1、第第二二章章 灭活疫苗灭活疫苗疫疫 苗苗 活疫苗活疫苗-减毒活疫苗减毒活疫苗 减毒不够减毒不够：在使用时有致病的可能性在使用时有致病的可能性 过分减毒过分减毒：造成免疫原性不足或丧失，失去活疫苗的效力造成免疫原性不足或丧失，失去活疫苗的效力 灭活疫苗灭活疫苗传统的传统的灭活疫苗灭活疫苗 将病原体将病原体(病毒、细菌及其他微生物病毒、细菌及其他微生物)经培养经培养增殖、增殖、灭活灭活、纯化处理、纯化处理 使其完全丧失感染性使其完全丧失感染性 具有较好的安全性具有较好的安全性 保留了病原体的几乎全部组分保留了病原体的几乎全部组分 具有较强的免疫原性具有较强的免疫原性传统灭活疫苗传统灭活疫苗的缺点的
2、缺点 制备灭活疫苗制备灭活疫苗需要大量抗原需要大量抗原 难以培养或尚不能培养的病原体难以培养或尚不能培养的病原体（乙型、丙型和乙型、丙型和戊型肝炎病毒及麻风杆菌等戊型肝炎病毒及麻风杆菌等）难难以制备或无法以制备以制备或无法以制备 危险性大的病原体危险性大的病原体（艾滋病病毒艾滋病病毒）存在较大风险存在较大风险基因工程手段基因工程手段-新型疫苗新型疫苗第一节第一节 灭活疫苗概述及现况灭活疫苗概述及现况一、一、灭活疫苗概述灭活疫苗概述 灭活疫苗灭活疫苗：用免疫原性强的病原微生物或用免疫原性强的病原微生物或其代谢产物，其代谢产物，接种接种于动物、鸡胚、组织或于动物、鸡胚、组织或细胞培养物中细胞培养物
3、中生长繁殖生长繁殖后，经后，经灭活处理灭活处理使使其失去致病力，但仍保留免疫原性而制成其失去致病力，但仍保留免疫原性而制成的生物制剂。的生物制剂。灭活疫苗灭活疫苗 主要主要成分：成分：由细菌体或病毒颗粒组成由细菌体或病毒颗粒组成 疫苗中含有的菌体或病毒颗粒是疫苗中含有的菌体或病毒颗粒是“死死”的，的，故故又又称作称作死疫苗死疫苗。接种途径：接种途径：通常是通常是注射途径注射途径 进入人体后不能生长繁殖，进入人体后不能生长繁殖，故故比较安全、稳定比较安全、稳定 需多次接种，才能产生比较牢固的免疫力。需多次接种，才能产生比较牢固的免疫力。灭活疫苗灭活疫苗 细菌性灭活疫苗细菌性灭活疫苗 1886年年
4、，加热方法加热方法灭活灭活猪霍乱菌猪霍乱菌 1896年年，制备全霍乱弧菌灭活免疫原制备全霍乱弧菌灭活免疫原 1935年年，福尔马林乙型脑炎鼠脑疫苗福尔马林乙型脑炎鼠脑疫苗 1937年年，用，用鸡胚生产流脑灭活疫苗鸡胚生产流脑灭活疫苗 病毒性病毒性灭活灭活疫苗疫苗 1949年年，发明人体胚胎组织体外培养方法发明人体胚胎组织体外培养方法，使使病原体的体外培养成为可能病原体的体外培养成为可能二、灭活疫苗的研究现状二、灭活疫苗的研究现状 近年的研究方向近年的研究方向:（1）针对其不足部分）针对其不足部分，进行不断改进和完善进行不断改进和完善；（2）探索新的研制途径。）探索新的研制途径。二、灭活疫苗的研
5、究现状二、灭活疫苗的研究现状 具体具体来说：来说：（1）增强其诱导的免疫反应、改进疫苗免疫）增强其诱导的免疫反应、改进疫苗免疫效果效果、延长持续时间延长持续时间；（2）选择新的灭活剂）选择新的灭活剂，并探索现有灭活剂对并探索现有灭活剂对病原体的作用原理，不断研制新疫苗。病原体的作用原理，不断研制新疫苗。二、二、灭活疫苗的研究现状灭活疫苗的研究现状 1.病毒性灭活疫苗病毒性灭活疫苗 脊髓灰质炎灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗 甲型肝炎甲型肝炎 流行性乙型脑炎流行性乙型脑炎 流感流感2.细菌性灭活疫苗细菌性灭活疫苗（1）脊髓灰质炎灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗 (inactivated poliomyeli
6、tis vaccine，IPV)研究始于研究始于1909年，但进展缓慢。年，但进展缓慢。1952年年，Salk用猴肾上皮细胞培养了三个血用猴肾上皮细胞培养了三个血清型的病毒清型的病毒 1953年年，制备出制备出IPV(又称又称Salk疫苗疫苗)免疫人体免疫人体，获得较高效价的血清中和抗体获得较高效价的血清中和抗体 中和进入血液中的脊髓灰质炎病毒，从而防止中和进入血液中的脊髓灰质炎病毒，从而防止麻痹症的出现。麻痹症的出现。1955年开始在美国、加拿大和欧洲国家逐年开始在美国、加拿大和欧洲国家逐渐推广使用，取得了良好的保护效果。渐推广使用，取得了良好的保护效果。（1）脊髓灰质炎灭活疫苗脊髓灰质炎灭
7、活疫苗的的制备制备猴肾细胞、人二倍体细胞猴肾细胞、人二倍体细胞或或Vero细胞细胞病毒病毒病毒悬液病毒悬液灭活灭活37C，pH7.0，福尔马林福尔马林（1:4 000）脊髓灰质炎灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗12-15天天皮下注射皮下注射三次接种三次接种（2）甲型肝炎甲型肝炎 甲型肝炎病毒甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HA V)引起引起的急性传染病，主要通过粪的急性传染病，主要通过粪-口途径传播。口途径传播。病毒的体外培养病毒的体外培养 原代原代恒河恒河猴猴肝肝细胞细胞 传代恒河猴传代恒河猴胚肾胚肾细胞株细胞株(FRhK6)HAV灭活疫苗灭活疫苗 Havrix（美国美国Smit
8、hKline公司公司）Vaqta（美国美国Merck公司公司）AVAXIM（法国巴斯德血清和疫苗研究所法国巴斯德血清和疫苗研究所）1979年年，Provost和和Hilleman（3）流行性乙型脑炎流行性乙型脑炎 夏秋季，经蚊子叮咬传播，是人畜共患的夏秋季，经蚊子叮咬传播，是人畜共患的中枢神经系统传染病。中枢神经系统传染病。1954年年，灭活疫苗在日本问世灭活疫苗在日本问世（中山株中山株/鼠鼠脑脑）1968年年，中，中国从开始生产国从开始生产（P3株株/原代仓鼠原代仓鼠肾细胞肾细胞）1988年，年，WHO颁布了生产规程。颁布了生产规程。（4）流感流感 由流感病毒引起的由流感病毒引起的，具有高度
9、传染性的急具有高度传染性的急性呼吸道传染病性呼吸道传染病 流行病学特点流行病学特点:突然暴发，迅速蔓延突然暴发，迅速蔓延 影响面大，发病率高影响面大，发病率高 伴有一定的死亡率。伴有一定的死亡率。（4）流感流感流感病毒流感病毒的的毒粒表面的抗原变异问题毒粒表面的抗原变异问题 血凝素血凝素(hemagglutinin，HA)神经氨酸酶神经氨酸酶(neuramindase，N A)抗原性抗原性的的变异形式变异形式 -甲型流感病毒甲型流感病毒 抗原漂移抗原漂移 亚型内亚型内HA和和/或或NA不断发生点突变不断发生点突变 突变不断突变不断积累积累，使抗原位点发生使抗原位点发生构型改变构型改变 导致人群
10、导致人群特异性免疫失败特异性免疫失败 导致流感病毒流行导致流感病毒流行 抗原变异抗原变异 指一种新指一种新HA和和/或或NA亚型在人群中突然出现，亚型在人群中突然出现，起因未明。起因未明。量变量变质质变变流感病毒抗原流感病毒抗原特点：特点：抗原的多变性抗原的多变性 抗原的漂移抗原的漂移 存在存在多种亚型多种亚型（1）人类对流感病毒人类对流感病毒普遍的易感性普遍的易感性（2）不易从以往获得不易从以往获得的抗体的抗体，得到有效的得到有效的保护保护导致导致因此，虽然因此，虽然1937年年就就用鸡胚培养流用鸡胚培养流感病毒获得成功感病毒获得成功，但至今尚无，但至今尚无十分十分满意的制品。满意的制品。流
11、感病毒流感病毒疫苗疫苗 长春生物制品研究所长春生物制品研究所 新型精制三价流行性感冒灭活疫苗新型精制三价流行性感冒灭活疫苗 临床免疫效果评价临床免疫效果评价（2000年）年）临床反应临床反应轻微轻微（0.98%）血清抗体阳转率血清抗体阳转率99%-100%1年以上年以上好好免疫力持续免疫力持续时间时间疫苗稳定性疫苗稳定性总反应率总反应率：与国外同类疫苗无明显差与国外同类疫苗无明显差别，具有良好的安全性。别，具有良好的安全性。2.细菌性灭活疫苗细菌性灭活疫苗 致病机理、免疫机理研究长期无突破性进展致病机理、免疫机理研究长期无突破性进展 因此因此难以难以进行疫苗研制，使有些疾病长期得进行疫苗研制，
12、使有些疾病长期得不到有效控制不到有效控制。细菌本身结构组成复杂细菌本身结构组成复杂基础研究的滞后基础研究的滞后2.细菌性灭活疫苗细菌性灭活疫苗 存在问题：存在问题：有些病原体属于人畜共患，解决起来较为有些病原体属于人畜共患，解决起来较为困难困难;消化道传染病消化道传染病:疫苗诱生的局部免疫力较弱，免疫力持续时间疫苗诱生的局部免疫力较弱，免疫力持续时间较短，使用效果往往不好，易于重复感染较短，使用效果往往不好，易于重复感染;有的灭活疫苗副作用大，甚至引起严重后有的灭活疫苗副作用大，甚至引起严重后遗症或造成死亡，可接受性极差。遗症或造成死亡，可接受性极差。（1）伤寒杆菌伤寒杆菌灭活疫苗灭活疫苗伤寒
13、杆菌伤寒杆菌-引起伤寒发病的主要病原引起伤寒发病的主要病原 1886年年，英国的英国的Wright、德国的、德国的Pfeiffer和和Kolle分别制备出全菌体灭活疫苗分别制备出全菌体灭活疫苗 丙酮灭活疫苗丙酮灭活疫苗：保护率较高，但副反应也高保护率较高，但副反应也高，难以推广难以推广。Vi荚膜多糖疫苗荚膜多糖疫苗：安全，但保护率又较低。安全，但保护率又较低。（1）伤寒杆菌伤寒杆菌灭活疫苗灭活疫苗新型伤寒疫苗新型伤寒疫苗 Ty21a活疫苗活疫苗 口服活疫苗，保护率达口服活疫苗，保护率达96%，目前已在全世界，目前已在全世界使用使用;Vi荚膜多糖疫苗荚膜多糖疫苗 将伤寒杆菌培养后将伤寒杆菌培养后
14、，对其对其Vi荚膜多糖抗原进行荚膜多糖抗原进行提纯精制提纯精制的一种组分疫苗的一种组分疫苗 制备工艺简单，安全性好，制备工艺简单，安全性好，已已在全球推广使用在全球推广使用，目前我国多家生物制品单位均能生产。，目前我国多家生物制品单位均能生产。（2）霍乱灭活疫苗）霍乱灭活疫苗霍乱弧菌引起的一种烈性传染病霍乱弧菌引起的一种烈性传染病 1884年年，Ferran研制出霍乱疫苗研制出霍乱疫苗（注射注射）保护期短，副反应大。保护期短，副反应大。霍乱全菌体灭活疫苗霍乱全菌体灭活疫苗(whole cell vaccine，WCV)霍乱霍乱WCV-霍乱毒素霍乱毒素B亚单位亚单位(B subunit of c
15、holera toxin，CTB)对小鼠胃肠外免疫，能抵御霍乱毒素对小鼠胃肠外免疫，能抵御霍乱毒素(cholera toxin，CT)2.25-3 LD50的攻击，免疫效果与的攻击，免疫效果与CVD103-HgR减毒活疫苗相同。减毒活疫苗相同。（2）霍乱灭活疫苗）霍乱灭活疫苗 口服口服B亚单位亚单位-全菌体全菌体(B subunit-whole cell，BS-WC)霍乱疫苗霍乱疫苗（1980s，瑞典，瑞典）疫苗的保护期疫苗的保护期：3年年 头半年保护率是头半年保护率是85%，3年后是年后是51%。（2）霍乱灭活疫苗）霍乱灭活疫苗 重组霍乱毒素重组霍乱毒素B亚单位亚单位-全菌体疫苗全菌体疫苗(
16、recombi-nant B subunit-whole cell，rBS-WC),又称又称冻干口服霍乱疫苗冻干口服霍乱疫苗 中中国军事医学科学院国军事医学科学院（1997年年）2000年取得国家一类新药证书年取得国家一类新药证书 免疫保护时间免疫保护时间：3年。年。独到之处独到之处：生产生产B亚单位抗原的工程菌是大肠杆菌，较国亚单位抗原的工程菌是大肠杆菌，较国外用霍乱减毒株工艺操作安全外用霍乱减毒株工艺操作安全、方便方便;疫苗剂型是胶囊，较国外的水剂便于服用且价疫苗剂型是胶囊，较国外的水剂便于服用且价格低廉。格低廉。（3）百日咳）百日咳灭活疫苗灭活疫苗 儿童常见的呼吸道传染病，传染性强，临儿
17、童常见的呼吸道传染病，传染性强，临床上主要引起床上主要引起痉痉孪性阵咳。孪性阵咳。1932年年，Kendrick用羊血包姜培养基，经硫用羊血包姜培养基，经硫柳柳汞汞灭活制备疫苗成功灭活制备疫苗成功；1981年，纯化百日咳杆菌抗原组成的无细年，纯化百日咳杆菌抗原组成的无细胞百日咳疫苗胞百日咳疫苗（日本日本）优点优点：青少年和成人较易接受青少年和成人较易接受，并有可能实施并有可能实施加强免疫。加强免疫。（3）百日咳）百日咳灭活疫苗灭活疫苗 2001年年3月，日本一个科研小组使用茶叶中月，日本一个科研小组使用茶叶中的的儿茶素儿茶素制造制造无无毒百日咳疫苗获得成功毒百日咳疫苗获得成功，免疫功能更强，副
18、作用更小。免疫功能更强，副作用更小。福尔马林灭活福尔马林灭活的疫苗的疫苗：常常引起炎症等病症常常引起炎症等病症 儿茶素灭活儿茶素灭活的疫苗的疫苗：不会产生这些副作用不会产生这些副作用灭活疫苗的研究现状灭活疫苗的研究现状 1.病毒性灭活疫苗病毒性灭活疫苗 脊髓灰质炎灭活疫苗脊髓灰质炎灭活疫苗 甲型肝炎甲型肝炎 流行性乙型脑炎流行性乙型脑炎 流感流感2.细菌性灭活疫苗细菌性灭活疫苗 伤寒杆菌伤寒杆菌 霍乱霍乱 百日咳百日咳3.无针注射免疫法无针注射免疫法3.无针无针（喷射）（喷射）注射器注射器 起源：起源：美军细菌战美军细菌战的发明的发明 在疫苗接种的应用：在疫苗接种的应用：1954年，年，白喉和
19、破伤风类毒素白喉和破伤风类毒素疫苗的疫苗的大规模接大规模接种种 原理原理：通过细小通过细小、有高压的疫苗液体流有高压的疫苗液体流，直接注射到皮下直接注射到皮下。3.无针无针（喷射）（喷射）注射器注射器无针注射法的免疫应答无针注射法的免疫应答效果效果 法国和南非法国和南非（共（共1500多人）多人）流感灭活疫苗流感灭活疫苗(Vaxigrip)Vi多糖伤寒疫苗多糖伤寒疫苗(TyphimVi)破伤风类毒素破伤风类毒素(Tetavax)百白破全细胞疫苗百白破全细胞疫苗(DTCoq)甲肝灭活疫苗甲肝灭活疫苗(Avaxim)与与 常规注射器在皮下、皮内、肌内等免疫常规注射器在皮下、皮内、肌内等免疫途径进行
20、了比较。途径进行了比较。无针注射法的免疫应答无针注射法的免疫应答效果效果 评估标准评估标准 血清抗体阳转率血清抗体阳转率 抗体几何平均滴度值抗体几何平均滴度值 注射部位的局部反应注射部位的局部反应 结果结果 抗白喉和抗破伤风的阳转率偏低抗白喉和抗破伤风的阳转率偏低 其他的疫苗免疫效果均高于或与常规接种方法其他的疫苗免疫效果均高于或与常规接种方法一致一致 接种时的局部反应都很小，而且都是瞬时的。接种时的局部反应都很小，而且都是瞬时的。3.无针无针（喷射）（喷射）注射器注射器优点：优点：使用便捷，使用便捷，每次接种只需更换疫苗管每次接种只需更换疫苗管；无需人员的专业培训；无需人员的专业培训；更好地
21、激发更好地激发机体产生良好的免疫应答机体产生良好的免疫应答 与与常规肌内注射常规肌内注射相比，相比，注射部位浅，但所造成的注射部位浅，但所造成的创面更大创面更大，而且疫苗被输送到，而且疫苗被输送到表皮深层表皮深层，在这个，在这个部位有部位有更多的免疫细胞更多的免疫细胞(如巨噬细胞、树突状细胞如巨噬细胞、树突状细胞等等)，抗原能够更好地和这些细胞结合，抗原能够更好地和这些细胞结合三三、联合免疫研究现状、联合免疫研究现状 理想的疫苗理想的疫苗：含有多种有良好免疫原性和稳定性的抗原、生含有多种有良好免疫原性和稳定性的抗原、生产成本低廉、接种途径简单以及产成本低廉、接种途径简单以及一次接种能产一次接种
22、能产生多种免疫生多种免疫和无毒副作用的疫苗。和无毒副作用的疫苗。1991年，年，儿儿童免疫计划童免疫计划(Childrens Vaccine Initiative，CVI）改进现有疫苗改进现有疫苗，并创制新的疫苗并创制新的疫苗 联合免疫得到了进一步的推进。联合免疫得到了进一步的推进。联合疫苗联合疫苗的分类的分类 多联疫苗多联疫苗 预防不同病原体引起的传染病预防不同病原体引起的传染病 百白破联合疫苗百白破联合疫苗预防百日咳、白喉和破伤预防百日咳、白喉和破伤风三种不同的传染病风三种不同的传染病 多价疫苗多价疫苗 仅预防一种病原体不同血清型引起的传染病仅预防一种病原体不同血清型引起的传染病 肺炎多糖
23、疫苗肺炎多糖疫苗由代表由代表23种不同血清型的细种不同血清型的细菌多糖组成，但只能预防肺炎球菌的感染。菌多糖组成，但只能预防肺炎球菌的感染。影响联合免疫效果的因素影响联合免疫效果的因素 联合疫苗中各组分间的化学和物理作用可联合疫苗中各组分间的化学和物理作用可影响疫苗的免疫应答。影响疫苗的免疫应答。如佐剂、缓冲剂、贮存剂和赋形剂等通常如佐剂、缓冲剂、贮存剂和赋形剂等通常需要重新配伍。需要重新配伍。影响联合免疫效果的因素影响联合免疫效果的因素 多价疫苗多价疫苗 问题较易解决，因疫苗中含有相同的成分，其问题较易解决，因疫苗中含有相同的成分，其中一个组分的稳定配方通常适用于其他组分，中一个组分的稳定配
24、方通常适用于其他组分，但也需要对每一个组分做专门的但也需要对每一个组分做专门的测测试以保证成试以保证成品的理化配伍性和稳定性。品的理化配伍性和稳定性。活病毒间可相互干扰，如一个病毒可因激活免活病毒间可相互干扰，如一个病毒可因激活免疫应而产生干扰素从而抑制另一个病毒。疫应而产生干扰素从而抑制另一个病毒。影响联合免疫效果的因素影响联合免疫效果的因素 多多联联疫苗疫苗 一一个组分的添加剂不一定能保个组分的添加剂不一定能保证证另一组分的稳另一组分的稳定性定性 如如：DTwcP/IPV联合疫苗中，用于联合疫苗中，用于DTwcP的防腐的防腐剂剂硫柳硫柳汞汞可破坏可破坏IPV活性，故不能混装在一个瓶活性，故
25、不能混装在一个瓶中，中，需需采用双室注射器。采用双室注射器。DTwcP：百白破疫苗：百白破疫苗 IPV：脊髓灰质炎灭活疫苗：脊髓灰质炎灭活疫苗第二节第二节 灭活疫苗制备的技术要求灭活疫苗制备的技术要求一、灭活疫苗的设计要求一、灭活疫苗的设计要求 1.制备过程制备过程 病原体的培养病原体的培养 灭活剂和灭活方法的使用灭活剂和灭活方法的使用 疫苗的后处理疫苗的后处理（1）病原体的选择）病原体的选择 必需具有很强的免疫原性必需具有很强的免疫原性 具有恒定的培养特性和生化特性具有恒定的培养特性和生化特性，不易，不易变异变异 易于易于在人工培养基上或特定的组织或细在人工培养基上或特定的组织或细胞中胞中培
26、养培养并可进行并可进行规模化生产规模化生产病原体的选择病原体的选择 在培养过程中不产生或产生在培养过程中不产生或产生较小的毒性较小的毒性;制备类毒素的菌种制备类毒素的菌种：在培养过程中能在培养过程中能产产生大量的典型毒素生大量的典型毒素;要针对不同的病原血清型选择要针对不同的病原血清型选择符合当地符合当地流行的菌、毒株流行的菌、毒株，以保证所制造的疫苗具，以保证所制造的疫苗具有良好的免疫效果有良好的免疫效果灭活方法的选择灭活方法的选择 灭活方法的选择关系到疫苗质量的好坏灭活方法的选择关系到疫苗质量的好坏 灭活剂灭活剂（关键关键）灭活灭活条件条件 灭活灭活时间时间 既要考虑其对疫苗抗原性的破坏作
27、用，同既要考虑其对疫苗抗原性的破坏作用，同时又要避免其对毒素的脱毒后又发生毒性时又要避免其对毒素的脱毒后又发生毒性逆转现象。逆转现象。细菌性灭活疫苗和类毒素的制备工艺细菌性灭活疫苗和类毒素的制备工艺福尔马林对福尔马林对外毒素脱毒外毒素脱毒的影响因素的影响因素 研究证明研究证明:很低浓度的福尔马林即能使外毒素完全脱毒并很低浓度的福尔马林即能使外毒素完全脱毒并能保持其良好的免疫原性，表明福尔马林是一能保持其良好的免疫原性，表明福尔马林是一个较为理想的脱毒剂。个较为理想的脱毒剂。福尔马林的脱毒作用较为复杂，在使用时福尔马林的脱毒作用较为复杂，在使用时要特别注意影响福尔马林脱毒的四个因素要特别注意影响
28、福尔马林脱毒的四个因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 温度温度 pH 福尔马林浓度福尔马林浓度 毒素种类毒素种类 这四者这四者相互联系、相互影响相互联系、相互影响，改变其中任何一个因素都会改变其中任何一个因素都会产生不同的结果，故在制备产生不同的结果，故在制备疫苗时要综合考虑，选择最疫苗时要综合考虑，选择最佳的脱毒条件。佳的脱毒条件。福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 温度温度在其他因素固定的条件下在其他因素固定的条件下 温度越高，脱毒越快温度越高，脱毒越快脱毒温度脱毒温度 类毒化时间就会延长类毒化时间就会延长 如如需需加快作用时间加快作
29、用时间：必须提高福尔马林浓度必须提高福尔马林浓度和和pH。福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 温度温度-视具体的疫苗种类而定视具体的疫苗种类而定 一般脱毒温度一般脱毒温度：37 -39 脱毒温度脱毒温度40 破坏外毒素的抗原性破坏外毒素的抗原性 产生外产生外毒素毒素的菌种的菌种：在在较低温度较低温度下脱毒效果更好下脱毒效果更好福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 微酸条件下微酸条件下（pH6.3）脱毒时间很慢，需要较高的福尔马林浓度脱毒时间很慢，需要较高的福尔马林浓度 如福尔马林浓度较高，脱毒完成后会剩余较多如福尔马林浓度较高，脱毒完成后会剩余
30、较多的游离福尔马林，使类毒素的脱毒过甚，损害的游离福尔马林，使类毒素的脱毒过甚，损害了类毒素效力的稳定性。了类毒素效力的稳定性。福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 碱性条件下碱性条件下 脱毒快，可用较低的福尔马林浓度。脱毒快，可用较低的福尔马林浓度。pH=7.28.6，福尔马林浓度的使用和，福尔马林浓度的使用和pH成反比。成反比。在在强碱性溶液中脱毒，类毒素的抗原性损失会强碱性溶液中脱毒，类毒素的抗原性损失会加大。加大。因此，外毒素脱毒时因此，外毒素脱毒时pH很重要，很重要，通常以微碱性通常以微碱性为最好。为最好。福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影
31、响因素 福尔马林浓度福尔马林浓度 福尔马林浓度福尔马林浓度脱毒脱毒速率速率 浓度越高浓度越高，脱毒时间越快，其抗原性的损失也脱毒时间越快，其抗原性的损失也越大。越大。福尔马林对外毒素脱毒的影响因素福尔马林对外毒素脱毒的影响因素 毒素毒素的种类的种类 不同不同种种类类外毒素分子量和分子结构不一外毒素分子量和分子结构不一，不同不同菌株要使用不同培养基菌株要使用不同培养基 不同的外毒素中均含有不同种类及不同浓度的含氮不同的外毒素中均含有不同种类及不同浓度的含氮物质，如蛋白质、物质，如蛋白质、肽肽类和氨基酸等，这些化合物都类和氨基酸等，这些化合物都能与福尔马林起作用。能与福尔马林起作用。所以，不同外毒
32、素在脱毒时所使用的温度、所以，不同外毒素在脱毒时所使用的温度、pH和福尔马林浓度是不一样的和福尔马林浓度是不一样的二二、病毒性灭活疫苗的设计及制备要求、病毒性灭活疫苗的设计及制备要求 病毒病原体自身的结构组成和生物学活性病毒病原体自身的结构组成和生物学活性较为简单，在考虑制备灭活疫苗时，一般较为简单，在考虑制备灭活疫苗时，一般将全部病毒颗粒用来作为疫苗抗原，以寻将全部病毒颗粒用来作为疫苗抗原，以寻求其最佳的保护效果。求其最佳的保护效果。病毒性灭活疫苗的优点病毒性灭活疫苗的优点制备工艺较为成熟，免疫原的稳定性高，制备工艺较为成熟，免疫原的稳定性高，培养的病毒含量达到要求滴度即可进行大培养的病毒含
33、量达到要求滴度即可进行大量生产，较易制备多价疫苗量生产，较易制备多价疫苗;由于不存在活病毒颗粒，没有感染问题，由于不存在活病毒颗粒，没有感染问题，安全性好安全性好;保存方便，一般无需冻干保存。保存方便，一般无需冻干保存。病毒性灭活疫苗的缺点病毒性灭活疫苗的缺点制备疫苗的毒株为强毒株，如在制备过程制备疫苗的毒株为强毒株，如在制备过程中灭活不彻底，极易酿成重大事故中灭活不彻底，极易酿成重大事故;由于所诱导的免疫反应持续时间较短，需由于所诱导的免疫反应持续时间较短，需多次进行免疫接种，可能引起过敏反应多次进行免疫接种，可能引起过敏反应;由于需要的抗原量大、质纯，因此要求对由于需要的抗原量大、质纯，因
34、此要求对疫苗进行浓缩和纯化疫苗进行浓缩和纯化；病毒性灭活疫苗的缺点病毒性灭活疫苗的缺点由于灭活疫苗接种不是通过自然感染途径由于灭活疫苗接种不是通过自然感染途径，一般不能诱生局部，一般不能诱生局部IgA免疫抗体，使外来免疫抗体，使外来病毒仍可侵入门户，并在局部繁殖，保护病毒仍可侵入门户，并在局部繁殖，保护效果不甚满意效果不甚满意;5 由于灭活剂对病毒的抗原性有一定影响，由于灭活剂对病毒的抗原性有一定影响，灭活疫苗需要添加佐剂。灭活疫苗需要添加佐剂。病毒性灭活疫苗制备工艺流程第三节第三节 疫苗灭活方法对机体免疫苗灭活方法对机体免疫应答的影响疫应答的影响一、灭活方法及其作用原理一、灭活方法及其作用原
35、理 1.物理作用灭活物理作用灭活 加热加热紫外线紫外线加热加热灭活灭活 原理原理：使蛋白质变性从而使病原体失去传染性使蛋白质变性从而使病原体失去传染性 简单有效简单有效56-57水浴水浴 1h 注意注意:使内容物受热均匀使内容物受热均匀不同的病原体对热的耐受性不同不同的病原体对热的耐受性不同紫外线紫外线照射灭活照射灭活 原理原理 使病原体的使病原体的DNA形成形成TT二聚体，二聚体，无法作无法作为模板转录为为模板转录为mRNA，不能复制子代，不能复制子代DNA与合成蛋白，从而使病原体与合成蛋白，从而使病原体失去感染性。失去感染性。优点优点 在在DNA、RNA水平上对病原体进行灭活，最大水平上对
36、病原体进行灭活，最大限度地保留了抗原的完整性和免疫原性。限度地保留了抗原的完整性和免疫原性。尚未运用于实际的疫苗生产尚未运用于实际的疫苗生产 灭活程度不完全，且病原体有光复活的可能。灭活程度不完全，且病原体有光复活的可能。2.化学作用灭活化学作用灭活 灭活剂灭活剂 福尔马林、丙酮、苯酚福尔马林、丙酮、苯酚-丙内丙内酯酯(-propiolactone，BPL)乙烯亚乙烯亚胺胺(ethy lenimine)双乙烯亚双乙烯亚胺胺(binary ethylenimine，BEl)磷酸三丁磷酸三丁酯酯、乙醇、硫柳、乙醇、硫柳汞汞等。等。（1）福尔马林福尔马林 传统的灭活剂，应用最广泛。传统的灭活剂，应用
37、最广泛。灭活机理灭活机理：作用于作用于病毒核酸病毒核酸 病毒核酸中含氨基的核苷酸碱基病毒核酸中含氨基的核苷酸碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤和腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶胞嘧啶)发生反应。发生反应。作用于作用于病毒壳蛋白病毒壳蛋白 使氨基酸或氨基酸基团暴露，引起蛋白质变性以阻使氨基酸或氨基酸基团暴露，引起蛋白质变性以阻碍核酸从病毒颗粒中释放，使病毒失去感染力。碍核酸从病毒颗粒中释放，使病毒失去感染力。（1）福尔马林福尔马林 灭活病毒灭活病毒的种类的种类：乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、狂犬病毒、森林脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病狂犬病毒、森林脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病
38、毒、巨细胞病毒、甲型肝炎病毒和毒、巨细胞病毒、甲型肝炎病毒和HlV等等 灭活细菌灭活细菌的种类：的种类：伤寒杆菌、短棒状杆菌、绿版杆菌等。伤寒杆菌、短棒状杆菌、绿版杆菌等。（1）福尔马林福尔马林 疫苗内残余的福尔马林含量较高时疫苗内残余的福尔马林含量较高时(1:2000)注射局部可引起疼痛注射局部可引起疼痛 使用亚硫酸氢使用亚硫酸氢钠钠中和后可消除痛感。中和后可消除痛感。（2）-丙内酯(-propiolactone，BPL)广泛地应用于多种人和动物疫苗的生产广泛地应用于多种人和动物疫苗的生产 可能作用机理可能作用机理：作作 用于病原体的用于病原体的DNA和和RNA，而不直接作用于，而不直接作用
39、于蛋白。蛋白。它能在机体内完全它能在机体内完全分解分解为为无毒性的无毒性的-羟羟丙酸丙酸，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对，这是一种人体内脂肪代谢后的产物，对人体和动物体无毒。人体和动物体无毒。（2）-丙内酯（BPL）一种不稳定的液体一种不稳定的液体 加热加热37 2h能自行能自行水解水解为一种为一种无无毒毒的物质，的物质，也可加入亚硫酸也可加入亚硫酸钠钠停止其反应。停止其反应。1984年被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂正式使用年被选作狂犬灭活疫苗的灭活剂正式使用（2）-丙内酯（BPL）缺点缺点:本身具有本身具有致癌性致癌性，对工作人员仍有致癌作用，对工作人员仍有致癌作用，需要加以特殊防护，需要加
40、以特殊防护;BPL可以改变人血清白蛋白的性质，引起人可以改变人血清白蛋白的性质，引起人体全身性的变态反应，因此所灭活的病毒培养体全身性的变态反应，因此所灭活的病毒培养液中不能含有人血清白蛋白液中不能含有人血清白蛋白（3）乙烯亚胺和双乙烯亚胺 乙烯亚胺乙烯亚胺 灭灭活原理活原理：类似于类似于-丙内酯丙内酯(BPL)无论在安全性还是保持疫苗的抗原性方面都较无论在安全性还是保持疫苗的抗原性方面都较福尔马林更为优越。福尔马林更为优越。1955年灭活噬菌体年灭活噬菌体 口蹄疫疫苗，己在世界范围内生产使用口蹄疫疫苗，己在世界范围内生产使用（3）乙烯亚胺和双乙烯亚胺 双双乙烯亚胺乙烯亚胺（BEl）在碱性环境
41、中由单体的乙烯亚在碱性环境中由单体的乙烯亚胺胺结晶后形成结晶后形成 更稳定、更安全更稳定、更安全 BEl和和BPL的灭活效果比用福尔马林几乎高两的灭活效果比用福尔马林几乎高两倍。倍。二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌 不同灭活剂对不同病原体的作用机制不同不同灭活剂对不同病原体的作用机制不同，对疫苗的免疫原性影响各异，导致疫苗，对疫苗的免疫原性影响各异，导致疫苗接种后不同的机体免疫应答。接种后不同的机体免疫应答。一般来讲，灭活疫苗所诱导的免疫水平较一般来讲，灭活疫苗所诱导的免疫水平较低，仅能诱导较低滴度的抗体水平，很难低，仅能诱导较低滴度的抗体水平，很难激发细胞免疫
42、。激发细胞免疫。二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌二、病毒灭活对机体免疫应答的影晌 主要原因主要原因：灭活灭活使使病原体的蛋白质受到破坏，有的变性失病原体的蛋白质受到破坏，有的变性失去了免疫原性去了免疫原性;灭活后的病原体蛋白经过补体加工处理后，其灭活后的病原体蛋白经过补体加工处理后，其肽肽段上的表位受到破坏，被抗原递呈细胞段上的表位受到破坏，被抗原递呈细胞(APC)递呈给递呈给MHC-I 类分子时，类分子时，MHC-I类分子对这些类分子对这些表位的识别受到了限制，很难激发细胞免疫的表位的识别受到了限制，很难激发细胞免疫的产生。产生。不同灭活方法对疫苗免疫原性的影响不同灭活方法对疫苗免疫原性的影
43、响 Indiana型水泡性口炎病毒型水泡性口炎病毒（VSV）灭活方法灭活方法：福尔马林福尔马林：0.00625%，4C作作用用18h -丙内酯丙内酯：0.1%，4C作用作用18h 紫外线紫外线：7X15W的紫外灯照射的紫外灯照射2h，距离，距离10 cm 对其诱导中和抗体及对其诱导中和抗体及CTL应答能力进行评估应答能力进行评估不同灭活方法对疫苗免疫原性的影响不同灭活方法对疫苗免疫原性的影响 用用VSV-IND活病毒和活病毒和3种灭活病毒免疫种灭活病毒免疫BALB/c小鼠小鼠 活病毒的浓度为活病毒的浓度为2 X 104PFU和和2 X 106PFU 灭活病毒的浓度为灭活病毒的浓度为2 X 10
44、6PFU和和2X 108PFU。血清中和试验血清中和试验：3种灭活病毒种灭活病毒均可诱导均可诱导IgG产生，且滴度基本相产生，且滴度基本相同，但同，但明显低于明显低于活病毒诱导的抗体滴度。活病毒诱导的抗体滴度。不同灭活方法对疫苗免疫原性的影响不同灭活方法对疫苗免疫原性的影响 对对VSV特异性特异性CTL应答应答的影响的影响灭活病毒免疫灭活病毒免疫C57BL/6小鼠后小鼠后6、12、30天取脾，以天取脾，以EL-4细胞为靶细胞，用细胞为靶细胞，用51 Cr释释放法测定放法测定CTL活性。活性。对VSV特异性CTL应答的影响 福尔马林和福尔马林和-丙内酯灭活的病毒均无诱导丙内酯灭活的病毒均无诱导C
45、TL的作用的作用 紫外线灭活的病毒紫外线灭活的病毒 高剂量高剂量组组：第：第6天天小鼠脾细胞有一定的小鼠脾细胞有一定的CTL细胞细胞诱导作用，在第诱导作用，在第12天出现强的天出现强的CTL效应效应 低剂量低剂量组组：12天小鼠脾细胞有可测出的天小鼠脾细胞有可测出的CTL效效应，第应，第30天取出的鼠脾细胞仍有天取出的鼠脾细胞仍有CTL活性。活性。三、三、细菌细菌灭活对机体免疫应答的影晌灭活对机体免疫应答的影晌 预防尿路感染的大肠杆菌灭活疫苗预防尿路感染的大肠杆菌灭活疫苗 扫描电镜扫描电镜：福尔马林福尔马林紫外线紫外线加热加热细菌表面细菌表面的的菌毛菌毛有有有有无无与与菌毛糖受体结合菌毛糖受体
46、结合第四节第四节 灭活疫苗的展望灭活疫苗的展望 灭活疫苗应用至今已有灭活疫苗应用至今已有100多年的历史，在多年的历史，在其发展过程中随着科学技术的进步，已有其发展过程中随着科学技术的进步，已有数十种疫苗为保障人类的健康做出了巨大数十种疫苗为保障人类的健康做出了巨大贡献。贡献。虽然目前已有一些疫苗由于基因工程疫苗虽然目前已有一些疫苗由于基因工程疫苗或更好的减毒活疫苗的问世而不再使用，或更好的减毒活疫苗的问世而不再使用，如灭活乙型肝炎疫苗已被如灭活乙型肝炎疫苗已被HBsAg基因工程疫基因工程疫苗所取代，但对于有些在世界范围内即将苗所取代，但对于有些在世界范围内即将被消灭的传染病而言，有效的灭活疫苗的被消灭的传染病而言，有效的灭活疫苗的使用显得更加重要使用显得更加重要。展 望 加强原有抗原量及筛选新的菌、毒株加强原有抗原量及筛选新的菌、毒株 研究和筛选新的灭活剂研究和筛选新的灭活剂 研究新的佐剂激发机体研究新的佐剂激发机体CTL免疫免疫 灭活疫苗和其他亚单位疫苗、基因工程疫灭活疫苗和其他亚单位疫苗、基因工程疫苗等合用，是未来研制新的多价疫苗的方苗等合用，是未来研制新的多价疫苗的方向。向。
