1、实验二、血涂片的制备和瑞氏染色及血细胞记数n血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极广泛，特别是对于各血液病的诊断具有重要的价值。n血涂片制备是血液学检查的重要基本技术之一。一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。n血涂片制备时手工推片法用血量少、操作简单，是最广泛应用的方法。实验目的n学习涂片制备的一般方法学习涂片制备的一般方法n学习瑞氏染色的方法学习瑞氏染色的方法n学习辨认各种血细胞学习辨认各种血细胞n学习血细胞级数学习血细胞级数实验原理n用推片法将血液制成薄的血涂片，使血细胞成单层排列。n瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Met
2、hvlem blue）和酸性染料伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝 染料即瑞氏（美蓝伊红Y）染料。n甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。n细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩。n例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。n瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，染色主要是化
3、学作用，是离子彼此结合的反应。n甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。实验材料n1、材料：蛙血和羊血n2、瑞氏染液n3、普通显微镜、玻片实验操作1 1、清洁清洁载玻片：载玻片：2 2、加样：加样：在干净的载玻片右面在干净的载玻片右面1 13 3 处滴血一滴。取另一张载玻处滴血一滴。取另一张载玻片作为推片，让推片的一端与血滴接触，并与血滴玻片成片作为推片，让推片的一端与血滴接触，并与血滴玻片成35354545夹角。夹角。3 3、推片：推片：待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片
4、待血液沿着两块载玻片接触线向两边扩散后，将推片保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血保持夹角，向血玻片左侧均速推进，血液随推片而行，在血玻片上形成一层血膜，即为血涂片。玻片上形成一层血膜，即为血涂片。图1-6 推片流程：流程：清洁加样推片干片选区染色洗片清洁加样推片干片选区染色洗片4 4、干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。、干片：推好的血涂片在空气中晃动，使其迅速干燥。5 5、选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血、选区：在显微镜下观察，寻找涂片中均匀分散良好的血膜，用蜡笔在四周画线，作为堤坝。膜，用蜡笔在四周画线，作为堤坝。6 6、染色：滴加适量的瑞氏染液
5、覆盖选定区域，染、染色：滴加适量的瑞氏染液覆盖选定区域，染1 1分钟；在分钟；在滴加稍多的滴加稍多的PH6.4PH6.4的的PBSPBS缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面缓冲液稀释染液，轻摇混匀，液面浮现一层金黄色金属物质，然后静置染色浮现一层金黄色金属物质，然后静置染色5 510min10min。7 7、洗去多余染液：用流水或滴加蒸馏水直接洗去浮液。、洗去多余染液：用流水或滴加蒸馏水直接洗去浮液。8 8、观察辨认各种细胞。、观察辨认各种细胞。区分：红细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等注意事项n血量不能多，标本过厚，细胞重叠不便观察，并且造成细胞皱缩变形。n染液PH值是6.4-
6、6.8，染色偏酸或偏碱都会使染色反应异常。PH对细胞染色有影响。由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。二、血细胞记数n细胞计数法是用来计数细胞悬液中细胞数量的一种方法，一般利用计数板（血球计数板）进行。分两步：n1、制备细胞悬液n2、计数与计算目的:学习掌握细胞计数的基本方法及误差消除方法
7、。n血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。n n每一个大方格边长为1，则每一大方格的面积为12，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1，所以计数室的容积为0.13。n使用步骤：使用步骤：1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、镜下观察。n用血细胞计数板计数。1）一般计数四周大方格四周大方格内细胞，密度计算公式为：细胞密度（个/ml）(
8、4(4大方格细胞总数大方格细胞总数/4)/4)1000010000稀释倍数稀释倍数2）记数中间大方格内细胞，公式为：细胞密度（个/ml）（5 5个中方格总数个中方格总数/5)/5)25 25 1000010000稀释倍数稀释倍数注意事项：注意事项：n务必使分散成单个细胞，取样计数前，充分混匀细胞悬液。n计数板及盖玻片应彻底用酒精棉球擦洗干净。n注意方法：加样时要先盖好盖玻片，再加样品。用细口滴管将细胞悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让悬液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室。（或用10l的加样枪缓慢从盖玻片边缘加样，直到悬液到达计数室另一边。）n计数原则：对压线细胞，计左不计右，计上不计下。n显微镜下计数时，遇到2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如果细胞团10，说明细胞分散不充分。
