1、通过本章的学习，要求掌握：通过本章的学习，要求掌握：1、细菌基因重组的原理和方法。、细菌基因重组的原理和方法。2、基因工程的基本原理、基因工程的基本原理重点：重点：细菌的基因重组细菌的基因重组微生物是遗传学研究中的明星微生物是遗传学研究中的明星 微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。方便建立纯系。很多常见微生物都易于人工培养，快速、大很多常见微生物都易于人工培养，快速、大 量生长繁殖。量生长繁殖。物种和代谢类型多样物种和代谢类型多样 对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。操作性强。第
2、一节第一节 生物遗传信息的载体生物遗传信息的载体1928年，年，F.Griffith；1944年年O.T.Avery 肺炎链球菌肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）转化试验转化试验。1952年，年，A.D.Hershy、M.Chase的的噬菌体感染实验噬菌体感染实验。1956年，年，H.Fraenkel-Conrat的的TMV拆开和重建实验拆开和重建实验。1 1、经典转化实验、经典转化实验1928年，年，F.Griffth肺炎链球菌：肺炎链球菌：S S型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）型（菌体具荚膜，菌落表面光滑，有致病能力）R R型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙
3、，无致病能力）型（菌体无荚膜，菌落表面粗糙，无致病能力）加加S菌菌DNA加加S菌菌DNA及及DNA酶以外的酶酶以外的酶加加S菌的菌的DNA和和DNA酶酶加加S菌的菌的RNA加加S菌的蛋白质菌的蛋白质加加S菌的荚膜多糖菌的荚膜多糖活活R菌菌长出长出S菌菌只有只有R菌菌1944年年Avery、MacLeod和和McCarty从热死从热死S型型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在在离体条件离体条件下进行了转化试验：下进行了转化试验：只有只有S型细菌的型细菌的DNA才能将才能将S.pneumoniae的的R型转化为型转化为S型。且型。且
4、DNA纯度越高，转化效率也越高。说明纯度越高，转化效率也越高。说明S型菌株转型菌株转移给移给R型菌株的，是遗传因子型菌株的，是遗传因子DNA。2 2、噬菌体感染实验、噬菌体感染实验19521952年，年，A.D.Hershy、M.Chase3 3、植物、植物TMV重组实验重组实验证明证明RNA是是TMV的遗传物质的遗传物质原核生物原核生物染色体染色体真核生物真核生物染色体外染色体外遗传成分遗传成分质粒质粒细胞器细胞器转座因子转座因子插入序列（插入序列（IS）转座子（转座子（Tn）某些病毒（某些病毒（Mu噬菌体）噬菌体）转座因子：转座因子：细胞中能改变自身位置细胞中能改变自身位置（例如从染色体或
5、质粒转移（例如从染色体或质粒转移到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）到另一个位点，或者在两个复制子之间转移）的一段的一段DNADNA序列。序列。也称跳跃基因或可移动基因。也称跳跃基因或可移动基因。一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为一切具有自主复制能力的遗传功能单位都称为基因。基因。它它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的DNADNA片段。片段。结构基因：结构基因：是为细胞结构、组成是为细胞结构、组成(如细胞生化反应所需的酶如细胞生化反应所需的酶)及及 完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。完成细胞功能所需的蛋白质等进行编码的基因。调节基因：调节
6、基因：用于编码调节蛋白的基因。用于编码调节蛋白的基因。操纵基因：操纵基因：是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，是位于启动基因和结构基因之间的一段碱基顺序，能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转能与调节蛋白相结合，以此来决定结构基因的转 录是否能进行。录是否能进行。重复基因：重复基因：DNADNA片段重复片段重复跳跃基因：跳跃基因：可在可在DNADNA上转移位置的基因（上转移位置的基因（ISIS因子、因子、TnTn因子）因子）第二节第二节 细菌的基因重组细菌的基因重组基因重组基因重组gene recombinationgene recombination 两个不同来源的遗传物质进行交
7、换，经过基因的重新组两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的合，形成新的基因型的过程。重组获得的后代具有新的基因组合，表现出不同于亲本的新性状。基因组合，表现出不同于亲本的新性状。原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过原核微生物没有有性生殖，其基因重组通过转化、接转化、接合、转导合、转导方式进行。方式进行。转化：转化：指外源指外源DNADNA（人工合成的或者从供体细胞中提取的）（人工合成的或者从供体细胞中提取的）不不经任何媒介被直接吸收经任何媒介被直接吸收到受体细胞的过程。这些被转化的游离到受体细胞的过程。这些被转化的游离的的DNADNA
8、片段称为片段称为转化因子转化因子 。转化后的受体菌，称为转化后的受体菌，称为转化子转化子。供体菌供体菌受体菌受体菌DNA片段片段转化需要的条件：转化需要的条件：1 1、感受态细胞：、感受态细胞：受体菌最容易接受外源受体菌最容易接受外源DNADNA片段并片段并实现转化的生理状态称为感受态实现转化的生理状态称为感受态 2 2、外源游离、外源游离DNADNA分子分子转化转化过程过程转化的特点：转化的特点：不需两个细不需两个细胞直接接触，供胞直接接触，供体体DNADNA提取出来，提取出来，注入受体即可。注入受体即可。噬菌体噬菌体DNADNA被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒被感受态细胞摄取并产生有
9、活性的病毒颗粒转染转染(transfection)：转染的特点：转染的特点：提纯的噬菌体提纯的噬菌体DNADNA以转化的（而非感染）途径进以转化的（而非感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。人工转化：人工转化：在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，不是由细菌自身的基因所控制不是由细菌自身的基因所控制，是基因工程的奠基石是基因工程的奠基石和基础技术。和基础技术。用用CaCl2处理细胞，处理细胞，电穿孔电穿孔等是常用的人工转化手段。等是常用的人工转化手段。转导：转导：是指通过噬菌体介导的是指
10、通过噬菌体介导的DNADNA在不同细菌细胞间转移和基在不同细菌细胞间转移和基因重组的现象。因重组的现象。细菌转导的类型：细菌转导的类型：普遍转导普遍转导局限转导局限转导完全转导完全转导流产转导流产转导低频转导低频转导高频转导高频转导转导噬菌体：转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒能将细菌宿主的部分染色体和质粒DNADNA带到另一个细带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌菌的噬菌体。获得了由噬菌体携带来的供体菌DNADNA片段的受体细胞片段的受体细胞称为称为转导子转导子。在转导中被转移的染色体片段称为。在转导中被转移的染色体片段称为转导因子转导因子。普遍转导普遍转导（gene
11、ralized transduction）通过极少数通过极少数完全缺陷噬菌体完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。将其遗传性状传递给受体菌的现象。普遍性转导的三种后果：普遍性转导的三种后果：外源外源DNADNA被降解，转导失败。被降解，转导失败。进入受体的外源进入受体的外源DNADNA通过通过与细胞染色体的重组交换与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子而形成稳定的转导子流产转导流产转导完全转导完全转导转导转导DNADNA不能进行整合、重组和复制，也不迅速消失，而是表不能进行整合、重组和复制，也不迅速消失
12、，而是表现稳定的转录、转译和性状表达现稳定的转录、转译和性状表达。因此群体中仅一个细胞含有。因此群体中仅一个细胞含有DNADNA，而其它细胞只能得到其基因产物。，而其它细胞只能得到其基因产物。流产转导：流产转导：局限转导局限转导（generalized transduction）指通过部分指通过部分缺陷的温和噬菌体缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特有基因携带到受体菌中，并把供体菌的少数特有基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。低频转导：低频转导：指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，因其只能形成指通过一般溶源菌释放的噬菌
13、体所进行的转导，因其只能形成极少数的转导子而得名。极少数的转导子而得名。高频转导：高频转导：在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含在局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含50%左左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，就可右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，就可获得高达获得高达50%左右的转导子。左右的转导子。低频转导低频转导裂解物裂解物正常噬菌体正常噬菌体极少量的极少量的部分缺陷噬菌体部分缺陷噬菌体（局限转导噬菌体（局限转导噬菌体）转导颗粒转导颗粒高感染复数高感染复数双重溶源菌双重溶源菌缺陷噬菌缺陷噬菌体和正常体和正常噬菌体
14、同噬菌体同步复制步复制高频转导高频转导裂解物裂解物部分缺陷噬菌部分缺陷噬菌（局限转导噬菌体（局限转导噬菌体）正常噬菌体正常噬菌体等等量量转导转导颗粒颗粒局限转导子局限转导子（大量）（大量）接合：接合：是指通过两种细菌细胞的直接接触而将是指通过两种细菌细胞的直接接触而将DNADNA从一种细菌从一种细菌转移到另一种细菌转移到另一种细菌,并使后者获得新遗传性状的现象。并使后者获得新遗传性状的现象。1946年，年，Joshua Lederberg 和和Edward L.TatumE.coli k12的多重营养缺陷型的多重营养缺陷型杂交实验杂交实验中间平板上长出的原养型菌落中间平板上长出的原养型菌落是两
15、菌株之间发生了遗传交换是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致。和重组所致。接合机制接合机制(大肠杆菌的接合机制大肠杆菌的接合机制)接合作用是由一种被称为接合作用是由一种被称为F因子因子的质粒介导。的质粒介导。F因子的分子量因子的分子量通常为通常为5107，上面有编码细菌产生，上面有编码细菌产生性菌毛及控制接合过程性菌毛及控制接合过程进进行的行的20多个基因。多个基因。F因子特点：因子特点：1）可经接合作用而获可经接合作用而获得；得；2）可通过一些理化因可通过一些理化因素的处理，而从细胞素的处理，而从细胞中消失；中消失；3）在大肠杆菌中，）在大肠杆菌中，F因子的因子的DNA含量约占含量约占总染色体
16、含量的总染色体含量的2%。F F因子的四种细胞形式：因子的四种细胞形式：a）F-菌株菌株(“雌性雌性”菌株菌株)，不含，不含F因因子，没有性菌毛，但可以通过接合子，没有性菌毛，但可以通过接合作用接收作用接收F因子而变成因子而变成F+菌株菌株；b）F+菌株菌株(“雄性雄性”菌株菌株)，F因子独因子独立存在，细胞表面有性菌毛。立存在，细胞表面有性菌毛。c c）HfrHfr菌株菌株，F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上上，细胞表面有性菌毛。，细胞表面有性菌毛。d d）FF菌株菌株，Hfr菌株内的菌株内的F因子因因子因不正常切割而脱离染色体时，形成不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但
17、携带一小段染色体基因的游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为因子，特称为F因因 子。子。细胞表面同细胞表面同样有性菌毛。样有性菌毛。FF菌株菌株 当当HfrHfr菌株内的菌株内的F F因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可因子因不正常切割而脱离其染色体组时，可形成游离的携带一小段染色体基因的形成游离的携带一小段染色体基因的F F因子，特称因子，特称FF因子因子。携带有携带有FF因子的菌株，其性状介于因子的菌株，其性状介于F+F+与与HfrHfr之间，这就是初之间，这就是初生生FF菌株。初生菌株。初生FF菌株与菌株与F-F-菌株接合，可使后者转变成菌株接合，可使后者转变成FF菌株，这就是次
18、生菌株，这就是次生FF菌株，它既获得了菌株，它既获得了F F因子，又获得了来因子，又获得了来自初生自初生FF菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌菌株的若干遗传性状。以这种接合来传递供体菌基因的方式，称为基因的方式，称为F F因子转导因子转导(F-duction(F-duction)、性导、性导(sexduction(sexduction)。在次生的在次生的FF群体中，大约有群体中，大约有10%10%的的FF因子重新整合到染色因子重新整合到染色体组上，而恢复成体组上，而恢复成HfrHfr菌。菌。将遗传性状不同的两种菌的（包括种间、种内、及属间）将遗传性状不同的两种菌的（包括种间、种内、及属
19、间）原生质体原生质体融合成为一个新的重组子的技术。融合成为一个新的重组子的技术。原生质体融合步骤：原生质体融合步骤：1、原生质体制备、原生质体制备2、原生质体融合和再生、原生质体融合和再生3、融合子的选择、融合子的选择第三节第三节 重组重组DNA技术技术基因工程：基因工程：在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合在基因水平上，改造遗传物质，即将分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。克隆载体克隆载体（
20、cloning vector）：负责将外源负责将外源DNA片段运送到细片段运送到细胞中进行复制与扩增。胞中进行复制与扩增。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）：）：是指能是指能识别双链识别双链DNADNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNADNA的的一类核酸内切酶。一类核酸内切酶。一、基因工程一、基因工程微生物在基因工程中的作用：微生物在基因工程中的作用：1.1.微生物作为克隆载体微生物作为克隆载体:质粒、病毒、噬菌体质粒、病毒、噬菌体 2.2.微生物生产基因工程工具酶；微生物生产基因工程工具酶；
21、1)1)、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶 2)2)、DNADNA连接酶连接酶 3.3.微生物作为克隆载体的宿主微生物作为克隆载体的宿主 ；1)1)、原核生物宿主：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌、原核生物宿主：大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 2)2)、真核生物宿主：酿酒酵母、真核生物宿主：酿酒酵母 4.4.微生物作为基因产物的重要表达载体。微生物作为基因产物的重要表达载体。5.5.理论基础（主要来自对微生物的研究）；理论基础（主要来自对微生物的研究）；6.6.微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。微生物的多样性提供了丰富而独特的基因资源。获得目的基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外
22、源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定筛选和鉴定应用应用基因工程的基本操作基因工程的基本操作结核分枝杆菌结核分枝杆菌H37RV基因组基因组pncAPCR扩增扩增Nde I和和Xho I双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接连接酶连接基因克隆：基因克隆：指利用指利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或者体外重组技术，将一个特定的基因或者DNA序列序列插入到一个载体插入到一个载体DNA分子上，然后引入适当的寄主进行扩增。分子上，然后引入适当的寄主进行扩增。AmpAmppncAXho INde IOriOriMCS载体载体大肠杆菌大肠杆菌感受态细胞感受
23、态细胞AmpCaCl2 或者甘油或者甘油钙转化或者电转化钙转化或者电转化转化子转化子含含氨苄青霉素氨苄青霉素的的LBLB培养基培养基克隆子克隆子二、基因突变二、基因突变基因突变：基因突变：一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNADNA序列的任何可遗传的序列的任何可遗传的改变。改变。基因基因突变突变狭义：狭义：点突变（点突变（一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换）野生型（原始性状）野生型（原始性状）基因突变基因突变突变型（新性状）突变型（新性状）广义：广义：基因突变和染色体畸变（基因突变和染色体畸变（大片段染色体的缺失、重大片段染色体的缺失、重 复
24、、倒位）复、倒位）诱变育种：诱变育种：指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随指利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。机突变频率，通过一定的筛选方法获得所需要的高产优质菌株。（1）使用简便有效的诱变剂）使用简便有效的诱变剂（2）选用优良的出发菌株）选用优良的出发菌株（3）处理单细胞或单孢子悬浮液）处理单细胞或单孢子悬浮液诱变剂诱变剂物理因素：紫外线、激光、离子束、物理因素：紫外线、激光、离子束、X射线、射线、r射线等射线等化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物化学因素：烷化剂、碱基类似物、吖啶化合物微生物诱变育种微生物诱变育种（
25、4）使用最佳的处理剂量）使用最佳的处理剂量（5）设计高效率筛选方案）设计高效率筛选方案诱变诱变检出营养缺陷型检出营养缺陷型淘汰野生型淘汰野生型鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷型富集培养富集培养（抗生素法）（抗生素法）影印平板法影印平板法生长谱法生长谱法突变株的筛选：产量突变株的筛选突变株的筛选：产量突变株的筛选 抗药性突变株的筛选抗药性突变株的筛选 营养缺陷型突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选微生物定微生物定位诱变位诱变采用合成采用合成DNADNA技术和重组技术和重组DNADNA技术可能技术可能在基因的精确位点上引入诱变在基因的精确位点上引入诱变ACBDPCR1PCR2abcdMelting and annealextensionADPCR3Mutation molecular1、突变基因、突变基因的获得的获得Nde I和和Xho I双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接连接酶连接AmpXho INde IAmpOriMCSOriAmpXho INde IOri自杀质粒载体自杀质粒载体2、自杀质粒载体的构建、自杀质粒载体的构建野生型菌野生型菌感受态细胞感受态细胞甘油甘油基因组基因组DNADNA转化子转化子突变株突变株AmpXho INde I基因组基因组DNADNA（突变）（突变）电转电转3、突变菌株的获得、突变菌株的获得Thanks for your attention!
