1、 提高细菌耐药性监测质量提高细菌耐药性监测质量努力做好细菌性监测努力做好细菌性监测中国细菌耐药性监测（中国细菌耐药性监测（CHINET）网）网安徽省细菌耐药监控中心安徽省细菌耐药监控中心安徽医科大学第一附属医院安徽医科大学第一附属医院沈继录沈继录细菌耐药性的现状细菌耐药性的现状v抗生素的不断研发大大地降低了传染性疾病的发病率和死亡率，但细菌耐药性的出现和蔓延却严重地威胁和破坏着人类抗感染治疗的效果。v随着国际旅游事业的发展和经济贸易的全球化，使耐药菌株也在国际间广泛传播，从而导致细菌对抗生素耐药现象的全球化。v近年来，细菌耐药性已成为全球医疗领域中颇受关注的问题之一。（一）耐药的革兰阴性菌主要
2、问题v 氟喹诺酮类药物的耐药性高居不下：染色体：DNA促旋酶（gyrA和gyrB）和拓扑异构酶（parE和parC）基因发生点突变；OmpF减少或缺失导致细菌膜通透性降低；外排泵质粒：质粒介导的Qnr；QepA外排泵；AAC（6）-Ib-cr 氨基糖苷钝化修饰酶v 产-内酰胺酶菌株不断增多：ESBLs菌株：大肠埃希菌、克雷伯菌属AmpC酶：肠杆菌属细菌、枸橼酸杆菌属碳青霉烯酶：A类：KPC：肠杆菌科细菌B类IMP、VIM、NDM：铜绿假单胞菌、肠杆菌科细菌D类：OXA：不动杆菌v 多重耐药及泛耐药的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌v 嗜麦芽窄食单胞菌增多（二）耐药的革兰阳性菌主要问题v 金葡菌(尤其
3、是MRSA)耐药株感染的发生率高v 耐青霉素肺炎链球菌（PISP，PRSP）的出现和传播v 万古霉素耐药肠球菌（VRE）v 万古霉素中介和耐药金葡菌（VISA、VRSA）v 耐青霉素和耐头孢菌素类草绿色链球菌v 庆大霉素高耐的肠球菌氟喹诺酮类药物的耐药性氟喹诺酮类药物的耐药性v 我国自1985年第一个氟喹诺酮类药物诺氟沙星(norfloxacin，氟哌酸)问世以来，数十种不同品种的口服或静脉制剂已投入临床应用，在治疗各类感染获得良好疗效的同时，也出现了病原菌耐药性的增长。v 耐药性增长最显著的是大肠埃希菌，对氟喹诺酮类药物的耐药率自1989年的05，至1992年的32411993年至今已达50
4、60甚至更高。v 肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌对该类药物的敏感性则有差别，产超广谱内酰酶(ESBLs)者耐药率较高，可达50或更高，非产ESBLs者耐药率1640。v 阴沟肠杆菌、沙雷菌属、变形杆菌属、志贺菌属等的耐药率多低于2030。伤寒沙门菌等则10。CHINET 2005-2009产ESBLs和非产ESBLs肠杆菌科细菌对Ciprofloxacin的耐药率(%)E.coliK.pneumoniae and K.ox ytocaP.mirabilis年份年份ESBL+ESBL-ESBL+ESBL-ESBL+ESBL-200586567121200675.946.552.616.929.927
5、.4200771.844.346.716.061.824.6200871.841.845.316.666.327.9200971.042.442.316.669.230.5CHINET 产ESBLs细菌的检出率年份年份大肠大肠肺克和产酸肺克和产酸奇异变形杆菌奇异变形杆菌201058.3%49.7%14.0%201150.7%38.5%13.8%201255.3%33.9%20.7%大多数医院的大肠埃希菌中的产ESBLs菌株的检出率 高于 肺炎克雷伯菌中的ESBLs的检出率质粒AmpC酶的世界流行状况非洲非洲ACC-1，CMY-4亚洲亚洲MOX-1，DHA-1，ACT-1,FOX-2，CMY-I
6、/2/6/7/8/9/10/11/15/16/18/21/21/22/26欧洲欧洲BIL-1，CMY-2/3/4/5/12/13，DHA-1/2，FOX-2/4，LAT-1/3/4，MOX-2，ACC-1美洲美洲MIR-1，ACT-I，FOX-1/2/5/6/8/10，CMY-2/3/4/5/19/20/23/24/25我国pAmpC酶的检测状况北京协和医院北京协和医院ACT-1，CMY-2首都医科大学首都医科大学DHA-1，CMY-2中山医科大学中山医科大学DHA-1,ACT-1,CMY-2浙江医科大学浙江医科大学DHA-1，CMY-2/4/11上海市传染病医院上海市传染病医院DHA-I，C
7、MY-2安徽医科大学安徽医科大学DHA-1，ACT-1/2，CMY-2，MOX-4，ACT-6DHA-1,ACT-1,CMY-2(北京)DHA-1,CIT,ACT-1 CMY-2(上海)DHA-1、2(浙江)DHA-1,ACT-1(广州)DHA-1 是中国主要的流行质粒介导的AmpC酶 DHA-1,CMY-2 CMY-22(福建)DHA-1(哈尔滨)DHA-1,(天津)DHA-1,CMY-2(湘雅)碳青酶烯酶分类分类酶酶最常见的细菌最常见的细菌Class A KPC,SME,IMI,NMC,GES肠杆菌科肠杆菌科(铜绿中报道较少铜绿中报道较少)Class B(金属金属-b b-内酰胺酶内酰胺酶
8、)IMP,VIM,GIM,SPMNDM-1铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌不动杆菌属不动杆菌属Class DOXA不动杆菌属不动杆菌属耐碳青霉烯菌株的碳青霉烯酶基因分型耐碳青霉烯菌株的碳青霉烯酶基因分型细菌名称菌株数基因型检出率鲍曼不动杆菌34OXA-2321%(7/34)OXA-23+OXA-6627%(9/34)OXA-23+OXA-24+OXA-6632%(11/34)OXA-24+OXA-666%(2/34)OXA-663%(1/34)检测阴性12%(4/34)洛菲不动杆菌7OXA-23100%(7/7)弗劳地柠檬酸杆菌11KPC-2IMP-8 新亚型55%(6/11)
9、KPC-246%(5/11)肺炎克雷伯菌5KPC-2100%(5/5)粘质沙雷菌1KPC-2100%(1/1)沈继录，朱德妹。中华检验医学杂志沈继录，朱德妹。中华检验医学杂志 2008;31(4):408-414MDR、XDR及及PDR鲍曼不动、铜绿鲍曼不动、铜绿v对具有抗绿脓作用的头孢菌素类、碳青霉烯类、内酰胺酶抑制剂复方、FQ类和氨基糖苷类5类中的3类或3类以上耐药者为多重耐药株v泛耐药株是对目前推荐用于上述细菌感染经验用药全部耐药者(包括多粘B/粘菌素)v导致上述感染几乎无药可治CHINETCHINET XDR XDR菌株的检出率菌株的检出率 XDR菌株指的是对第三、四代头孢菌素、酶抑制
10、剂复方制剂、碳青霉烯类、氟喹诺酮类和氨基糖苷类均耐药的菌株。但对多粘菌素敏感其他肠杆菌科其他肠杆菌科肺炎克雷伯菌肺炎克雷伯菌铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌201120121.21.2%0.70.7%3.83.8%2.32.3%41.3%41.3%16.4%16.4%鲍曼不动杆菌鲍曼不动杆菌1.71.7%1.1.8 8%21.421.4%21.21.7 7%20101.8%1.8%1.7%1.7%17%17%0.8%0.8%CHINETCHINET监测网监测网 金葡菌中金葡菌中MRSAMRSA检出率检出率年份年份中国中国CHINET菌株数菌株数G(+)G(+)菌菌金葡金葡%MRSA%MRSA%2005
11、2005227742277433.133.129.029.069.269.220062006339453394531.831.828.728.758.458.420072007360013600134.334.327.427.458.058.020082008362163621630.530.532.232.255.955.920092009436704367029.029.032.532.552.752.720102010478504785028.428.432.832.851.751.720112011592875928728.528.535.635.650.650.62012201272
12、3977239728.128.136.136.147.947.9金葡菌中金葡菌中MRSA的检出率：的检出率：CHINET耐药性监测网显示耐药性监测网显示52%69%；MRSA的检出率有所下降的检出率有所下降1515MRSAMRSA中万古霉素不敏感株的出现中万古霉素不敏感株的出现万古霉素1995年上市1988年出现VRE1996年日本首次报道：MU3 万古霉素MIC 4mg/L(VISA)此后又报道MU50 万古霉素MIC 8mg/L(VISA)2002年美国首次报道VRSA迄今全球已报道VISA超过100株，VRSA16株，其中美国12株16161717检出率（%）PISP、PRSP在儿童中的
13、检出率在儿童中的检出率(中国中国CHINET 2006-2010)按按2008年年 CLSI 非脑膜炎肺炎链球菌的青霉素的批准标准非脑膜炎肺炎链球菌的青霉素的批准标准 S2、I=4、R8mg/L,儿童中儿童中PSSP由由2006年的年的94%下降到下降到2010年的年的65.8%；PISP 和和PRSP分别由分别由2006年的年的2.8%和和3.7%上升到上升到2010年的年的20.1%和和14.2%成人中的PSSP的检出率(90%)高于儿童中国中国CHINET VRE肠球菌的检出率肠球菌的检出率年份年份粪肠球菌粪肠球菌屎肠球菌屎肠球菌vanA受试株VRE株%受试株VRE株%粪肠屎肠20112
14、06220.12073763.70312010 1829110.61817653.66412009176450.31605563.54522008152060.41339433.26372007121860.51017212.162120061298001135121.1011200510630085530.402*VRE菌株已在我国一些综合性医院出现，主要存在于屎肠球菌，检出率有上升趋势，大多是van A 和van B 基因型！屎肠球菌的耐药率粪肠球菌，但氯霉素反之屎肠球菌的耐药率粪肠球菌，但氯霉素反之粪肠球菌对呋喃妥因、磷霉素、氨苄西林的耐药率低粪肠球菌对呋喃妥因、磷霉素、氨苄西林的耐药率
15、低少数屎肠球菌、粪肠球菌对万古霉素、利奈唑胺或替考拉宁耐药少数屎肠球菌、粪肠球菌对万古霉素、利奈唑胺或替考拉宁耐药 耐药菌感染引起的后果v 危害人类健康，对婴幼儿和老年人、免疫机制低下者的生危害人类健康，对婴幼儿和老年人、免疫机制低下者的生命构成威胁。命构成威胁。v 治疗失败、发病率和病死率增加，不良反应增多、病程延治疗失败、发病率和病死率增加，不良反应增多、病程延长，住院天数增加，床位周转率低长，住院天数增加，床位周转率低v 细菌产生耐药性、耐药菌感染及难治性感染增多，医疗费细菌产生耐药性、耐药菌感染及难治性感染增多，医疗费用增加等用增加等v 花费大量的抗菌药物，使国家药政开支增加，严重影响
16、国花费大量的抗菌药物，使国家药政开支增加，严重影响国民经济发展。民经济发展。面对细菌耐药我们该做些什么？v 为了降低感染性疾病的病死率，延缓细菌耐药性的出现，我们必须做到：提高医院临床微生物实验室对感染病患者，特别是疑难病例的病原菌诊断水平。进行可靠的药敏试验，为合理使用抗菌药物提供依据。严格遵循世界卫生组织的要求，采用统一的方法和材料，对耐药菌进行监测。对临床一些重要科室的耐药菌和耐药变迁进行重点监测，以提高抗感染治疗水平。2012年全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案v 三级综合医院抗菌药物品种原则上不超过50种；v 二级综合医院抗菌药物品种原则上不超过35种；v 口腔医院抗菌药物品种原则
17、上不超过35种；v 肿瘤医院抗菌药物品种原则上不超过35种；v 儿童医院抗菌药物品种原则上不超过50种；v 精神病医院抗菌药物品种原则上不超过10种；v 妇产医院（含妇幼保健院）抗菌药物品种原则上不超过40种。1、限制品种和规格v 同一通用名称注射剂型和口服剂型各不超过2种，具有相似或者相同药理学特征的抗菌药物不得重复采购。v 头霉素类抗菌药物不超过2个品规；v 三代及四代头孢菌素（含复方制剂）类抗菌药物口服剂型不超过5个品规，注射剂型不超过8个品规；v 碳青霉烯类抗菌药物注射剂型不超过3个品规；v 氟喹诺酮类抗菌药物口服剂型和注射剂型各不超过4个品规；v 深部抗真菌类抗菌药物不超过5个品种。
18、有限的药物品种更需要我们有针对性的治疗！2、加大抗菌药物临床应用相关指标控制力度v 综合医院：v 住院患者抗菌药物使用率不超过60%；v 门诊患者抗菌药物处方比例不超过20%；，v 急诊患者抗菌药物处方比例不超过40%；v 抗菌药物使用强度力争控制在每百人天40DDDs以下。2012年全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案年全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案关于预防使用抗菌药物规定v 住院患者手术预防使用抗菌药物时间控制在术前30分钟至2小时（剖宫产手术除外），抗菌药物品种选择和使用疗程合理。v I类切口手术患者预防使用抗菌药物比例不超过30%，其中，腹股沟疝修补术（包括补片修补术）、甲状腺疾
19、病手术、乳腺疾病手术、关节镜检查手术、颈动脉内膜剥脱手术、颅骨肿物切除手术和经血管途径介入诊断手术患者原则上不预防使用抗菌药物；v I类切口手术患者预防使用抗菌药物时间不超过24小时。2012年全国抗菌药物临床应用专项整治活动方案v 二级以上医院根据临床微生物标本检测结果合理选用抗菌药物，接受抗菌药物治疗住院患者微生物检验样本送检率不低于30%；（2011年方案）v 接受限制使用级抗菌药物治疗的住院患者抗菌药物使用前微生物检验样本送检率不低于50%；（2012年方案）v 接受特殊使用级抗菌药物治疗的住院患者抗菌药物使用前微生物送检率不低于80%。（2012年方案）v 开展细菌耐药监测工作，定期
20、发布细菌耐药信息，建立细菌耐药预警机制，3、加强临床微生物标本检测和细菌耐药监测v 2013年：全国细菌耐药监测网建设；由各省耐药监测中心和原卫生部合理用药专家委员会、全国细菌耐药监测网中区分中心共同主办的“全国细菌耐药监测网培训班”v 2014年：卫生部合理用药专家委员会启动“以耐药监测促进抗菌药物合理应用和科学管理百家医院在行动培训项目”细菌耐药性监测的目的和意义细菌耐药性监测的目的和意义细菌耐药性监测是控制细菌耐药性的第一步。细菌耐药性监测是控制细菌耐药性的第一步。通过汇集各网点医院的细菌药敏资料，宏观上掌握细菌通过汇集各网点医院的细菌药敏资料，宏观上掌握细菌耐药性变迁情况耐药性变迁情况
21、;掌握耐药菌在不同规模医院，不同专业科室，不同患者掌握耐药菌在不同规模医院，不同专业科室，不同患者人群中的分布模式人群中的分布模式;以提供临床合理用药，生产单位研发新药的参考资料以提供临床合理用药，生产单位研发新药的参考资料;作为卫生行政部门制定抗菌药应用管理决策的参考依据作为卫生行政部门制定抗菌药应用管理决策的参考依据;是提高抗菌药合理应用水平的重要措施之一是提高抗菌药合理应用水平的重要措施之一 如何做好细菌耐药性监测？v 严格的质量控制u平板：来源（进口、国产）、厚度、湿度、保存条件及时间、有效期，溶血性检查、生长试验和无菌试验；u药敏纸片：有效期内使用、低温保存不要反复冻融；u质控菌株：
22、每批次都要做；u接种菌液的制备：35个菌落，0.5MFC；纯度的检测；u培养的条件：需氧或厌氧、温度、时间；u结果的阅读：反射光、透射光；u结果审核：特殊耐药表型和异常结果的复核；u数据的整理：剔除污染菌，同一部位重复菌、补充缺失数据；u菌株的保存：普通细菌、特殊耐药菌；如何做好细菌耐药性监测？v 高素质的人员：u进行业务培训u稳定、技术熟练如何进行细菌耐药性监测如何进行细菌耐药性监测v 建立耐药监测网建立耐药监测网v 标准化的药敏方法标准化的药敏方法v 质量控制质量控制v 耐药菌种库耐药菌种库v 数据的处理和管理数据的处理和管理标准化的药敏方法标准化的药敏方法v 纸片扩散法（纸片扩散法（K-
23、B）v 合适的培养基合适的培养基v 重要的质控菌重要的质控菌v 正确的抗菌药物组合正确的抗菌药物组合正确的药敏试验及报告非常重要！1、标准化的药敏方法、标准化的药敏方法n 标准化的药敏方法标准化的药敏方法n稀释法稀释法n扩散法（纸片法扩散法（纸片法 K-B)法法nE-Testn 正确的药敏组合正确的药敏组合n 合适的培养基合适的培养基n 正确的接种菌量正确的接种菌量n 合适的培养环境合适的培养环境n 正确的阅读结果正确的阅读结果n 及时正确地报告及时正确地报告肉汤微量稀释法肉汤(试管)稀释法2g/ml2g/ml1g/ml1g/ml0.5g/ml0.5g/ml琼脂(平板)稀释法纸片法 K-B法E
24、 E-试验试验（E-TestE-Test）v 原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料纸条中向药敏琼脂中扩散，在试条周围浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。v E-test综合了稀释法和扩散法的原理和特点，直接定量测出药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）。菌液，菌液，药敏平板药敏平板 同同K-BK-B法法E-TestE-Test条条 宽宽5mm5mm，长长60mm60mm抑菌圈抑菌圈 -椭圆形椭圆形结果结果 -MIC -MICCommercial AST SystemsVitek 2MicroScanSensititrePhoenixEtestBIOMIC什么时候可
25、以使用什么时候可以使用E-试验试验?v 临床治疗要求了解某种抗菌药物确切的MIC值以及MIC的范围v 当某种抗菌药物对某种细菌的纸片法药敏结果不可靠时,如万古霉素对MRSAv 要核实常规方法获得的药敏结果正确性v 苛养菌n肺炎链球菌n-溶血性链球菌n流感嗜血杆菌v 厌氧菌 当进行以下检测时，需用当进行以下检测时，需用MIC法而不能用纸片扩散法而不能用纸片扩散法法v 葡萄球菌万古霉素；达托霉素v 肠球菌万古霉素“中介”结果；达托霉素v 不动杆菌属，洋葱博客霍尔德菌，嗜麦芽窄食单胞菌许多药v 肺炎链球菌青霉素，头孢噻肟/头孢曲松v 草绿色链球菌青霉素v Beta 溶血链球菌达托霉素MIC结果和敏感
26、，中介，耐药的解释对下列疾病相结果和敏感，中介，耐药的解释对下列疾病相关的分离菌种是有用的：关的分离菌种是有用的：v 心内膜炎v 脑膜炎v 败血病 v 骨髓炎 v 免疫抑制 v 假体装置 v 虽然“敏感”，但是对抗菌药无反应的病人 举例举例:囊性纤维化患者中分离的铜绿假单胞菌对托囊性纤维化患者中分离的铜绿假单胞菌对托布霉素需要雾化处理时：布霉素需要雾化处理时：v囊性纤维化患者有时需要雾化托布霉素治疗 托布霉素的浓度:肺 雾化吸入雾化吸入 32-64 g/mg血清 静脉给药静脉给药 410 g/ml自动化仪器常规 托布霉素MIC 通常 16 g/mlE-试验和稀释法:E-试验可以达到256 g/
27、ml (此外粘液状生长的菌株肉汤培养液内生长较慢)原则：针对靶细菌设计药敏试验的抗菌药物的品种原则：针对靶细菌设计药敏试验的抗菌药物的品种和数量和数量CLSI抗菌药物选择的原则（抗菌药物选择的原则（A、B、C、U组）组）根据病原菌的种类根据病原菌的种类革兰阳性球菌革兰阳性球菌葡萄球菌、肠球菌葡萄球菌、肠球菌、链球菌等、链球菌等革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等肠杆菌科细菌、铜绿假单胞菌、不动杆菌等根据本单位临床实际需要根据本单位临床实际需要2、正确的抗菌药物组合FDAFDA批准临床微生物室常规药敏批准临床微生物室常规药敏试验分组试验分组 细菌：细菌：肠杆菌科、铜绿假
28、单胞菌、葡萄球菌属、肠球菌属和不动杆菌属、洋葱肠杆菌科、铜绿假单胞菌、葡萄球菌属、肠球菌属和不动杆菌属、洋葱伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌、其他非肠杆菌科细菌（伯克霍尔德菌、嗜麦芽窄食单胞菌、其他非肠杆菌科细菌（MIC）嗜血杆菌属、淋病奈瑟球菌、肺炎链球菌、嗜血杆菌属、淋病奈瑟球菌、肺炎链球菌、-、-溶血性链球菌溶血性链球菌A组组为常规的一级试验组合并常规报告结果为常规的一级试验组合并常规报告结果B组组亦可用于一级试验，但应选择性报告，即当亦可用于一级试验，但应选择性报告，即当A组药物耐药时可以选组药物耐药时可以选择性地报告择性地报告B组中的同类药物组中的同类药物C组组为补充性药物，可选择性报
29、告为补充性药物，可选择性报告U组组为补充性药物，主要用于治疗尿路感染的选择用药为补充性药物，主要用于治疗尿路感染的选择用药肠杆菌科细菌的抗菌肠杆菌科细菌的抗菌药物选择药物选择抗菌药物抗菌药物A AB BC CU U抗菌药物抗菌药物A AB BC CU UO O阿米卡星阿米卡星亚胺培南亚胺培南庆大霉素庆大霉素美罗培南美罗培南氨苄西林氨苄西林厄他培南厄他培南哌拉西林哌拉西林环丙沙星环丙沙星头孢唑啉头孢唑啉氨苄西林氨苄西林/舒巴坦舒巴坦头孢克罗头孢克罗头孢哌酮头孢哌酮/舒巴坦舒巴坦头孢呋辛头孢呋辛哌拉西林哌拉西林/他唑巴坦他唑巴坦头孢噻肟头孢噻肟头孢美唑头孢美唑头孢他啶头孢他啶头孢噻肟头孢噻肟/克拉
30、维酸克拉维酸头孢吡肟头孢吡肟头孢他啶头孢他啶/克拉维酸克拉维酸SXT-TMPSXT-TMP妥布霉素妥布霉素葡萄球菌的抗菌药物葡萄球菌的抗菌药物选择选择抗菌药物抗菌药物A AB BC CUO O抗菌药物抗菌药物A AB BC CU UO O青霉素青霉素万古霉素万古霉素庆大霉素庆大霉素替考拉宁替考拉宁苯唑西林苯唑西林左氧氟沙星左氧氟沙星头孢西丁头孢西丁SXT-TMPSXT-TMP头孢唑啉头孢唑啉磷霉素磷霉素克林霉素克林霉素呋喃妥因呋喃妥因红霉素红霉素利福平利福平 利奈唑胺利奈唑胺达托霉素达托霉素 四环素四环素头孢洛林头孢洛林2013年MRSA检测取消了苯唑西林K-B法，B类增加了头孢洛林头孢洛林
31、3、合适的培养基、合适的培养基v 普通细菌普通细菌n肠杆菌科细菌、假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌肠杆菌科细菌、假单胞菌属、不动杆菌属、葡萄球菌属、肠杆菌属等属等nMH琼脂培养基（琼脂培养基（MuellerHinton Agar）v 肺炎链球菌及其他链球菌肺炎链球菌及其他链球菌n5脱纤维羊血脱纤维羊血MH琼脂培养基琼脂培养基v 嗜血杆菌属嗜血杆菌属n嗜血杆菌培养基（嗜血杆菌培养基（HTM）SR158添加剂添加剂4、正确的菌液浓度、正确的菌液浓度v 试管法：105CFU/mlv 平板法：107CFU/ml（104CFU/spot）v 扩散法：0.5MacFarland Standard
32、（1.5108CFU/ml）v E-Test:同上选择菌落 准备接种物混悬液 如何制备菌悬液？至少3个菌落，为什么？菌落单个菌落单个菌落 多个菌落多个菌落 可能丢失耐药细菌(携带有耐药质粒的耐药菌株).5、合适的培养条件、合适的培养条件v 需氧菌：需氧菌：35 2 ，16-18小时小时n嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时n葡萄球菌：33-35 ，OXA、MET（甲氧西林）、NAF（萘夫西林）、VAN 24小时n肠球菌：VAN 24小时n溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时5、合适的培养条件、合适的培养条件v苛养菌：35 2 ，5%-10%CO2n溶血性链球菌、
33、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时n流感嗜血杆菌16-18小时v厌氧菌：n35 2 ，厌氧环境（80%-85%N2，5%-10%CO2，10%H2），18-24小时v真菌：n35 2 ，24小时n新型隐球菌：48-72小时6.重要的质控菌重要的质控菌v 肠杆菌科细菌：大肠埃希菌ATCC25922v 非发酵菌：铜绿假单胞菌ATCC27853v 葡萄球菌等G(+)球菌：金黄色葡萄球菌 v ATCC25923v 肠球菌：粪肠球菌ATCC29212v 肺炎链球菌：肺炎链球菌ATCC49619v 嗜血杆菌：流感嗜血杆菌ATCC49247 v 工具：游标卡尺，尺子v 光源：反射光、透射光v 阅读：药
34、敏平皿背衬不反光的黑色背景用v 肉眼观察v 也可用BIOMIC机器阅读v 正确的光源：反射光 v 不反光的黑色背景v 完全抑制的抑菌圈直径，v 包括纸片的直径v 抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显的可见细菌生长区域v 在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下才能观察到的细小菌落应忽略7.正确阅读结果正确阅读结果（纸片法）（纸片法）阅读结果的正确光源阅读结果的正确光源细细 菌菌反射光反射光透射光透射光细细 菌菌反射光反射光透射光透射光肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌肺炎链球菌肺炎链球菌(移去盖子移去盖子)铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌-、草绿色链、草绿色链(移去盖子移去盖子)不动杆菌属细菌不动杆菌属细菌嗜血杆
35、菌属嗜血杆菌属伯克霍尔德菌伯克霍尔德菌淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌(移去盖子移去盖子)葡萄球菌葡萄球菌VAN、OXA、LIN、脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌(移去盖子移去盖子)肠球菌肠球菌VAN弧菌属弧菌属应注意磺胺类药物的结果阅读应注意磺胺类药物的结果阅读v 培养基内可能有磺胺类药物的拮抗物，如胸腺嘧啶、核苷类物质。允许有轻微生长的薄菌苔v 忽略20%或更低生长的薄菌苔，测量抑菌圈直径较为明显的细菌生长界限v 下列细菌均应注意：肠杆菌科细菌、不动杆菌属、伯克霍尔德菌属、葡萄球菌属、嗜血杆菌属、肺炎链球菌、弧菌属、脑膜炎奈瑟菌8.正确报告药敏试验结果正确报告药敏试验结果CLSI文件：我国部颁标准采用三级划分
36、制采用三级划分制CLSI的三级划分制及临床意义的三级划分制及临床意义v 高度敏感（S）：当一种细菌引起的感染，用该种药物常用剂量治疗有效，这种细菌即对该药物高度敏感，即常规用药时达到的平均血浓度超过对细菌MIC的5倍以上v 中介（I）：当细菌引起的感染，仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物的浓缩部位，如尿液、胆汁等才被抑制，这种细菌对该药物中度敏感。常规用药时达到的平均血浓度一般相当于或略高于对细菌的MIC。v 耐药（R）：药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度，有时细菌能长生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如何，均应判定该菌为耐药。v 对于鉴定的细
37、菌和药敏结果要进行审核，方能发出报告。v 药敏结果是否符合常理，如头孢唑林敏感，可以推测二代、三代头孢菌素均敏感。如不符合，应重新进行药敏试验。v 出现特殊耐药现象时，应重复药敏实验。如万古霉素以及利奈唑胺耐药的阳性球菌，碳青霉烯类抗生素耐药的阴性肠杆菌科细菌以及青霉素耐药的-溶血性链球菌等。v 药敏结果是否要依据CLSI进行修订，如为ESBL菌株，如果头孢他啶和头孢吡肟敏感，则应修改为耐药（如采用新则点，无需修改）。如果系MRSA菌株，则应报告对所有头孢菌素、碳青酶烯类抗生素耐药。v KB纸片法结果与仪器MIC结果不一致时，应检查平板菌落纯度，必要时重复该菌药敏实验。监测菌种的要求监测菌种的
38、要求 v结核分枝杆菌、厌氧菌不列入耐药监测范围结核分枝杆菌、厌氧菌不列入耐药监测范围（CHIFNET：真菌真菌）v需监测的临床分离菌必须鉴定到种需监测的临床分离菌必须鉴定到种v葡萄球菌必须明确属甲氧西林（苯唑西林）耐药或敏感（即葡萄球菌必须明确属甲氧西林（苯唑西林）耐药或敏感（即MR或或MS）v大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌应明确大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌应明确产产ESBLs的属性的属性v肺炎链球菌必须明确对青霉素的耐药属性肺炎链球菌必须明确对青霉素的耐药属性(CSF标准、非标准、非CSF标标准准)，纸片法耐药菌株，要有，纸片法耐药菌株，要有MI
39、C结果。结果。v嗜血杆菌和卡他莫拉菌要有嗜血杆菌和卡他莫拉菌要有-内酰胺酶结果。内酰胺酶结果。监测菌种的种类监测菌种的种类v 大肠埃希菌大肠埃希菌v 克雷伯菌属克雷伯菌属v 肠杆菌属肠杆菌属v 柠檬酸杆菌属柠檬酸杆菌属v 摩根菌属摩根菌属v 沙雷菌属沙雷菌属v 变形杆菌属变形杆菌属v 普罗威登菌属普罗威登菌属v 志贺菌属志贺菌属v 沙门菌属沙门菌属 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 CoNS（血液、脑脊（血液、脑脊液等无菌部位）液等无菌部位）腐生葡萄球菌（尿腐生葡萄球菌（尿液）液）肠球菌属肠球菌属 肺炎链球菌肺炎链球菌-溶血性链球菌溶血性链球菌 草绿色链球菌草绿色链球菌 流感嗜血杆菌 卡他莫拉菌*
40、金黄色葡萄球菌 CoNS（血液、脑脊液等无菌部位）腐生葡萄球菌（尿液）肠球菌属 肺炎链球菌-溶血性链球菌 草绿色链球菌 铜绿假单胞菌 不动杆菌属 洋葱伯克霍尔德菌 嗜麦芽窄食单胞菌下列细菌不属监测范围下列细菌不属监测范围v少见的对临床意义不大的或监测较困难的细菌n无色杆菌、色杆菌、微球菌、芽孢杆菌、棒状杆菌、乳杆菌、军团菌、哈夫尼亚菌等。v无标准化药敏方法和治疗无困难的细菌n弯曲菌、梭状芽孢杆菌、脑膜炎球菌、拟杆菌、奈瑟菌属等。下列细菌因药物敏感性相同或分型下列细菌因药物敏感性相同或分型较困难应归并为一个属较困难应归并为一个属v气单胞菌属v不动杆菌属v沙门菌属（伤寒、副伤寒以及各种血清型的沙门
41、菌）v肠杆菌属 细菌药敏的质量保证系统细菌药敏的质量保证系统 v 建立细菌药敏质控制度n常规药敏的质控n重要临床分离菌的再鉴定和药敏试验确证工作n定期进行细菌药敏室间质控n菌种保存制度v 质量检查标准依据为CLSI（当年）v 细菌耐药性监测资料统计：WHONETv 定期发布耐药性监测结果建立细菌保存制度建立细菌保存制度v方法n将过夜新鲜培养的细菌置于0.5ml 40的甘油肉汤管中，于-70保存。v意义n抗菌药物药效学评价n耐药机制研究n相关的临床微生物学研究数据的处理和管理数据的处理和管理v 判断标准：CLSI当年版标准v WHONET软件统计分析v 备份文件v 定期整理总结本院的监测情况及时
42、发现问题，针对处理。v 定期上报上一级耐药监测网 存在的存在的问题？问题？v不规范的使用药敏试验材料，采用5%脱纤维羊血平皿进行药敏试验v药敏平皿制备不规范，为方便徒手随意浇制药敏平皿v培养时间和培养环境不规范，未按CLSI规定执行v抗菌药物没有按CLSI的要求选择v一些明显违反常规的药敏结果以及罕见的药敏现象需要重新鉴定细菌和进行药敏试验，并送参考实验室进一步验证的意识还需增强vWHONET的数据资料不完整，这不利于进行流行病学的分析和追踪 存在的问题？v没有使用统一的WHONET统计软件，或随意改动抗菌药物的缩写符号和增加统计项目给统计工作带来不必要的麻烦。v资料管理不规范，没有专人负责输
43、入和保管；v不及时总结资料和定期反馈给临床医师参考。存在的问题？使用自动化仪器进行细菌耐药性监测v 优点：n不能应用K-B法的药物都能使用，有MIC结果。n方便省事，结果自动读取n数据导出方便n节省人力物力n质控方便v 缺点：n折点更新慢，跟不上CLSI更新速度。n有些药物MIC范围较窄，仅1个或2个稀释度。v 应对措施：n补充部分药物K-B法结果 存在的问题？建议一、加强呼吸道致病菌的检测及耐药性监测v 呼吸道病原菌检出率低：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌。v 近年来耐青霉素肺炎链球菌(PISP+PRSP)在儿童中的检出率逐年上升。青霉素高度耐药菌株系多重耐药株，且出现对第三代头孢菌素
44、耐药菌株；对红霉素的耐药率已达95.1%。v 近年来，流感嗜血杆菌和卡他莫拉菌的内酰胺酶的检出率分别为21.7%和91.2%（产TEM-1和ROB）型。这些菌株对氨苄西林100%耐药，有部分菌株对头孢呋辛、头孢噻肟耐药。建议二、加强VISA、VRSA 监测v 各临床微生物实验室应严格按照CLSI标准，密切注意并追踪万古霉素MIC 4gmL的金黄色葡萄球菌，加强对VISA和VRSA的检测。v 遇到该类耐药菌株时必须按CLSI的规定进行鉴定和稀释法药敏试验以确认是否为VRSA 和VRE菌株。VISA和和VRSA的检测的检测方法VISAVRSA纸片扩散法无法检测抑菌圈内可能有散在菌落CLSI肉汤微量
45、稀释法可以检测可以检测E-test(0.5麦氏浊度，24小时培养)可以检测可以检测自动化系统重复性差重复性差可以使用含万古霉素的可以使用含万古霉素的BHIBHI琼脂筛选琼脂筛选建议三、建议三、重视对重视对VRE菌株和菌株和HLAR菌株的检测菌株的检测v 1988年英国首次报道耐万古霉素粪肠球菌和屎肠球菌，目前在在欧美国家有明显上升趋势v 美国VRE感染所占的比例由1989年的0.4%上升到1993年的7.9%，1995年超过10%v 28个国家700个临床微生物实验室参加的欧洲1999-2002年的EARSS监测资料报道粪肠球菌的万古霉素耐药菌株为7%，而屎肠球菌为37%v 国内已有该类耐药菌
46、株的报道，但各地区报道该类耐药菌株的检出率不一。v 但2010年CHINET细菌耐药性监测显示约有3.6%的屎肠球菌和0.6%的粪肠球菌为VRE菌株，基因型为van和van Bv 亦有些地区报道为1%-10%，值得引起警惕。肠球菌属肠球菌属 纸片扩散法筛选纸片扩散法筛选 HLARv 2006年CLSI增加了高水平氨基糖苷类耐药性(HLAR)纸片扩散法解释标准(同MIC 试验一样)v 敏感 可与作用于细胞壁的抗生素协同 v 耐药 将不能与作用于细胞壁的抗生素协同v 中介 用琼脂稀释法和肉汤微量稀释法进一步测定MIC年份年份屎肠球菌屎肠球菌粪肠球菌粪肠球菌200969.4%40.1%201066.
47、0%44.0%201167.3%42.9%201257.9%33.6%CHINETCHINET监测网监测网 肠球菌对庆大霉素耐药率肠球菌对庆大霉素耐药率建议四、加强肠杆菌科细菌中产ESBL、Amp C及KPC酶菌株的监测v 是细菌对广谱-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。v 2011年CLSI取消了ESBL的常规检测。v 已有报道发现由于AmpC调节基因等突变可导致AmpC 酶 持 续 大量表达（俗称“去阻遏”）；产ESBLs+Amp C 复合酶（52.1%）v KPC以及NDM-1的流行。v 质粒介导和整合子的参与。建议五、加强不动杆菌属、铜绿假单胞菌等细菌中的泛耐药株(PDRA)监测v 定义：
48、对碳青霉烯类、第三、第四代头孢菌素、单环类、-内酰胺酶抑制剂复方制剂、半合成青霉素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类等抗菌药物耐药(多黏菌素除外)。v 由泛耐药株引起的感染常常无药可用，病死率高v 泛耐药株常发生于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等葡萄糖不发酵菌；v 现在肠杆菌科细菌中亦有检出。建议六、加强对重点科室和病房的耐药性监测v 耐药性监测资料显示，呼吸科、血液科、烧伤病房、ICU 和脑外科病房是耐药细菌集中的场所。安医大2012年泛耐药不动杆菌科室分布科室科室株数量株数量百分比百分比干部神内1223.53%重症监护(ICU)1019.61%急诊内科47.84%神经外科35.88%急诊ICU35.8
49、8%骨科35.88%烧伤科病区23.92%科室科室株数量株数量百分比百分比烧伤科病区637.50%干部神内212.50%呼吸内科212.50%呼特二病区16.25%急诊ICU16.25%安医大2012年泛耐药铜绿假单胞菌科室分布建议七、进行人员培训，提高人员能力水平v 检验科必须相对固定专门（专业）人员，进行耐药性监测工作。v 进行人员培训，提升自身能力和水平。v 积极参与临床会诊，向临床医师解读药物敏感性试验报告的意义。v 提供主要病原菌的耐药性，为初始的经验治疗提供依据。共同、合理地选用抗菌药物。v如“MRSA”菌株感染：u意味着细菌对所有的-内酰胺类抗生素及包括氨基糖苷类和喹诺酮类等大多
50、抗菌药物耐药。u可选用万古霉素(去甲万古霉素)和替考拉宁,利奈唑胺、替加环素。u亦可根据药敏试验结果选用磷霉素、复方磺胺甲恶唑、利福平与糖肽类抗生素联合应用。v 如产ESBL菌株:u应视为对第三、四代头孢菌素耐药.u目前尚无足够的临床资料证实，药敏试验呈敏感的产ESBL菌感染者，继续采用第三代头孢菌素仍有满意疗效。u产ESBI 菌引起的严重感染，可选用亚胺培南和美罗培南等碳青霉烯类；u一般感染时可根据药敏结果选用某些-内酰胺类抗生素与酶抑制剂复方合剂(如哌拉西林一他唑巴坦和头孢哌酮一舒巴坦)，必要时视药敏结果可联合阿米卡星和氟喹诺酮类。小结：v 掌握CLSI相关标准和新的变化。v 注重细节，做
