1、化学发光磁酶免疫分析法检化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体测梅毒螺旋体抗体答辩人：答辩人：杨璐杨璐 导导 师：师：崔亚丽崔亚丽 教授教授 李如琳李如琳 副教授副教授 西北大学西北大学 Contents梅毒梅毒 梅毒螺旋体梅毒螺旋体 严重性传播疾病严重性传播疾病 发病率不断上升发病率不断上升 20102010年年4 4月国家卫生部全国法定月国家卫生部全国法定 传染病疫情报告：传染病疫情报告：全国乙类法定传染病发病第全国乙类法定传染病发病第位位梅毒检测梅毒检测：孕前检查孕前检查 供血者血液常规筛选检查供血者血液常规筛选检查02468101214161819961998200020022004
2、20062008发病率（发病率（10-5）年份年份西北大学西北大学 v医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法 快速血浆反应素环状卡片实验试验（快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺）和甲苯胺红试验红试验(TRUST)初筛初筛 假阳性高假阳性高 判断主观判断主观 梅毒螺旋体血球凝集试验（梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和和梅毒螺旋体明胶梅毒螺旋体明胶凝集试验（凝集试验（TPPA）确认确认 判断主观判断主观 操作繁琐操作繁琐 要求严格要求严格 梅毒梅毒ELISA实验实验 灵敏度有待进一步提高灵敏度有待进一步提高 西北大学西北大学 化学发光免疫分析技术化学发光免
3、疫分析技术免疫分析系统免疫分析系统化学发光分析系统化学发光分析系统（抗原、抗体，免疫反应）（抗原、抗体，免疫反应）免疫分析高特异性免疫分析高特异性及及化学发光高灵敏度化学发光高灵敏度于一体于一体（酶的化学发光底物或氧化剂）（酶的化学发光底物或氧化剂）西北大学西北大学 梅毒螺旋体抗体化学发光法检测梅毒螺旋体抗体化学发光法检测 灵敏度极高灵敏度极高 自动化自动化化学发光技术化学发光技术 灵敏度极高灵敏度极高 较宽线性范围较宽线性范围 精密度高精密度高 容易实现自动化容易实现自动化广泛应用于医学、食广泛应用于医学、食品、分析化学等领域品、分析化学等领域西北大学西北大学 v化学发光法检测梅毒的商品化试
4、剂盒化学发光法检测梅毒的商品化试剂盒国外国外：Abbott：ARCHITECT Syphilis TP 磁粒磁粒 国内国内：北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗北京科美东雅生物技术有限公司：梅毒螺旋体抗体化学发光试剂盒体化学发光试剂盒 酶标板酶标板西北大学西北大学 聚乙烯酶标板聚乙烯酶标板板表面包被面积板表面包被面积有限有限反应空间有限反应空间有限灵敏度受限灵敏度受限化学发光化学发光固相载体的选择固相载体的选择磁性微粒磁性微粒比表面积大比表面积大分散性好分散性好易分离易分离灵敏度更高灵敏度更高西北大学西北大学 v金磁微粒化学发光检测方法金磁微粒化学发光检测方法西北大学西北大学 包被包被反
5、应反应检测检测实验原理实验原理西北大学西北大学 第一部分第一部分 方法的优化方法的优化HRP标记抗原稀释液的确定标记抗原稀释液的确定包被抗原最佳用量及酶标包被抗原最佳用量及酶标抗原最佳工作浓度的确定抗原最佳工作浓度的确定样本稀释液的确定样本稀释液的确定保护剂的选择保护剂的选择西北大学西北大学 HRP标记抗原稀释液的确定标记抗原稀释液的确定a PBST+20%小牛血清小牛血清b PBST+0.1%BSAc PBST+0.5%BSAd PBST+1%BSAe PBST+1.5%BSA降低非特异性吸附降低非特异性吸附：加入非特异性蛋白与表面活性剂加入非特异性蛋白与表面活性剂阴性样本的发光值阴性样本的
6、发光值西北大学西北大学 包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定 抗原抗原包包 被被量量(ng/孔孔)酶标酶标抗原稀释度抗原稀释度 701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000P N21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量最佳抗原包被量：210ng/孔；孔；
7、最佳酶标抗原工作浓度最佳酶标抗原工作浓度：1：3000西北大学西北大学 样本稀释液的确定样本稀释液的确定阳性血清阳性血清稀释倍数稀释倍数检测结果检测结果1PBS生理盐水生理盐水PBS+0.1%BSA 正常人血清正常人血清1:25+1:50+1:100+1:200+1:400+1:800+1:1600+1:3200+1:6400+-+-+1:12800-+1:25600-+-+-1:51200-最佳样本稀释液：最佳样本稀释液：PBS+0.1%BSA检测灵敏度与正常人检测灵敏度与正常人血清相当血清相当西北大学西北大学 保护剂的选择保护剂的选择保护剂保护剂X X对对HRP标记抗原的保护作用良好标记抗
8、原的保护作用良好HRP标记抗原置于标记抗原置于37、放置、放置6天天西北大学西北大学 保护剂保护剂X X对包被抗原金磁微粒的保护作用对包被抗原金磁微粒的保护作用包被抗原金磁微粒置于包被抗原金磁微粒置于3737、放置、放置6 6天天稳定性很好稳定性很好西北大学西北大学 保护剂保护剂Proclin300与保护剂与保护剂X的对比实验的对比实验选定浓度为选定浓度为0.05%的的Proclin300作为保护剂作为保护剂西北大学西北大学 保护剂保护剂Proclin300对对HRP标记抗原的保护作用标记抗原的保护作用含含0.05%Proclin300的的 HRP标记抗原置于标记抗原置于37、放置、放置6天天
9、西北大学西北大学 第一部分实验小结第一部分实验小结 在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：工作条件如下：1.HRP标记抗原稀释液：标记抗原稀释液：PBST+1%BSA作为作为HRP 标记抗原稀释液；标记抗原稀释液；2.抗原包被量：抗原包被量：210 ng/孔孔(7 g/mg)；3.酶标抗原稀释浓度：酶标抗原稀释浓度：1:3000时，发光强度达到最时，发光强度达到最佳；佳；4.血清样本稀释液：血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA；5.保护剂：浓度为保护剂：浓度为0.05%Pr
10、oclin300的的PBS缓冲液。缓冲液。西北大学西北大学 参考值参考值对比实验对比实验稳定性稳定性标准曲线标准曲线精密度精密度特异性特异性第二部分第二部分 实验方法的评价实验方法的评价西北大学西北大学 稳定性稳定性化学发光试剂分别置于化学发光试剂分别置于4冰箱和冰箱和37生化培养箱中放置生化培养箱中放置6天天将阳性血清分别稀释将阳性血清分别稀释50倍、倍、100倍、倍、200倍、倍、400倍后进行检测倍后进行检测西北大学西北大学 精密度精密度国家标准国家标准（15%）批内差批内差：2.86%5%次数次数检测结果检测结果阳性阳性检测检测平均值平均值RSD（%）1PN54231557352362
11、4915605715574715594923586052P N59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大学西北大学 批间差：批间差：5.1%9.7%西北大学西北大学 次数次数 检测结果检测结果 批次批次1 批次批次2 批次批次3阳性检测阳性检测平均值平均值RSD（%
12、）1PN3895153918848291548221544878 4692 1544419.72P N43291540528472315481015454115 4752 845346.53PN398784189154428847838443115 4246 843446.24PN39958409684624154742842678 4368 1543496.75PN4016153979845721542268414615 4144 1541815.1质控标准品质控标准品1010次重复测定结果次重复测定结果质控品：抗质控品：抗-TP标准物质（标准物质（2NCU/mL）相对标准偏差：相对标准偏差
13、：5.42%西北大学西北大学 标准曲线标准曲线将梅毒螺旋体抗体质控标准品（将梅毒螺旋体抗体质控标准品（4 NCU/mL）梯度）梯度稀释，在稀释，在0.25 4 NCU/mL范围内线性良好范围内线性良好Y=599.1X-165.9R2=0.9980西北大学西北大学 参考值（临界值确定）参考值（临界值确定）检测检测100100例临床阴性血清样本例临床阴性血清样本临界值：临界值：P/N2.8，计算得出该方，计算得出该方法的临界值为：法的临界值为：COV=72.8PX+3SD，计算可得临，计算可得临界值为：界值为：COV=47.6P/N2.1，计算可得临界，计算可得临界值为：值为：COV=54.6发光
14、值发光值=54.6 =54.6 西北大学西北大学 特异性特异性阴性符合率均为阴性符合率均为100%8080例临床血清样本例临床血清样本 20 20例乙肝阳性血清例乙肝阳性血清 样本（样本（TPTP阴性）阴性）20 20例丙肝阳性血清例丙肝阳性血清 样本（样本（TPTP阴性）阴性）本次实验：本次实验：COV=N2.1=54.60102030405060708090100020406080100COV=54.68080例阴性血清样本例阴性血清样本发光值发光值西北大学西北大学 乙肝阳性样本检测结果乙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果丙肝阳性样本检测结果0102030405060708090100
15、010203001020304050607080901000102030COV=54.6COV=54.6发光值发光值发光值发光值乙肝血清样本乙肝血清样本丙肝血清样本丙肝血清样本阴性符合率均为阴性符合率均为100%西北大学西北大学 化学发光磁酶免疫化学发光磁酶免疫分析法与分析法与商品化化商品化化学发光试剂盒学发光试剂盒对比对比灵敏度比商品化化灵敏度比商品化化学发光试剂盒提高学发光试剂盒提高4倍倍阳性血清阳性血清稀释倍数稀释倍数检测结果检测结果商品化试剂盒商品化试剂盒化学发光磁酶免法化学发光磁酶免法(MECLIA)1:100+1:200+1:400+1:800+1:1600+1:3200+1:64
16、00-+1:12800-+1:25600-+-1:51200-西北大学西北大学 化学发光磁酶免法化学发光磁酶免法（COV=N2.1=53.2）商品化化学发光试剂盒商品化化学发光试剂盒COV=N2.1=26151）010203040506070809010001020300500010000150002000025000300000102030特异性对比实验：特异性对比实验：二者相当，阴性符合率均二者相当，阴性符合率均100%发光值发光值发光值发光值20例阴性血清样本例阴性血清样本20阴性血清样本阴性血清样本COV=53.2COV=26151西北大学西北大学 西北大学西北大学 第二部分实验小结第
17、二部分实验小结国家法规国家法规：体外诊断试剂注册管理办法体外诊断试剂注册管理办法分析性能评估资料：分析性能评估资料：分析灵敏度、分析特异性、检测范围分析灵敏度、分析特异性、检测范围 批内不精密度、批间不精密度等项目批内不精密度、批间不精密度等项目参考值（参考范围）确定参考值（参考范围）确定稳定性研究资料稳定性研究资料发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则 根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性（批内
18、差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。差）、相关性等，均应达到相应的质量标准。v稳定性：稳定性：4，及，及37加速破坏性实验，均显示保加速破坏性实验，均显示保存稳定性存稳定性良好良好；v精密度：精密度：批内差在批内差在2.865%，批间差在，批间差在5.19.7%，对质控品重复，对质控品重复 10 次检测，变异系数为次检测，变异系数为5.42%，均达到国家标准（，均达到国家标准（15%）方法评价结果方法评价结果西北大学西北大学 v标准曲线：在标准曲线：在0.25 4 NCU/mL范围内线性范范围内线性范围良好围良好v临界值：临界值为阴性对照血清均值的临界值：临界值为阴性对照血清均值的2.1倍
19、倍v特异性：检测临床特异性：检测临床TP抗体阴性血清，抗体阴性血清，阴性符合率阴性符合率为为100%，特异性良好，特异性良好v对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高对比实验：灵敏度较商品化化学发光试剂盒提高4倍，特异性二者相当倍，特异性二者相当西北大学西北大学 稳定性稳定性 精密度精密度线性范围线性范围 参考值参考值特异性特异性 对比实验对比实验HRP标记抗原稀释液标记抗原稀释液抗原包被量抗原包被量酶标抗原稀释浓度酶标抗原稀释浓度血清样本稀释液血清样本稀释液保护剂保护剂对方法进行比较全面的评价对方法进行比较全面的评价方法的进一步优化方法的进一步优化初步建立的化学发光磁酶免疫分析法初步建立的
20、化学发光磁酶免疫分析法全文总结：全文总结：西北大学西北大学 中试放大中试放大梅毒抗体梅毒抗体临床科研临床科研血清盘血清盘梅毒螺旋梅毒螺旋体抗体诊体抗体诊断试剂国断试剂国家参考品家参考品西北大学西北大学 主要生产工艺及反应体系研究资料主要生产工艺及反应体系研究资料 v半成品试剂盒的检定半成品试剂盒的检定v成品试剂盒的检定成品试剂盒的检定 Company Logo v包被抗原包被抗原v酶标抗原酶标抗原v试剂盒阳性对照品、阴性对照品研制试剂盒阳性对照品、阴性对照品研制Company Logo主要原材料研究资料主要原材料研究资料稳定性研究资料稳定性研究资料v批间稳定性批间稳定性v标准品稳定性检测标准品
21、稳定性检测v试剂盒成品稳定性检测试剂盒成品稳定性检测v试剂盒开封稳定性试剂盒开封稳定性Company Logo性能评估资料性能评估资料v试剂灵敏度的考察试剂灵敏度的考察v试剂特异性的考察试剂特异性的考察v试剂重复性的考察试剂重复性的考察v试剂准确性的考察试剂准确性的考察 v与市售同类产品的比较与市售同类产品的比较Company Logo致致 谢谢v 感谢导师崔亚丽教授对我学业的悉心指导。感谢导师崔亚丽教授对我学业的悉心指导。v 感谢陈超教授为我提供了一流的实验平台。感谢陈超教授为我提供了一流的实验平台。v 感谢李如琳副教授对我学业上的指导帮助。感谢李如琳副教授对我学业上的指导帮助。v 感谢纳米材料组彭明丽副教授、所有同学及全体员工对我感谢纳米材料组彭明丽副教授、所有同学及全体员工对我的无私帮助。的无私帮助。v 感谢国微中心全体成员对我工作的支持。感谢国微中心全体成员对我工作的支持。v 感谢我的父母一直对我的大力支持与关怀。感谢我的父母一直对我的大力支持与关怀。v 感谢各位评委老师。感谢各位评委老师。西北大学西北大学
