在2024岁和岁和4044岁两个年龄岁两个年龄段呈现感染高峰；段呈现感染高峰；以医院为基础、覆盖以医院为基础、覆盖7个地区的调查显示：我国妇女个地区的调查显示：我国妇女83%的子宫颈浸润癌、的子宫颈浸
17、润癌、84%的子宫颈鳞癌的子宫颈鳞癌均有均有HPV 16型或型或18型引起；型引起；HPV 16型和型和18型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要型是导致我国妇女患子宫颈癌的最主要原因原因HPV 实验室诊断实验室诊断 分子生物学方法检测分子生物学方法检测HPV DNA 在诊断同时确定型别：如斑点杂交、原位杂交，在诊断同时确定型别：如斑点杂交、原位杂交，DNA印迹法（此法为最可靠的方法）印迹法（此法为最可靠的方法）以以HPV基因型特异性引物基因型特异性引物进行进行PCR扩增，再用特异性扩增，再用特异性探针杂交法检测扩增产物（此法特异、敏感、被广泛探针杂交法检测扩增产物（此法特异、敏感、被广泛采用）采
18、用）免疫印迹（免疫印迹（Western blot）检测病人血清中检测病人血清中基因型特异性基因型特异性抗体抗体SARS相关冠状病毒相关冠状病毒n2003年年4月，香港研究者月，香港研究者Peiris等报告了等报告了50 例严重例严重型急性呼吸道综合征型急性呼吸道综合征(serious acute respiratory syndrome,SARS)病人的临床表现和病毒学研究病人的临床表现和病毒学研究结果。结果。n一种新的冠状病毒一种新的冠状病毒(Coronavirus)是是SARS的致病的致病原因。原因。(Lancet,2003,361:9365)严重急性呼吸综合症（严重急性呼吸综合症（sev
19、ere acute respiratory syndrome,SARS）SARS冠状病毒（冠状病毒（SARS CoV）是一种新）是一种新的变种的冠状病毒的变种的冠状病毒 引起传染性非典型肺炎，是一种急性呼吸引起传染性非典型肺炎，是一种急性呼吸系统感染疾病系统感染疾病 基因组为正链单链基因组为正链单链RNA，全序列共约，全序列共约29KB 有有11个个ORF，编码：依赖于，编码：依赖于RNA的的RNA聚合酶（聚合酶（rep）、）、4种结构蛋白（种结构蛋白（S,E,M,N）、）、5种未知蛋白种未知蛋白 特点：特点：RNA和和RNA之间重组率非常高，重组改变了之间重组率非常高，重组改变了RNA序序列
20、，进一步可导致蛋白质的氨基酸序列改变，出现高变异列，进一步可导致蛋白质的氨基酸序列改变，出现高变异spike proteinmembrane proteinsmall membrane proteinnucleocapsid protein WHO推荐推荐SARS-CoV特异性检测方法：特异性检测方法：细胞分离培养：所需时间较长，分离阳性率不高细胞分离培养：所需时间较长，分离阳性率不高 免疫学检测免疫学检测;难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检难以在感染的窗口期对病毒感染进行早期检测测 分子生物学检测分子生物学检测 NASBANASBA：反应在：反应在4242进行，循环进行，循环4 4到到5
21、 5次即可扩增次即可扩增10106 6倍，倍，可以在可以在2 2小时左右将模板小时左右将模板RNARNA扩增约扩增约10109 9倍倍 RT-PCRRT-PCR、FQ-PCRFQ-PCR：大约需要：大约需要2020次循环才能扩增次循环才能扩增10106 6倍。倍。n检测标本检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺泡灌洗液、血浆、粪便。血浆、粪便。n有报道显示，在可能有报道显示，在可能SARS病人中病毒的检出病人中病毒的检出 率为率为100%。n在疑似在疑似SARS病人中的检出率为病人中的检出率为23%。n所有健康接触者中未检测到病毒。所有健康接触者中未检测
22、到病毒。另一项研究显示另一项研究显示 检测病毒的检测病毒的3种方法（血清学检测、病种方法（血清学检测、病毒分离、毒分离、PCR技术）中，技术）中，PCR技术的检出率技术的检出率最高最高。讨讨 论论nPCR技术在技术在疾病的早期即可获得阳性结果疾病的早期即可获得阳性结果(早早于血清转换期于血清转换期）。nSARS患者中的阳性率约为患者中的阳性率约为80%，提示提示(当时当时的的)PCR方法有较高的特异性但灵敏度较差，方法有较高的特异性但灵敏度较差，阴性结果不能排除病毒感染。阴性结果不能排除病毒感染。n对照中的阴性率约为对照中的阴性率约为98%100%。SARSSARS相关冠状病毒基因检测必须注意
23、的问题相关冠状病毒基因检测必须注意的问题n必须在规范的基因扩增实验室中进行。必须在规范的基因扩增实验室中进行。n应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。应采取必要的质控规程，包括阳性对照和阴性对照。n阳性结果时必须对原始样本重复检验：阳性结果时必须对原始样本重复检验：或者扩增另一个基因片段或者扩增另一个基因片段 或在另一个实验室对同一样本进行检测。或在另一个实验室对同一样本进行检测。适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分适用于检测不能或不易培养、生长缓慢的病原微生物，如结核分枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等；枝杆菌、苍白螺旋体、病毒等；通过检测细菌通过检测细菌16SrRNA基
24、因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，基因或对其测序，对细菌进行种属鉴定，并可能发现新菌种；并可能发现新菌种；进行病原体感染的早期诊断，确定感染病原体的类型；进行病原体感染的早期诊断，确定感染病原体的类型；通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展；通过对病原体核酸的定量检测动态监测疾病进展；进行病原体感染的分子流行病学调查；进行病原体感染的分子流行病学调查；对病原体进行基因分型；对病原体进行基因分型；检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，检测病原体的耐药基因等，为临床诊治、疗效观察提供科学依据，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，避免了病原体传统检测技术的缺点，避免了血清学检测的不足，如血清学检测的如血清学检测的“窗口期窗口期”问题，具有快速、特异、灵敏度高等问题，具有快速、特异、灵敏度高等优点。优点。q 病毒感染的病毒感染的潜潜伏期伏期（窗窗口口期期）血清中血清中并无并无抗抗体体的存在，的存在，无无法以法以免疫免疫学学的方法的方法来检测来检测q PCR检测检测病毒量的病毒量的变变化上，比化上，比传统传统的方法更快速，有更高的的方法更快速，有更高的特异性特异性及及灵灵敏度敏度 培养培养免疫荧光免疫荧光ELISAProbePCR检测速度检测速度+/+灵敏度灵敏度+特异性特异性+定量分析定量分析+方便性方便性+/+
