1、2009.3.10了解微生物的功能了解微生物与环境的关系有益微生物有用的基因环境指标对微生物种类定性对微生物功能定性对特定的基因定性和定量研究微生物或微生物基因的表达如何受环境调控？收集培养筛选鉴定克隆特定基因（同源序列，表达文库，消减杂交等方法）99%的土壤微生物是不可培养的培养中的土壤微生物功能不完善某些在极端环境生活的微生物原位研究方法以提取土壤DNA和RNA为基础，结合一系列研究方法优点：无需培养，直接反映环境中微生物的状态；所研究是微生物同环境直接的关系缺点：从土壤样品提取DNA和RNA的效率不同处理方法的效果DNA芯片实时定量-PCR稳定同位素探针报告基因基因芯片是将大量靶基因（或
2、基因片段）有序地、高密度地点在玻璃片或硅片或塑料片上等载体上，形成矩阵。将待侧样品用荧光染料标记制备成探针与芯片杂交，杂交信号用激光扫描仪检测，计算机分析检测结果，可获得类似与传统的点杂交的杂交数据，以达到快速、高效、高通量及平行性的分析生物信息的目的。1992年，Affymatrix公司Fodor领导的小组运用半导体照相平板技术，对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道，这是世界上第一块基因芯片。1995年，Stanford大学的P.Brown实验室发明了第一块以玻璃为载体的基因微矩阵芯片。标志着基因芯片技术进入了广泛研究和应用的时期高通量微型化自动化低成本高度并行实时荧光定量PCR技术于19
3、96年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系荧光染料嵌合法探针法氯化铯密度梯度离心可以检测
4、不同环境下基因的表达通过融合表达，可以对特定基因进行定量分析绿色荧光蛋白（GFP）,发现于水母（Aequorea victoria）和海肾（Renilla reniformis）GFP在原核和真核生物中都能表达，不需要底物和协同因子，很容易被检测，即使单个细胞，具有很好的稳定性GFP16S rRNA鉴定微生物功能基因的克隆环境微生物原位方法环境基因组文库RT-PCR培养方法对微生物种类及功能的鉴定对微生物基因表达定性定量分析特定基因表达同环境的关系各种方法和技术培养方法：形态、生理生化指标等，16S rRNA技术原位方法：16S rRNA结合DNA芯片技术16S rRNA是原核生物的一种核糖体
5、RNA其在生物进化过程中，序列变化非常缓慢，可用来标记生物进化距离和亲缘关系。分析的一般方法是从微生物样本中提取16S rRNA基因片段，通过测序获得序列信息，再与16S rRNA数据库中的序列进行比较，确定其在进化树中的位置，从而鉴定微生物种类目前，GEN-BANK已经涵盖了不下10万种原核生物的16S rRNA基因序列信息培养方法：抗逆，特殊氮源、碳源的利用，毒性等原位方法：特定基因的表达研究功能基因的定性：基因芯片，同源序列克隆，环境基因组计划，差异显示技术，分子信标功能基因的定量：Northern，原位杂交，RNase保护实验，RT-PCR营养状况同污染物的分解相关的基因含氧状态土壤p
6、H土壤温度和湿度碳源氮源磷源微生物的固氮作用相关基因的表达及调控大量的微生物可以利用土壤环境中非自然的污染物。研究土壤环境中的生物回收技术是可行的，但是，成功的回收有赖于稳定而强大的微生物活力。大量的环境因子会影响与生物回收相关的微生物的活力。一些研究者已经开始应用功能基因作用于环境污染物的降解。Holden等鉴定了受十六烷污染的沙中表达的表面活性组分基因。将gfp融合在pra和rhlR的启动子后边，其中pra编码的PA蛋白起乳化作用。使用灭菌的石英砂作为培养基质。当16烷是唯一碳源时，细菌最初的C:N是12。gfp表达表明pra和rhlR都被诱导了。然而，即使这些编码表面活性组分的基因转录被
7、激活了，细菌降解十六烷的能力仍未提高。启动子陷阱氧是土壤中另一环境因子，土壤微生物必需适应环境中氧浓度的不断变化。在缺氧条件下，一些特定的蛋白获得了大量的表达。然而，对于土壤环境中氧对基因表达的调节还缺乏直接的数据。用lux同参与萘降解途径的基因融合在对土壤的生物发光量直接探测时，使用了一种便携式照片扩增管，使用时只需将小管插插入不同深度的土壤中就可以定量了研究表明氧是萘降解的一个限制因子，也是影响萘降解途径表达的关键因子。Baumann等用点杂交检测了硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化氮还原酶的mRNA的转录水平。发现氧会限制这些基因的表达，同时也会抑制Paracoccus denitrificans
8、的去硝化过程。细菌在有氧和无氧条件下都能生长，在无氧条件下酶的最大表达量同N2O的最大合成率相一致，而N2O是去硝化过程的气体产物。在缺氧条件下去硝化过程加强而在有氧条件下去硝化过程减弱。土壤pH对土壤微生物的生理、形态和代谢有重大影响土壤微生物生存环境中的含水量变化范围很大，水对细胞的所有生理功能都很重要，因此，湿度会影响土壤微生物的基因表达温度在土壤微生物的很多化学反应和生物相互作用中起着重要作用。土壤中，温度变化最快的部分为表面部分。因此，对这部分土壤中微生物来说温度对它们的基因表达有着深远的影响。对土壤微生物的研究依赖于新技术和新方法的应用新技术和新方法的应用使研究水平大为提高，但是，现有方法均在某方面存在缺陷比如：DNA芯片忽略了基因的多样性，Real-time PCR对引物或探针的特异性要求很高，稳定同位素技术需要很长的实验周期，报告基因表达不受控制等原位研究的核心难题还是核酸的提取对一些因素还没有很好的研究方法，比如基因表达的时效性
