1、第七章基因的定点诱变第七章基因的定点诱变n突变是研究基因结构与功能的最基本手段。n经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。传统的诱变方式n利用能够修饰利用能够修饰DNA分子的化学或物分子的化学或物理诱变剂处理生物体理诱变剂处理生物体射线（紫外线、X射线、射线等）化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）n不足不足n生物体的任何基因都可能发生突变，生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难目的基因突变率较低，筛选困难n即使获得期望表型的突变体，无法即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上保证突变确实发生在目的基因上n在基因克隆和核酸测
2、序技术发展之在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和前，无法知道基因中突变的位置和性质性质Directed evolution （定向进化定向进化或直接进化直接进化）对目的基因人为制造大量突变，然后按照特定的需要和目的，给予选择压力，反复诱变，循环筛选，将满足要求的、适合特定目的的分子筛选出来，获得满足需要的性能改良的蛋白质，从而实现在试管中分子水平的模拟进化。基因直接进化的步骤基因直接进化的步骤n突变突变 基因突变库的建立基因突变库的建立n筛选筛选 基因突变库的活体或离体筛选基因突变库的活体或离体筛选Key steps of a typical directed enzy
3、me evolution experiment 局限性突变体子代频率低二、Altered Sites II in vitro mutagenesis system重叠部分在5末端，与待融合的DNA片段序列互补。外切核酸酶III的消化利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列4.在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上生物体的任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。DNase I
4、的消化目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因经典的方法是根据突变体的表型，采用遗传学的方法鉴定相应的基因。把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引入
5、碱基错配，导致目的基因的随机突变体外诱变n是对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因。研究基因的结构与功能的关系，获得所需功能的突变体蛋白质n主要方法有随机诱变，DNA体外重组，寡核苷酸介导的定点诱变，嵌套缺失第一节 随机诱变n随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变，引入位置和性质均为随机性的。n包括1.错误掺入诱变（易错PCR)n 2.盒式诱变n 3.增变菌株的诱变作用n 4.化学诱变随机突变的策略随机突变的策略1.易错PCR（errorprone PCR）在扩增目的基因的过程中，通过改变PCR反应的条件（如改变4种dNTP的比例、改变Mg2+的浓度等），在PCR过程中引
6、入碱基错配，导致目的基因的随机突变2.盒式诱变盒式诱变 Cassette mutagenesis 利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列 包括两种方式 盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变E c o R IH in d I I IH in d I I IE c o R IH in d I I IE c o R IE c o R IH in d I I I突 变D N A野 生 型D N A野 生 型D N A人 工 合 成 的 寡 核 苷 酸 片 段退 火D N A连 接 酶突 变 体 序 列移 走 小 片 段H in d I I IE c o R I
7、野 生 型D N A简单盒式取代诱变混合寡核苷酸诱变n用于取代的是含有随机突变的混合双联寡核苷酸，可引入大量的随机突变。n在合成寡核苷酸片段时，需要带限制性内切酶位点，以便介导它们互为引物利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体还是一个内切核酸(单链，nick,gap)即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接Insert target DNAdut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dU
8、TP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和
9、模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等）Digest DNA(primary digestion)dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置ss DNA 制备载体利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体DNaseI酶切将基因随机切割成约50100bp左右的小片段Splicing by overlap extension3增变菌株的诱变作用n因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发
10、突变频率较小。n与校正和修复有关的基因突变后细胞内基因突变频率大大增加，这样的菌株叫突变菌株。n流程n把携带待突变基因的质粒转入增变菌株扩增，随机突变体库。n把该库的重组质粒转化到正常宿主中，筛选鉴定突变体。4 化学诱变化学诱变剂（亚硝酸、羟胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亚硝基胍等）处理DNA片段，产生随机突变体库。DNA体外重组n依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌(DNA shuffing)，交错延伸（StEP)，随机引发重组（RPR).2.DNA shuffling （DNA 重排或改组）重排或改组）DNA shuffling 是指DNA分子的体外重组,是基因在分子水平上进行有性
11、重组。通过改变单个基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能基本步骤基本步骤:n目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基目的基因片段的准备根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因性的基因nDNaseI酶切将基因随机切割成约酶切将基因随机切割成约50100bp左右左右的小片段的小片段n不加引物的不加引物的PCR在在Taq酶的作用下将切割后的酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组可能发生许多突变和重组n加引物的加
12、引物的PCR加入目的基因片段两端的引物加入目的基因片段两端的引物,使使连接好的连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。得到扩增，筛选正突变。基因家族的改组基因家族的改组交错延伸重组 图105n以两个以上的有一定同源性的DNA片段为模板进行PCR反应，通过交换模板机制实现DNA序列的重新组装。n不需要DNaseI切割DNA，简化了程序。随机引发重组 图106n用一套随机引物与模板配对延伸，产生不同位点的短DNA片段混合物（含有少量点突变），以这些短DNA片段为引物重新组装成全长基因。寡核苷酸介导的定点诱变寡核苷酸介导的定点诱变 基本原理基本原理 使用化学合成的含有突变碱基的寡使用化学合成的含有突变碱
13、基的寡核苷酸片段作为引物，启动单链核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成便成为了新合成DNA子链的一个组成子链的一个组成部分，因此所产生出来的新链便具有已部分，因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列发生突变的碱基序列作为诱变剂的寡核苷酸序列n人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补n错配碱基的位置应设计在寡核苷酸分子的中央部位，每侧至少1015个碱基n通常采用化学合成n无回文，重复和自身互补序列基本步骤基本步骤将待突变的目的基因插入将待突变的目的基因插
14、入M13噬菌体噬菌体载体，制备单链载体，制备单链DNA将合成的寡核苷酸片段与单链模板退将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在火，在DNA聚合酶作用下合成互补聚合酶作用下合成互补的双链的双链DNA将双链将双链DNA转化大肠杆菌，获得突变转化大肠杆菌，获得突变基因基因突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选法法2.外切核酸酶III的消化作为诱变剂的寡核苷酸序列加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。依赖钙离子 EGTA可抑制活性在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质Digest DNA(primary dig
15、estion)coli CJ236 dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)因为DNA复制酶有校正功能及DNA复制后修复系统，正常大肠杆菌自发突变频率较小。细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基在基因克隆和核酸测序技术发展之前，无法知道基因中突变的位置和性质设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补ss DNA 制备载体dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置Mg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机（DNA 重排或改组）利用一段人
16、工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键Splicing by overlap extension利用能够修饰DNA分子的化学或物理诱变剂处理生物体Transform E.AGT CGAAAGT CGAATCA GCTGAGT CGAATCA GCTGTCA GCTTAGT CGACTCA GCTGTCAGGCT化学合成的寡核苷酸野生型突变型单链的重组分子M 1 3杂交退火D N A聚合酶D N A连接酶转化大肠杆菌 局限性突变体子代频率低局限性突变体子代频率低退火时，有些单链模板退火时，有些单链模板DN
17、A未与寡核苷酸未与寡核苷酸配对配对细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新细胞内甲基介导的错配修复机制会修复新合成链中的错配碱基合成链中的错配碱基 dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些 dUTP可掺入DNA中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置一、Kunkel 法 或称“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基1背景知识E.coli(dut-/ung-)合成的 DNA含有尿嘧啶，M13噬菌体DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基E.col
18、i CJ236 dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105 is a F plasmid ss DNA 制备载体ss DNA 制备载体单链噬菌体载体 phagemid载体UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInsert target DNA转化 E.coli CJ236M13K07感染Isolate phagemid ss DNA与突变寡核苷酸退火T4 DNA polymeraseDNA ligase2原理原理只有突变链能复制转化E.coli MV1190(dut+/ung+)水解U和脱氧核糖磷酸的N-糖苷键图10-7二、二、Altered Sites II in
19、 vitro mutagenesis system位点选择定点诱变法 三、三、Transformer Site-Directed mutagenesis转化子诱变法 Synthesize second strandDigest DNA(primary digestion)Transform E.coli mutS to propagate plasmidsIsolate and digest(Second digestion)Transform E.coliIsolate DNADNA shufflingA digestionDNaseI酶切将基因随机切割成约50100bp左右的小片段生物体的
20、任何基因都可能发生突变，目的基因突变率较低，筛选困难突变体的筛选寡核苷酸探针杂交筛选法加引物的PCR加入目的基因片段两端的引物,使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变。人工合成一段寡核苷酸序列，该序列中除了所需的碱基突变外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补将合成的寡核苷酸片段与单链模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互补的双链DNATransform E.（DNA 重排或改组）即使获得期望表型的突变体，无法保证突变确实发生在目的基因上四、PCR定点诱变Digest DNA(primary digestion)Synthesize second strand把该库的重组质粒转化到正常宿主中
21、，筛选鉴定突变体。依赖钙离子 EGTA可抑制活性设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3末端，起引物作用；利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相应序列四、PCR定点诱变1.大引物PCR诱变图10-102.重叠延伸 Overlap extension对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导DNA的合成，从而形成杂合DNA双链3、SOE 重叠延伸剪接术 Splicing by overlap exten
22、sion可用于将两个 DNA片段在所期望的位点进行连接 设计一个寡聚体引物，其序列包含两个部分，“引发”和“重叠”部分，引发部分在3末端，起引物作用；重叠部分在5末端，与待融合的DNA片段序列互补。设计另一个引物，该引物与上一个引物完全互补ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重叠延伸PCRAB第二节 嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化Exonuclease III5353532.BAL 31的消化 主要活性为3外切核酸酶活性，可从线性DNA两条链的3端去掉除单核苷酸，还是一个内切核酸(单链，nick,gap)依赖钙离子 EGTA可抑制活性AABA digestionvectorinsertBAL 31B digestionDeleted inserts cloned to plasmid vector3.DNase I 的消化内切酶，可优先嘧啶核苷酸水解 ds or ss DNAMg2+:独立作用于每条DNA链，位点随机Mn2+:大致在同一位置切割dsDNA 产生平端 或1-2个核苷酸突出
