1、神经干细胞及其在神经神经干细胞及其在神经系统疾病中的应用系统疾病中的应用 神经干细胞的概念神经干细胞的概念Neural Stem Cell 根据1997年Mckay在Science上发表的文章认为，神经干细胞就是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。（专能干细胞、多能干细胞）先祖细胞(Progenitor)：前体细胞(Precursor)：神经干细胞的研究历史神经干细胞的研究历史 传统观点：传统观点：神经细胞是永久性细胞，是不可能分裂的。神经细胞损伤后由神经胶质增生进行修复。这种观点使人们对帕金森病、多发性硬化及脑脊髓损伤等疾病的治疗受
2、到了很大的限制。早在20世纪60年代，Altman用同位素标记的胸腺嘧啶掺入脑中，发现在新皮质、海马、嗅球的细胞有同位素掺入，证明这些区域有能分裂的细胞存在。但是，由于当时的条件无法进行活体追踪，体外培养也未能建立，因此传统的观点一直占优势。这应该是对神经干细胞最早的研究。对脑内存在干细胞的认识是从研对脑内存在干细胞的认识是从研究究胚胎脑胚胎脑发育开始的：发育开始的：1989年Temple从13天大鼠胚胎脑的隔区取出少量细胞进行单个培养，看到这些细胞能发育成神经元和神经胶质细胞；1991年Williams等人的实验显示，将近20%的胚胎脑的皮质细胞可形成神经元和少突胶质细胞；1994年Davi
3、s和Temple通过单独培养大鼠胚胎脑皮质先祖细胞发现，单个细胞可以分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，即全部神经组织细胞类型。他们发现，约有7%的先祖细胞具有这种能力。在在成年动物成年动物的脑组织中也存在神经干细胞：的脑组织中也存在神经干细胞：1992年，Reynolds等首先从纹状体培养出干细胞样的中枢神经系统的多潜能细胞，后来知道这些细胞来自室管膜下区；1997年，Palmer等又从成年大鼠的海马齿状回培养出神经干细胞；此外，在成年动物的脊髓、小脑等也都分离和培养出了神经干细胞；在人类同样分离和培养出了神经干细胞。更令人兴奋的是，1998年由Eriksson等从成人的海马中也存在神
4、经元的前体细胞。总之，在动物和人类的神经系统中，从胚胎时期到成年时期均存在着神经干细胞。神经干细胞的特点神经干细胞的特点 神经干细胞具有以下特点：神经干细胞具有以下特点：1，具有多种分化潜能，即分化为神经组织的各种细胞，包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞（专能干细胞、多能干细胞）。2，具有自我更新的能力，所谓自我更新，指将干细胞的属性从亲代传递到子代细胞，即在分裂增殖过程中子代细胞仍然维持干细胞的属性（亲代干细胞和子代干细胞）。3，具有很强的分裂增殖能力。4，对损伤和疾病具有反应能力。5，免疫特性：表达成神经上皮细胞标记 Nestin,Notch1,EGFR,FGFR(不表达NSE,GFA
5、P,NF)6，神经干细胞通过两种方式生长,一种是对称分裂,形成两个相同的神经干细胞;另一种是非对称分裂,由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀的分配,使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端而成为功能专一的分化细胞,另一个子细胞则保持亲代的特征,仍作为神经干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。神经干细胞与其它类型干细胞的关系神经干细胞与其它类型干细胞的关系 干细胞基本上可分为干细胞基本上可分为 3 3种类型种类型 第一类是全能干细胞第一类是全能干细胞 第二类是多能干细胞第二类是多能干细胞 第三类是单能干细胞第三类是单能干细胞 骨髓干细胞可转变为脑细胞 美国国家神经疾病与中风研
6、究院的一组专家，在病理解剖一些女性死者时发现了上述现象。这些女性死者生前都接受过骨髓移植。被移植的骨髓都来自男性捐献者。科学家们在这些女性死者的大脑细胞中发现了Y染色体。Y染色体只存在于男性身上的细胞。科学家们因此判断这些带有Y染色体的细胞来自移植过来的骨髓干细胞 神经干细胞的分布神经干细胞的分布 在胚胎发育过程中，神经干细胞在神经管壁增殖，新生的细胞沿放射状纤维迁移至特定位置。此外，正如前面提到的在大脑的隔区、大脑皮质等都培养出了神经干细胞。在成年的脑组织中，分离脑内各区域细胞并进行体外培养，证实成年脑内神经干细胞分布广泛，室管膜、脑室下区、纹状体、海马齿状回、嗅球、脊髓等处。（分离不同脑区
7、的细胞，体外进行培养）获取神经干细胞的方法 获取神经干细胞的方法有四种：1，取胚胎、新生动物和成年动物的富于神经干细胞的脑组织在体外进行培养。2，用反转录病毒导入原癌基因，如v-myc和SV40大T抗原等，部分细胞因此获得持续分裂的能力 3，通过诱导胚胎干细胞，使其分化成神经干细胞，当受到外界因素刺激或拆去生长因子时，细胞即开始分化成各种成熟的神经细胞和胶质细胞。4，非神经系统的干细胞向神经干细胞分化诱导神经干细胞的分化机制神经干细胞的分化机制 神经干细胞的分化受基因调控神经干细胞的分化受基因调控 Pevny等将神经元特异性的So2基因转染胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可获得90%以上的神经细胞
8、。Giebel等表达Nurrl基因对于中脑神经前体细胞分化为多巴胺能神经元起决定作用。这些研究表明基因调控与神经干细胞的定向分化密切相关。细胞因子与神经干细胞的增殖、分化密切相关细胞因子与神经干细胞的增殖、分化密切相关（一）、成纤维细胞生长因子（一）、成纤维细胞生长因子(FGF)FGF)对神经干细胞增殖分化的影响对神经干细胞增殖分化的影响 FGF家族包括至少15个成员。FGFs主要通过四种成纤维细胞生长因子受体(FGFR14)传导信号。FGF1和FGF2目前研究比较多。FGFs和FGFR14在胚胎期和成年中枢和外周神经系统中的表达随着时间和区域变化而有所不同，表明它们所起的作用不同。体内实验表
9、明FGF2在调节神经前体细胞增殖方面起着重要作用。幼鼠皮下注射FGF2能刺激海马和小脑的颗粒细胞层内的神经生发区域神经干细胞增殖。若注入FGF2的中和抗体，则可使神经生发区域的DNA合成降低50%。将FGF2注入成年鼠的侧脑室内可引起脑室下区前体细胞增殖，数量增加，以及从室下区迁移至嗅球的神经元数量增加。体外实验证实体外实验证实FGFFGF2 2具有有丝分裂原的具有有丝分裂原的作用，可促进细胞的增殖；同时可抑制前作用，可促进细胞的增殖；同时可抑制前体细胞的分化；这种刺激增殖和抑制分化体细胞的分化；这种刺激增殖和抑制分化作用与作用与FGFFGF2 2的浓度有关。的浓度有关。在培养过程中，当FGF
10、2减少时，神经干细胞即分化成神经元、胶质细胞和少突胶质细胞。当FGF2的浓度为0.1ng/ml时，皮质神经前体细胞增殖并形成神经元克隆。而FGF2的浓度为1ng10ng/ml时，皮质神经前体细胞可分化成神经元和少突胶质细胞，如加入其他因子，可分化成星形胶质细胞。产生以上结果的原因：产生以上结果的原因：FGF2与不同的受体亲和力不同，引起的信号传导通路不同。FGF浓度决定它与不同受体的亲和力。0.1ng/ml FGF2可激活FGFR1和FGFR2，但对FGFR3无任何作用。1ng10ng/ml FGF2可激活FGFR3，推测低浓度FGF2启动分裂信号，而高浓度启动分裂和分化信号。FGF FGF和
11、其他生长因子的协同作用：和其他生长因子的协同作用：1，在胰岛素样生长因子（IGF）和血小板衍生的生长因子(PDGF)存在下，FGF2对能分化成少突胶质细胞和2型星形胶质细胞的双潜能 0-2A胶质前体细胞具有促进增殖的作用.2,加入脑源性神经营养因子（BDNF）、胰岛素样生长因子1（IGF1）、神经营养素3（NT3）主要促使其向神经元方向分化。3,FGF1也可以使神经干细胞向神经元方向分化。诱导神经干细胞向神经元方向分化时，抑制Notch信号途径（维持干细胞状态的信号），并同时激活FGF1介导的信号通路。4，星形胶质细胞的分化依赖于白细胞抑制因子受体（LIFR）信号传导。如抑制LIFR信号传导，
12、则向神经元方向分化。提示信号传导可抑制神经干细胞向神经元方向分化。活化的LIFR通过JAK-STAT途径直接启动GFAP基因的表达。已有研究证实，STAT3能直接连接到GFAP基因启动子的保守位点并调节其表达。（二）表皮生长因子（二）表皮生长因子（EGFEGF）对神对神经干细胞的影响经干细胞的影响 表皮生长因子通过其受体起作用。与FGF比较：EGF在发育较晚期起作用，因为在E15天才能检测到EGFRmRNA;EGF的作用范围也较窄，因为EGFR的分布不如FGFR分布广泛；EGF在前体细胞增殖和分化中起作用，也可能对细胞生存和迁移起作用，但往往对胶质前体细胞有促增殖作用（而FGF2对分化成神经元
13、、胶质细胞的神经干细胞有促增殖作用）也有另外一种观点：将脑组织消化后，在有EGF存在的情况下，一些分裂细胞形成球状团快，然后对这种球状团快进行免疫细胞化学检测，发现这种小球的细胞能生成神经系统的三种细胞，即神经元、星形胶质和少突胶质细胞。如果将这些细胞分离后用FGF2刺激，发现其对两种不同细胞有刺激在一定范围内增殖的作用：一种是单潜能的神经先祖细胞（一个细胞只分裂成317个神经细胞），另一种则是双潜能的先祖细胞，能形成有限数量的神经元和星形胶质细胞。无血清培养液中悬浮的克隆，体外培养第7d克隆细胞呈Nestin阳性(FITC免疫荧光)，信号转导在神经干细胞分化中十分重要信号转导在神经干细胞分化
14、中十分重要 Notch信号传导系统 Janus激酶信号转导 转录激活剂(JAK-STAT)信号传导系统 神经干细胞在神经疾病治神经干细胞在神经疾病治疗中的一些应用疗中的一些应用 在成功分离和培养了神经干细胞之后，人们很自然地想到利用它治疗神经系统疾病。归纳起来有以下几方面：1、利用神经干细胞直接进行移植治疗（干细胞体外扩增），神经干细胞脑中能根据其周围环境的诱导而分裂，分化成相应的细胞类型，其形态和功能与附近的宿主细胞非常类似。加之，中枢神经系统具备特殊的结构血脑屏障，使得淋巴细胞很难进入，因而不同个体之间，甚至是不同种物之间的神经干细胞，都几乎没有排斥反应，大大拓宽了神经干细胞的应用。2，神
15、经干细胞在体外定向诱导分化，然后再移植到神经系统内。3，神经干细胞的在体诱导分化。由于正常成年个体环绕侧脑室的室管膜下层、纹状体等地方仍存在神经干细胞，这些干细胞在正常情况下处于静息状态，如能将其在体内诱导分化以替代神经细胞或胶质细胞。Craig将EGF连续六天注入成年鼠的侧脑室中，发现被标记的室管膜下细胞增加了17倍，并从侧脑室壁转移至邻近的皮层、纹状体和透明隔，七周后发现一部分细胞分化成新的神经元、星形细胞和少枝胶质细胞。由引可见，通过诱导神经系统中的原位神经干细胞增殖、迁移和分化也可达到修复受损神经元的目的。4，神经干细胞可以在体外根据不同的需要导入相应的外源性基因，成为一种广谱的细胞载
16、体。由于神经干细胞在植入后，会在周围环境的诱导下分化成熟，所以要使其处于不断分裂中，必须将神经干细胞进行永生化。所谓永生化就是将细胞总是处于连续的细胞周期内而中止其分化发育进程。永生化后，在导入外源性基因，让其能稳定的表达。使细胞永生化的方法很多，但最常用的方法是导入外源性的癌基因，如V-myc,neu,p53,腺病毒E1A和SV40的大T抗原（T-ag），其中以myc和大T抗原基因为最常见。以下是来自哺乳动物CNS的永生化细胞系(神经干细胞系）细胞系细胞系 动物动物 部位部位 永生化基因永生化基因 分化潜能分化潜能Hib5 rat E16hippocapus tsA58/U19T-ag mu
17、tipotentST14A,ST-86 rat E14stratum tsA58/U19T-ag mutipotentST-79-13A RN33B rat E13medullary raphe tsA58T-ag neuronesRN46A rat E13medullary raphe tsA58T-ag neurones C17-2,C27-3 mouse PN cere3bellar EGL v-myc mutipotentCSM14.1.4 rat E14 ventral tsA58T-ag?mesencephalon 用永生化的细胞系作为脑内植入和基因转移有很多优点：（1）它们能自我
18、更新并能在培养中增殖；（2）易于表达外源性基因；（3）可被分离成单一的克隆；（4）到了体内不易改变其类似干细胞的特点；（5）可人为控制外源基因的表达；据报道，在培养基中加入四环素后使得V-myc蛋白减少并导致细胞停止增殖，并出现神经元的分化。神经干细胞用于中枢神经疾病治疗举例神经干细胞用于中枢神经疾病治疗举例：帕金森氏病 帕金森氏病的发病率在神经系统退行性疾病中位居第而，主要是因为多巴胺能神经元的退化、死亡，导致多巴胺的水平下降所致。临床主要表现震颤麻痹。A normally pigmented substantia nigra is seen grossly in the midbrain
19、on the right,but the midbrain on the left from the patient with Parkinsons disease shows a pale substantia nigra.A normally pigmented substantia nigra is seen on the left,but the patient with Parkinsons disease has decreased neurons and pigment as seen microscopically at the right.治疗该疾病有两种思路，提出两种治疗方
20、案。1，表达外源基因的途径 导入酪氨酸羟化酶的外源性基因。因为酪氨酸羟化酶是多巴胺合成过程中的限速酶（为了保证其在体内不至于过高表达，将酪胺酸羟化酶基因置于一个四环素的基因负调控系统中，停用四环素后，酪胺酸羟化酶表达可恢复，使症状得到缓解）。2，利用神经干细胞的多相分化潜能，在体外诱导分化成具有多巴胺能表型的神经元，再进行体内移植。黑朦病(Tay-Sachs disease,TSD)该疾病缺乏-氨基己糖酶A(HexA)的亚单位，使神经节苷脂GM2无法转变成GM3，GM2在脑中的积累就导致神经元退变。These enlarged,pale neurons are in a baby with T
21、ay-Sachs disease,which is seen mostly in persons of European Jewish heritage.The disease is often first noticed at an age of 6 months,because the baby is not progressing developmentally.对这种疾病的治疗，可以用C17-2和C27-3这两个细胞系来表达人的-氨基己糖酶A(HexA)的亚单位。这无论在体内还是在体外都有效果；其中植入正常胚胎或新生小鼠脑后，此酶至少能表达38周并增加酶的活性14%76%。粘多糖病型(
22、MPS,Sly症）粘多糖病型是由遗传缺乏-葡萄糖苷酸酶（GUSB)基因所致，造成神经元和胶质细胞的变性。通过逆转录病毒可将人的GUSB基因转入C17-2细胞系内，把细胞植入新生模型动物的脑室系统后，这些细胞可以散布到CNS的广泛部位，达到治疗疾病的目的。多发性硬化（MS)多发性硬化也是一种较为高发的神经系统疾病。主要是少突胶质细胞被破坏或失去功能，导致轴突脱髓鞘，引起神经功能紊乱。其治疗有两种不同的方法（1）将神经干细胞直接移植到病变的小鼠模型中；（2）把神经干细胞在体外进行分化诱导。然后再移植到病变的模型中（O-2A干细胞）。导入神经营养因子基因 这些神经营养因子如：NGF,BDGF,PDG
23、F,CNTF,NT-3,NT-4/5,IGF等等，对神经元或神经胶质细胞有营养作用。用于脑出血、脑脊髓损伤、脑肿瘤基因治疗等等的治疗转导报告基因(LacZ基因)将神经干细胞在体外用于报告基因的转导实验，使用的逆转录病毒载体是BAG病毒，这种病毒含有大肠杆菌LacZ基因(半乳糖苷酶基因)，此基因可整和到增殖细胞的DNA中，并且能够遗传至子细胞。通过免疫组化法可将LacZ基因定位。因此，使用LacZ基因可以跟踪移植后的干细胞及其子细胞，并且LacZ基因移植后的稳定表达证实干细胞作为外源基因载体的可行性。目前研究的几个方向：目前研究的几个方向：1，神经干细胞在脑内起源、分布的研究及神经干 细胞的分离、纯化和扩增的条件。2，神经干细胞定向诱导分化及迁移的机制3，生长因子和神经营养因子对神经干细胞的影响4，在体诱导神经干细胞的定向分化5，神经干细胞在治疗中的应用6，人类的神经干细胞是否也向其它胚层的细胞转 化。谢谢！
