1、重点：厌氧菌的实验室检查厌氧菌的实验室检查常见厌氧菌的生物学特征常见厌氧菌的生物学特征概述概述一、厌氧菌的种类与人体分布一、厌氧菌的种类与人体分布：定义：定义：在有氧条件下不能生长，无氧的环境中才能生长的细菌。（缺乏完善的酶系统，只能以无氧发酵进行能量代谢）分类：分类：(1)(1)生物学分类生物学分类:1.1.革兰革兰+有芽胞杆菌有芽胞杆菌2.G+2.G+无芽胞杆菌、无芽胞杆菌、G-G-无芽胞杆菌、无芽胞杆菌、G+G+厌氧球菌、厌氧球菌、G-G-厌氧球菌厌氧球菌 (2)(2)对氧耐受程度分类对氧耐受程度分类:对氧极端敏感的厌氧菌、中度厌氧菌、耐氧厌氧菌对氧极端敏感的厌氧菌、中度厌氧菌、耐氧厌氧
2、菌分布：分布：自然界广泛分布，是人体正常菌群，其中肠道中厌氧菌量最多。自然界广泛分布，是人体正常菌群，其中肠道中厌氧菌量最多。二、临床意义二、临床意义感染普遍，以混合感染为主。内源性外源性，无芽胞.芽胞.感染原因感染原因1.局部组织的氧化还原电势（Eh）2.机体免疫功能 3.机体局部屏障作用破坏感染的临床及细菌学指征：感染的临床及细菌学指征：1.局部气体产生 2.发生在黏膜附近的感染3.深部外伤4.有特殊的分泌物5.某些抗生素治疗无效的感染6.其它：镜检有菌而培养阴性等临床标本肉眼观察分离培养增菌培养及直接镜检厌氧培养2-7d确定厌养培养需氧培养需氧培养厌氧培养生长无生长生长兼性厌氧菌专性厌氧
3、菌保存菌种分类鉴定药物敏感试验形态与染色菌落特性生化反应药敏性鉴定气液相色谱厌氧菌的检验厌氧菌的检验梭状芽胞杆菌属梭状芽胞杆菌属严格厌氧菌，革兰阳性严格厌氧菌，革兰阳性芽胞比菌体粗，菌体膨大呈梭状，芽胞比菌体粗，菌体膨大呈梭状，抵抗力强抵抗力强周鞭毛，无荚膜（除产气荚膜梭菌外）周鞭毛，无荚膜（除产气荚膜梭菌外）致病菌产生外毒素致病，病情严重致病菌产生外毒素致病，病情严重防治：类毒素与抗毒素防治：类毒素与抗毒素 引起人类疾病的各种常见厌氧芽胞梭菌 细菌名称细菌名称 所致疾病所致疾病 破伤风梭菌破伤风梭菌 破伤风破伤风 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌 菌血症、气性坏疽、软组织感染、菌血症、气性坏疽、软组
4、织感染、食物中毒等食物中毒等 肉毒梭菌肉毒梭菌 食物中毒、婴儿肉毒梭菌症、创伤食物中毒、婴儿肉毒梭菌症、创伤 肉毒症肉毒症 艰难梭菌艰难梭菌 抗生素相关性腹泻、抗生素相关性抗生素相关性腹泻、抗生素相关性 伪膜性肠炎伪膜性肠炎(一一)生物学性状生物学性状图图 1.1.形态染色形态染色:革兰阳性芽胞圆形，比菌体大，位于菌体顶端革兰阳性芽胞圆形，比菌体大，位于菌体顶端 呈鼓槌状，无荚膜，有鞭毛。呈鼓槌状，无荚膜，有鞭毛。2.2.培养特性培养特性:专性厌氧菌专性厌氧菌,在血平板上有迁徙生长，菌落呈羽在血平板上有迁徙生长，菌落呈羽 毛状，庖肉培养基轻度变浊，肉渣部分消化，微变黑，恶毛状，庖肉培养基轻度变
5、浊，肉渣部分消化，微变黑，恶 臭，产少量气体。臭，产少量气体。3.3.生化反应：不发酵分解糖类，硝酸盐，生化反应：不发酵分解糖类，硝酸盐，H2SH2S，明胶，明胶 4.4.抵抗力：芽胞耐抵抗力：芽胞耐12120min12120min或干热或干热1501h1501h，在干燥的土壤，在干燥的土壤和尘埃中可存活数和尘埃中可存活数对对P P、C C、E E、TETE等敏感，氨基糖苷类耐等敏感，氨基糖苷类耐 药。药。二、致病条件二、致病条件伤口需形成厌氧微环境伤口需形成厌氧微环境伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染大面积创伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺血大面积创
6、伤、烧伤，坏死组织多，局部组织缺血有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口无侵袭力，仅在局部繁殖，外毒素致病无侵袭力，仅在局部繁殖，外毒素致病对氧敏感的破伤风溶血毒素对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin)质 粒 编 码 的 破 伤 风 痉 挛 毒 素质 粒 编 码 的 破 伤 风 痉 挛 毒 素(tetanospasmin)属神经毒属神经毒(neurotoxin)，毒性极强毒性极强(对人致死量对人致死量1g)蛋白质，不耐热蛋白质，不耐热三、致病因子三、致病因子四、破伤风痉挛毒素四、破伤风痉挛毒素结构结构菌体：一条多肽菌体：一条多肽释出菌体：轻链（释出菌体
7、：轻链（A链）链）-S-S-重链（重链（B链）链）B链：神经节苷脂结合的单位链：神经节苷脂结合的单位A链：毒性作用链：毒性作用作用机制作用机制五、免疫性五、免疫性破伤风免疫属外毒素免疫，破伤风免疫属外毒素免疫，主要是抗毒素发挥中和作用主要是抗毒素发挥中和作用抗毒素人工免疫抗毒素人工免疫六、微生物学检查法六、微生物学检查法一般不进行涂片镜检和分离培养一般不进行涂片镜检和分离培养典型的症状和病史即可作出诊断典型的症状和病史即可作出诊断七、防治原则七、防治原则防止创口厌氧微环境的形成防止创口厌氧微环境的形成特异性预防：注射破伤风类毒素特异性预防：注射破伤风类毒素紧急预防：注射破伤风抗毒素（紧急预防：
8、注射破伤风抗毒素（tetanus antitoxin，TAT）特异性治疗：早期足量抗毒素及抗生素特异性治疗：早期足量抗毒素及抗生素 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌 (Cperfringens)（一）生物学性状一）生物学性状 图图1.1.形态染色：形态染色：革兰阳性革兰阳性粗短大杆菌，两端钝圆，芽胞圆形位于粗短大杆菌，两端钝圆，芽胞圆形位于 菌体中央或次极端，直径不大于菌体，但较少形菌体中央或次极端，直径不大于菌体，但较少形 成，有荚膜，无鞭毛。成，有荚膜，无鞭毛。2.2.培养特性：培养特性：生长迅速，生长迅速，代谢活跃，代谢活跃，4545生长最好生长最好血平板上双血平板上双 层溶血环，层溶血环，Na
9、glerNagler反应，反应，“汹涌发酵汹涌发酵”3.3.生化反应：生化反应：H2SH2S，明胶，葡萄糖，乳糖，麦芽糖，明胶，葡萄糖，乳糖，麦芽糖，蔗糖，卵磷脂酶蔗糖，卵磷脂酶 二、致病物质毒素毒素以以A A型产生量最大型产生量最大引起血管通透性增加伴大量溶血、组织坏死、引起血管通透性增加伴大量溶血、组织坏死、肝脏、心功能受损肝脏、心功能受损在气性坏疽的形成中起主要作用在气性坏疽的形成中起主要作用、毒素毒素引起坏死损伤和血管通透性增加引起坏死损伤和血管通透性增加肠毒素肠毒素气性坏疽气性坏疽食物中毒食物中毒三、微生物学检查法三、微生物学检查法直接涂片镜检直接涂片镜检深部创口取材涂片深部创口取材
10、涂片革兰阳性大杆菌革兰阳性大杆菌白细胞少且不典型白细胞少且不典型伴有其他杂菌伴有其他杂菌早期诊断可避免病人最终截肢或死亡早期诊断可避免病人最终截肢或死亡 分离培养及动物实验分离培养及动物实验接种血平板或庖肉培养基，镜检及生化反应鉴定接种血平板或庖肉培养基，镜检及生化反应鉴定动物实验动物实验如怀疑食物中毒，在发病后一日内，检出大于如怀疑食物中毒，在发病后一日内，检出大于105病菌病菌/克克食品或食品或106病菌病菌/克粪便可确立诊断克粪便可确立诊断 四、防治原则四、防治原则预防预防及时处理伤口，破坏和消除厌氧微环境及时处理伤口，破坏和消除厌氧微环境预防性的使用抗生素预防性的使用抗生素治疗治疗局部
11、感染的处理局部感染的处理抗生素抗生素抗毒素抗毒素高压氧舱法高压氧舱法 肉毒梭菌肉毒梭菌（一）生物学性状：（一）生物学性状：图图1.1.形态染色：形态染色：革兰阳性革兰阳性大杆菌，芽胞椭圆形位于菌体次极端，大杆菌，芽胞椭圆形位于菌体次极端，比菌体粗，呈比菌体粗，呈网球拍状网球拍状。无荚膜，有鞭毛。无荚膜，有鞭毛。2.2.培养特性：普通培养基生长，血平板上培养特性：普通培养基生长，血平板上溶血环，溶血环，庖肉培养庖肉培养 基肉渣消化，变黑，恶臭。基肉渣消化，变黑，恶臭。3.3.生化反应：生化反应：H2SH2S,明胶明胶,葡萄糖葡萄糖,乳糖乳糖,麦芽糖麦芽糖,吲哚吲哚 ,脂酶脂酶 （二）临床意义（二
12、）临床意义 肉毒毒素肉毒毒素-毒性最强毒性最强 嗜神经性嗜神经性。食物中毒。食物中毒。剧毒（对人致剧毒（对人致 死量为死量为0.10.1g)g)（三）微生物学检查（三）微生物学检查直接涂片镜检直接涂片镜检 ，分离培养，鉴定鉴别，分离培养，鉴定鉴别艰难梭菌艰难梭菌（一）生物学性状：（一）生物学性状：图图1.1.形态染色：形态染色：革兰阳性革兰阳性大杆菌，芽胞椭圆形或长方形，位于菌大杆菌，芽胞椭圆形或长方形，位于菌 体次极端，无荚膜，有鞭毛。体次极端，无荚膜，有鞭毛。2.2.培养特性：严格厌氧，血平板无溶血环，培养特性：严格厌氧，血平板无溶血环，CCFACCFA平板呈黄色菌平板呈黄色菌 落，在紫外
13、灯下可见黄绿荧光落，在紫外灯下可见黄绿荧光。3.3.生化反应：生化反应：H2SH2S,蔗糖蔗糖,葡萄糖葡萄糖,乳糖乳糖,麦芽糖麦芽糖,吲哚吲哚 ,脂酶脂酶 （二）临床意义（二）临床意义 正常菌群正常菌群。医院感染的重要病原菌。医院感染的重要病原菌。产生产生A、B两种毒素，即两种毒素，即肠毒素和细胞毒素，肠毒素和细胞毒素，引起引起假膜性肠炎假膜性肠炎（三）微生物学检查（三）微生物学检查 直接涂片镜检直接涂片镜检 ，分离培养，鉴定鉴别，分离培养，鉴定鉴别 革兰阴性无芽胞厌氧杆菌革兰阴性无芽胞厌氧杆菌临床厌氧菌感染中最常见的病原菌临床厌氧菌感染中最常见的病原菌一、类杆菌属一、类杆菌属 BBEBBE平
14、板上有黑色晕圈平板上有黑色晕圈二、普雷沃菌属二、普雷沃菌属图图 KVLBKVLB出现黑色菌落出现黑色菌落三三、卟啉单胞菌属卟啉单胞菌属四四、梭梭杆菌属杆菌属 革兰阳性无芽胞杆厌氧杆菌革兰阳性无芽胞杆厌氧杆菌一、丙酸杆菌属一、丙酸杆菌属二、优杆菌属二、优杆菌属三三、乳酸杆菌乳酸杆菌属属四四、双歧杆菌属双歧杆菌属 厌氧性球菌厌氧性球菌一、消化球菌属一、消化球菌属革兰阳性革兰阳性黑色消化球菌黑色消化球菌二、消化链球菌属二、消化链球菌属革兰阳性革兰阳性厌氧厌氧消化链球菌消化链球菌图图三三、韦荣球菌属韦荣球菌属革兰阴性革兰阴性小韦荣球菌小韦荣球菌标本采集标本采集采集时注意不被正常菌群污染，尽量避免接触空
15、气采集时注意不被正常菌群污染，尽量避免接触空气易污染标本不宜厌氧培养易污染标本不宜厌氧培养齿龈、咽喉拭子、痰液或气管吸出物、小肠内容物、阴道或宫颈拭子、尿液或导尿液、粪便、洗胃液、皮肤表面或伤口边缘等标本不同部位标本采集法不同部位标本采集法 针筒抽取、穿刺术、外科切开等即送即检，避免标本干燥、接触空气和低温保存即送即检，避免标本干燥、接触空气和低温保存1.针筒运送法：各种液体标本，简便易行 2.无菌小瓶法：少量脓液运送，加指示剂 3.厌氧袋法：床边接种4.标本充盈法：大量液体标本5.组织块运送法：厌氧罐，钢丝绒 6.棉拭子法：急需时用A、B管检验方法检验方法 直接镜检直接镜检形态、大小、排列、
16、染色性、有无芽胞、形态、大小、排列、染色性、有无芽胞、色素、气味等特色素、气味等特分离培养分离培养1.初代培养：初代培养：1）培养基：新鲜、预还原）培养基：新鲜、预还原 非选择性培养基非选择性培养基：BAP(血、血、维生素、氯化血红素等维生素、氯化血红素等)选择培养基选择培养基：KVLB、EYA、BBE、TS2）标本接种）标本接种固体和液体培养基同时接种固体和液体培养基同时接种3）培养方法）培养方法厌氧罐培养法、厌氧气袋培养法、厌氧培养箱培养法厌氧罐培养法、厌氧气袋培养法、厌氧培养箱培养法 4）结果观察）结果观察 2.次代培养和厌氧菌在确定次代培养和厌氧菌在确定 3.厌氧菌培养失误的原因厌氧菌
17、培养失误的原因 采集运送采集运送 培养基培养基 厌氧环境厌氧环境 时间等因素时间等因素 厌氧罐法厌氧罐法以物理或化学方法造成无氧环境以物理或化学方法造成无氧环境图图美蓝指示剂（有氧美蓝指示剂（有氧蓝色蓝色）刃天青指示剂（有氧刃天青指示剂（有氧红色红色）抽气换气法：抽气换气法：10%H10%H2 2、10%CO10%CO2 2、80%N80%N2 2、钯粒、钯粒 冷触媒法：冷触媒法：产气袋、钯粒、美蓝钯粒产气袋、钯粒、美蓝钯粒硼氢化钾、碳酸氢钠、枸橼酸药片硼氢化钾、碳酸氢钠、枸橼酸药片 C C2 2O+O+H H2 2H H2 2O O钢末法：钢末法：O O2 2黄磷燃烧法：黄磷燃烧法：气袋法：
18、气袋法：图图 原理同上冷触媒法简便 厌氧手套箱：厌氧手套箱：图图 设备自动 其他：其他：OxyplatesTM（氧净）厌氧培养皿可反复打开，Oxyrase酶系统能使培养基中O2去除，并产生CO2。鉴定试验 形态与染色：形态与染色：用用24h内幼龄菌，多染色性，多形性内幼龄菌，多染色性，多形性 菌落性状：菌落性状：色素、溶血、荧光等色素、溶血、荧光等 生化试验：生化试验：糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验等 抗生素敏感试验：抗生素敏感试验：灭滴灵（厌氧菌灭滴灵（厌氧菌S）、卡那霉素（梭杆）、卡那霉素（梭杆S）、万古霉素等）、万古霉素等聚茴香脑磺酸钠（聚茴香脑磺酸钠（SPS）敏感试验：
19、）敏感试验：厌氧消化链厌氧消化链S气液相色谱技术（气液相色谱技术（GLC）厌氧菌产生大量的有机酸（挥发性和非挥发性脂肪酸），厌氧菌产生大量的有机酸（挥发性和非挥发性脂肪酸），过柱分析定性定量过柱分析定性定量DNA G+C mol%值差越大，亲值差越大，亲缘关系越远缘关系越远药物敏感试验考虑做体外药敏试验的临床情况：明确厌氧菌引起的严重感染、已确证厌氧菌感染而经验用无效、需长期用药的厌氧菌感染。方法方法 培养基培养基 接种浓度接种浓度 孵育时间孵育时间 优点优点琼脂稀释法琼脂稀释法 布氏血琼脂布氏血琼脂 105细胞点细胞点 48H 可同时测多可同时测多 个菌株个菌株肉汤稀释法肉汤稀释法 布氏心老
20、浸液布氏心老浸液 106CFUML 48H 经济，可商经济，可商 品化品化 E试验试验 布氏血琼脂布氏血琼脂 0.5麦氏比浊度麦氏比浊度 2448H MIC精确精确内酰胺酶内酰胺酶 琼脂培养基琼脂培养基 单个菌落单个菌落 3050min 经济快速经济快速 检测对青检测对青 霉素霉素G和和 AMP的耐药的耐药 厌氧菌直接镜检初步鉴别厌氧菌直接镜检初步鉴别 菌名菌名 革兰染色革兰染色 形态及其他特征形态及其他特征 破伤风杆菌破伤风杆菌 G+b 细长、梭形或鼓状，有芽胞、周鞭毛细长、梭形或鼓状，有芽胞、周鞭毛 产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌 G+b 粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜有荚膜 放线菌放线菌 G+b 分支呈棒状、分支呈棒状、X、Y、V或栅状，脓汁或栅状，脓汁 中的黄色颗粒有琥珀酸气味中的黄色颗粒有琥珀酸气味产黑色素类杆菌产黑色素类杆菌 G-b 多形性，长短不一，标本有恶臭，多形性，长短不一，标本有恶臭，琥珀味，紫外线照射发红色荧光琥珀味，紫外线照射发红色荧光韦荣球菌韦荣球菌 G-c 极小的革兰阴性球菌极小的革兰阴性球菌消化链球菌消化链球菌 G+c 革兰阳性呈现链状的小球菌革兰阳性呈现链状的小球菌
