1、Chapter 6 Microbial Genetics and mutations微生物的遗传与变异微生物的遗传与变异基本概念：基本概念：Genotype 基因型：基因型：指某一个生物个体所含有的全部指某一个生物个体所含有的全部遗传因子（即基因组遗传因子（即基因组genome）所携带的遗传信息。）所携带的遗传信息。Phenotype 表表 型型:：指某一生物体所具有的一切外表指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。下通过代谢和发育而得到的具体体现。Variation 变变 异：异
2、：指生物体在某种外因或内因的作用指生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变。下所引起的遗传物质结构或数量的改变。Modification 饰饰 变：变：指一种不涉及遗传物质结构改变指一种不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。而只发生在转录、转译水平上的表型变化。微生物是遗传学研究的最好材料和对象微生物是遗传学研究的最好材料和对象微生物结构简单微生物结构简单营养体一般都是单倍体营养体一般都是单倍体微生物繁殖速度快微生物繁殖速度快易积累不同的中间及最终代谢产物易积累不同的中间及最终代谢产物环境条件对微生物作用直接均匀环境条件对微生物作用直接均匀 存在多种
3、方式的繁殖类型存在多种方式的繁殖类型 微生物的变异易被识别微生物的变异易被识别参与基因工程的载体供体受体三角色参与基因工程的载体供体受体三角色内容提要内容提要 遗传的物质基础 基因突变和诱变育种 基因重组和杂交育种 基因工程 菌种的衰退复壮和保藏第一节第一节 遗传的物质基础遗传的物质基础 三个经典实验证明核三个经典实验证明核酸是微生物遗传物质酸是微生物遗传物质转化实验转化实验 噬菌体感染实验噬菌体感染实验植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式转化实验转化实验材料材料方法方法动物实验动物实验细菌培养实验细菌培养实验S型菌无
4、细胞抽提液试验型菌无细胞抽提液试验转化实验（1）动物实验转化实验（转化实验（2 2）细菌培养实验）细菌培养实验杀死杀死 无菌落生长无菌落生长 体外培养体外培养 活菌活菌 体外培养体外培养 菌落菌落 菌落多菌落多菌落少菌落少 体外混合培养体外混合培养杀死杀死 活菌活菌 转化实验（3）S型菌无细胞抽提液试验活R菌S菌无细胞抽提液+大量R菌落+少量的S菌落活R菌+S菌DNAS菌落S菌PrS菌多糖R菌落活R菌+噬菌体感染实验Pr 只含S不含PDNA只含P不含S1、原理2、步骤 1：用含同位素35,P32的培养基培养大肠杆菌吸附10分钟后搅动离心上清液沉 淀4、结果：上清液中含15%放射击性；沉淀中含8
5、5%放射性2：让T2感染上述大肠杆菌使其打上S35P32标记3、吸附10分钟后搅动离心上清液沉 淀结果：上清液中含85%放射击性；沉淀中含15%放射性植物病毒的重建实验植物病毒的重建实验 植物病毒蛋白质和植物病毒蛋白质和RNARNA可以人为地分开可以人为地分开,同时又同时又可把它们重新组合成具感染性的病毒可把它们重新组合成具感染性的病毒.甲乙甲乙r r 感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒感染症状同甲病毒；分离得到甲病毒 乙甲乙甲r r 感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒感染症状同乙病毒；分离得到乙病毒 TMVHRVHRVTMV原始株原始株 拆开拆开 重建重建 感染感染 分离纯化分离纯化 植物病毒的
6、重建实验植物病毒的重建实验 基因是什么基因是什么?基因是生命的密码基因是生命的密码基因记录和传递遗传信息基因记录和传递遗传信息基因决定生物体的生、长、病、老死等基因决定生物体的生、长、病、老死等一切生命现象一切生命现象 染色体染色体基因基因基因基因DNA基因是一段基因是一段DNADNADNA就是脱氧核糖核酸（长链）就是脱氧核糖核酸（长链）腺嘌呤（腺嘌呤（A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）ATCGAAATTTTTTAAAGGGGGCCCCCGC基因测序就是读出基因测序就是读出 A-C-G-T-G-G-A-C-GA-C-G-T-G-G-A-C-G.细菌
7、的结构基因细菌的结构基因遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式（一）遗传物质在（一）遗传物质在7 7个水平上的形式个水平上的形式1 1、细胞水平、细胞水平2 2、细胞核水平、细胞核水平3 3、染色体水平、染色体水平4 4、核酸水平、核酸水平5 5、基因水平、基因水平6 6、密码子水平、密码子水平7 7、核苷酸水平、核苷酸水平1、细胞水平、细胞水平真核微生物：细胞核真核微生物：细胞核原核微生物：核区原核微生物：核区细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的细胞核或核区的数目在不同的微生物中是不同的2、细胞核水平、细胞核水平真核生物真核生物 细胞核细胞核 核染
8、色体核染色体原核生物原核生物 核区核区 DNA链链核基因组核基因组在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质在核基因组之外，还存在各种形式的核外遗传物质3、染色体水平、染色体水平染色体是由组蛋白与染色体是由组蛋白与DNA构成的线状结构构成的线状结构染色体的数目在不同的生染色体的数目在不同的生物中是不同的物中是不同的染色体的倍数在同一生物染色体的倍数在同一生物的不同生活时期是不同的的不同生活时期是不同的4、核酸水平、核酸水平核酸种类：核酸种类：DNA，RNA核酸结构：双链、单链；核酸结构：双链、单链；环状，线状，超螺旋状环状，线状，超螺旋状DNA长度：因种而异长度：因种而异微生物基因组测序工作
9、是在人类基因组计划的促进下开微生物基因组测序工作是在人类基因组计划的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。研究微生物学的最有力的手段。5、基因水平、基因水平6、密码子水平、密码子水平7、核苷酸水平、核苷酸水平核苷酸是最小突变单位和交换单位核苷酸是最小突变单位和交换单位（二）微生物基因组结构的特点（二）微生物基因组结构的特点1 1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组、原核生物（细菌、古生菌）的基因组1）染色体为双链环状的）染色体为双链环状的DNA分子（单倍体）；分子（单倍体）；2）基因组上遗传信息具有连续
10、性；）基因组上遗传信息具有连续性；基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数 一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。3）功能相关的结构基因组成操纵子结构；）功能相关的结构基因组成操纵子结构；4）结构基因的单拷贝及）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝；基因的多拷贝；5）基因组的重复序列少而短；）基因组的重复序列少而短；个别细菌个别细菌(鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌鼠伤寒沙门氏菌和犬螺杆菌)和古生菌的和古生菌的 rRNA和和tRNA中也发现有内含子或间插序列中也发现有内含子或间插序列2 2、真核微生
11、物（啤酒酵母）的基因组、真核微生物（啤酒酵母）的基因组1 1）典型的真核染色体结构；）典型的真核染色体结构；啤酒酵母基因组大小为啤酒酵母基因组大小为13.513.5106bp106bp，分布在分布在1616条染色体中。条染色体中。2 2）没有明显的操纵子结构；）没有明显的操纵子结构；3 3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；）有间隔区（即非编码区）和内含子序列；4 4）重复序列多。）重复序列多。Plasmid 质粒质粒原核生物遗传物质存在的另一种方式原核生物遗传物质存在的另一种方式质粒（质粒（plasmidplasmid）：）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的一种独立于染色体外，能进行自
12、主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。从而使宿主得到生长优势。种类种类 F F因子因子 与有性接合有关与有性接合有关R R因子因子 与抗药性有关与抗药性有关CoLCoL 编码细菌素编码细菌素TiTi质粒质粒 诱癌质粒诱癌质粒降解质粒：编码降解有害物质的酶降解质粒：编码降解有害物质的酶质粒在基因工程中的应用质粒在基因工程中的应用质
13、粒的优点：质粒的优点：（1）体积小，易分离和操作）体积小，易分离和操作（2）环状，稳定）环状，稳定（3）独立复制）独立复制（4）拷贝数多）拷贝数多（5）存在标记位点，易筛选）存在标记位点，易筛选E.coli的的pBR322质粒是一个常用的克隆载体质粒是一个常用的克隆载体（1）致育因子致育因子(Fertility factor，F因子因子)又称又称F质粒，其大小约质粒，其大小约100kb，这是最早发现的一种与大肠杆菌，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象的有性生殖现象（接合作用）（接合作用）有关的质粒。有关的质粒。携带携带F质粒的菌株称为质粒的菌株称为F+菌株菌株（相当于雄性），无（相当于
14、雄性），无F质粒的质粒的菌株称为菌株称为F-菌株（相当于雌菌株（相当于雌性）。性）。F因子能以游离状态因子能以游离状态(F+)和和以与染色体相结合的状态以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以存在于细胞中，所以又称之为附加体又称之为附加体(episome)。（2）抗性因子（抗性因子（Resistance factor，R因子）因子）包括抗药性和抗重金属二大类，简称包括抗药性和抗重金属二大类，简称R质粒。质粒。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。R质粒质粒抗性转移因子（抗性转移因子（RTF）：转移和复制基因：转移和
15、复制基因抗性决定因子抗性决定因子：抗性基因：抗性基因R100质粒质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：汞（汞（mercuric ion，mer）四环素（四环素（tetracycline，tet）链霉素链霉素(Streptomycin,Str)、磺胺磺胺(Sulfonamide,Su)、氯霉素氯霉素(Chlorampenicol,Cm)、夫西地酸（夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。细菌素细菌素抗生素抗生素抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌抑
16、制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌较广的抗菌谱通过核糖体直接合成的多肽类物质通过核糖体直接合成的多肽类物质一般是次级代谢产物编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上于质粒或转座子上一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在染色体上（3）产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）一般都位于质一般都位于质粒或转座子上，粒或转座子上，因此，细菌素因此，细菌素可以杀死同种可以杀死同种但不携带该质但不携带该质粒的菌株。粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：大肠杆
17、菌（大肠杆菌（E.coli）产生的细菌素为）产生的细菌素为colicins（大肠杆（大肠杆菌素），而质粒被称为菌素），而质粒被称为Col质粒。质粒。细菌素结构基因涉及细菌素运输细菌素结构基因涉及细菌素运输及发挥作用的蛋白质的基因赋予及发挥作用的蛋白质的基因赋予宿主对该细菌素具有宿主对该细菌素具有“免疫力免疫力”的相关产物的基因的相关产物的基因（4）毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物
18、）造成伤害。造成伤害。产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。素编码的质粒。苏云金杆菌含有编码苏云金杆菌含有编码内毒素内毒素(伴伴孢晶体中孢晶体中)的质粒的质粒根癌土壤杆菌所含根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子瘿瘤的致病因子Ti质粒质粒中的中的T-DNA可携带任何外源基因整合到植物基可携带任何外源基因整合到植物基因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体因组中，是植物基因工程中有效的克隆载体（5）代谢质粒（代谢质粒
19、（Metabolic plasmid）质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。线菌）等。将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。，环境保护方面具有重要的意义。降解质粒：降解质粒：假单胞菌：假单胞菌：具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物具有降解一些有毒化合物，如芳香簇化合物(苯苯)、农药、农药(2,4dichlorophenoxyacet
20、ic acid)、辛烷和樟脑等的能力。辛烷和樟脑等的能力。（6）隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。才能发现。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。它们存在的生物学意义，目前几乎不了解。在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工在应用上，很多隐秘质粒被加以改造作为基因工程的载体程的载体（一般加上抗性基因）（一般加上抗性基因）第二节第二节 基因突变和诱变育种基因突变和诱变育种一、基因突变一
21、、基因突变 一个基因内部遗传结构或一个基因内部遗传结构或DNADNA序列的任何改变，可遗序列的任何改变，可遗传、自发或诱变产生。传、自发或诱变产生。u 基因突变基因突变u 突变与育种突变与育种 突变类型突变类型 突变率突变率 突变的特点突变的特点 诱变机制诱变机制 条件致死突变型（株）突变类型突变类型 突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型（株）抗性缺陷型（株）形态突变型（株）抗原突变型（株）产量突变型（株）按方法分：按突变株的表型是否能在选择 性培养基上加以鉴别来区分。突变率出发菌株出发菌株 长出突变株长出突变株含诱变剂的培养基含诱变剂的培养基突变的特点（证明）不对应性 自发性 稀
22、有性 独立性诱变性稳定性 可逆性 基因突变的自发性和突变结果与原因不对基因突变的自发性和突变结果与原因不对 应性的证明应性的证明三个经典实验三个经典实验 变量试验（变量试验（Fluctuation testFluctuation test）涂布试验涂布试验（NewcombeNewcombe experiment experiment）平板影印培养试验（平板影印培养试验（Replica platingReplica plating）大肠杆菌稀释培养物大肠杆菌稀释培养物10ml10ml(培养前先分成培养前先分成50小管小管)(在同一个大管中作整体培养在同一个大管中作整体培养)2 3 7 1 4 4
23、 3 5 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数变量试验变量试验 Fluctuation testNewcombe experiment 涂布试验涂布试验 涂布敏感菌涂布敏感菌5104个个共共12个平板个平板5104个菌落个菌落5000个细菌个细菌/菌落菌落喷入喷入T1保温保温重新涂布后重新涂布后 喷入喷入T1保温保温6个平板共个平板共353个菌落个菌落 6个平板共个平板共28个菌落个菌落影印培养无药无药培养基培养基含药含药培养基培养基影印培养试验影印培养试验 原始敏原始敏感菌种感菌种Replica plating诱变机制诱变机制 移码突变移码突变 染色体畸变染色体畸变 碱
24、基的置换碱基的置换 碱基的置换碱基的置换 直接引起置换的诱变剂直接引起置换的诱变剂HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A.THe.THk.THk.CA.THk.CG.CCOH次黄嘌呤(He)间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换碱基的置换 COHT：烯醇式CT：酮式OA.TT.AG.CA.T酮式T.G烯醇式COBr5-BU:酮式COHBr5-BU:烯醇式碱基的置换碱基的置换 间接引起置换的诱变剂间接引起置换的诱变剂碱基的置换碱基的置换 G.CA.BUG.BUA.BUG.CA.TA.TA.TA.TG.CA.BU酮式酮式G.BU烯醇式烯醇式烯醇式烯醇式酮式酮式移码突变移码突变 分
25、子中缺失或增加少数几个碱基对而引起分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABC ABCABCABCABCABCABCABCAB+ABC ABCCBA CBA CBA CBA CBAABC BCA BCA BCABCABCABCABCA增添一个碱基增添一个碱基缺少一个碱基缺少一个碱基染色体畸变染色体畸变 某些理化因子，如射线，紫外线，某些理化因子，如射线，紫外线，亚硝亚硝酸等，除能引起点突变外，还会引起酸等，除能引起点突变外，还会引起DNADNA分分子的损伤，包括染色体易位，倒位，缺失，子的损伤，包括染色体易位
26、，倒位，缺失，重复等，即为染色体畸变。重复等，即为染色体畸变。染色体畸变的机制染色体畸变的机制 紫外线诱变作用机理紫外线诱变作用机理 可使链裂断，破坏核糖和磷酸间的键联引起胞嘧啶和尿嘧啶产生水合作用造成氢键断裂 能使胸腺嘧啶成二聚体，使结构发生改变 紫外线损伤后修复紫外线损伤后修复可移动遗传因子（可移动遗传因子（Transposable elementTransposable element）v 插入序列（Insertion sequence IS）v 转座子（Transposon Tn）v Mu噬菌体（Mutator phage)插入序列（插入序列（ISIS）和）和 转座子（转座子（TnTn
27、）自发突变（自发突变（spontaneous mutationspontaneous mutation）及其原因）及其原因 DNADNA复制复制 微生物自身产生诱变物质微生物自身产生诱变物质 环境对微生物的诱变作用环境对微生物的诱变作用突变热点：突变热点：指同一基因内部突变频率特别高的指同一基因内部突变频率特别高的位点。位点。定向育种：定向育种：在一特定条件下，在一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良自发突变，并最终获得优良菌株的过程。菌株的过程。（induced mutationinduced m
28、utation）物理因素物理因素q紫外线（紫外线（ultraviolet lightultraviolet light）qX X射线和射线和射线射线 化学因素化学因素q碱基结构类似物碱基结构类似物q与核酸上碱基起化学反应的诱变剂与核酸上碱基起化学反应的诱变剂q移码诱变剂移码诱变剂诱变育种（诱变育种（breeding by induced mutationbreeding by induced mutation）指通过人工方法处理均匀而分散的微生物指通过人工方法处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从
29、中挑选采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的突变株的过程。出少数符合目的突变株的过程。在此过程中，在此过程中，诱变诱变和和筛选筛选是两个主要环节。是两个主要环节。诱变育种的基本环节诱变育种的基本环节大多死亡少数存活存活率多数未变少数突变突变率多数负变少数正变正变率多数幅度小少数幅度大高产率投产率多数不宜投产少数适宜投产出发菌株计算出诱变 选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂挑选优良的出发菌株挑选优良的出发菌株处理单细胞或单孢子悬液处理单细胞或单孢子悬液选用最适的诱变剂量选用最适的诱变剂量充分利用复合处理的协同效应充分利用复合处理的协同效应利用和创造形态、生理与产量间的相关指
30、标利用和创造形态、生理与产量间的相关指标设计高效筛选方案设计高效筛选方案创造新型筛选方法创造新型筛选方法突变株的筛选方法 高产突变菌株的筛选方法 抗性突变体的筛选方法 营养缺陷型的的筛选方法 与突变株的筛选相关的几个概念与突变株的筛选相关的几个概念相关培养基基本培养基 -完全培养基补充培养基三类遗传型野生型 A+B+营养缺陷型型A+B-原养型 A+B+基本培养基：基本培养基：仅能满足某微生物的野仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基。培养基。完全培养基：完全培养基：凡可满足一切营养缺陷凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养型菌株
31、营养需要的天然或半组合培养基。基。补充培养基：补充培养基：凡只能满足相应的营养凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。合培养基。突变突变春日霉素产生春日霉素产生菌的孢子悬液菌的孢子悬液高产突变株的筛选高产突变株的筛选 琼脂块培养法筛选琼脂块培养法筛选 春日霉素高产菌种春日霉素高产菌种含供试菌种（拮抗对象）的琼脂平板 抗性突变体的筛选方法青霉素浓缩法青霉素浓缩法梯度培养皿法梯度培养皿法青霉素筛选法培养基培养基(含青霉素含青霉素)接入敏感菌液接入敏感菌液 （含抗性突变株）（含抗性突变株）涂布涂布抗青霉素菌落抗青霉素菌落培养培养梯度培养皿法梯度培
32、养皿法强抗性强抗性中抗中抗性性弱抗弱抗性性含异烟肼含异烟肼接敏感菌接敏感菌含突变株含突变株营养缺陷型的筛选办法营养缺陷型的筛选办法诱变剂处理诱变剂处理淘汰野生型淘汰野生型检出缺陷型检出缺陷型夹层培养法限量补充培养法逐渐检出法影印接种法鉴定缺陷型鉴定缺陷型夹层培养法及结果小菌落是第二次长起来的（营养缺陷型）逐个检出法逐个检出法涂布涂布培养培养基本培养基上不长菌落基本培养基上不长菌落完全培养基上长出菌落完全培养基上长出菌落含诱变剂的液体培养基含诱变剂的液体培养基菌种菌种营养缺陷型营养缺陷型影印接种法影印接种法完全培养基完全培养基影印接种基本培养基基本培养基营养缺陷型营养缺陷型限量补充培养法限量补充
33、培养法 微量蛋白质的完全培养基上微量蛋白质的完全培养基上 小菌落是营养缺陷型突变株小菌落是营养缺陷型突变株菌丝 过滤法筛选营养突变株基本培养基 接入微生物孢子 （含营养突变株）涂布均匀后培养长出菌丝体（野生型）菌丝过滤得营养突变株 转化(Transformation)几个概念：转化、转化因子、感受态 转化过程转化的特点 受体细胞直接吸收了来自供体细胞的受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNADNA片断片断，并把它整合到自己的基因组并把它整合到自己的基因组中，细胞部分遗传性状发生变化的现中，细胞部分遗传性状发生变化的现象叫转化。象叫转化。供体菌供体菌DNA片段片段受体菌受体菌转化因子转化因子转化是
34、游离的片断的转移和重组转化是游离的片断的转移和重组游离的片断叫转化因子游离的片断叫转化因子转化因子由供体提供转化因子由供体提供自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，自然情况下可由细菌细胞自行裂解产生，实验室里通过提取获得实验室里通过提取获得双链有转化能力，单链没有双链有转化能力，单链没有受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，受体细胞能接受转化的生理状态称为感受态，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，只有处于感受态的细菌才能接受转化因子，从出现到消失约为分钟从出现到消失约为分钟(对数期的中期对数期的中期)感受态感受态感觉态出现原因感觉态出现原因细菌失去部分细胞壁的结果细菌在细胞表面产生某种引起
35、每个受体细胞表面约有每个受体细胞表面约有3030 -80-80个转化因子个转化因子结合点结合点，当转化因子结合到受体表面结合当转化因子结合到受体表面结合点上时，点上时，DNADNA一条链被受体细胞膜上的核一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过通过整合与受体细胞进行基因重组整合与受体细胞进行基因重组，有人发现有人发现DNADNA也可通过双链形式进入受体细胞形成也可通过双链形式进入受体细胞形成双倍体的转化子。双倍体的转化子。转化过程转化过程细菌的转化细菌的转化转化机制转化机制核酸酶核酸酶DNA结合蛋白结合蛋白感受态特异蛋白感受态特异蛋白细菌的转化
36、细菌的转化用用DNADNA片段的转化片段的转化用质粒的转化用质粒的转化转化过程的特点：转化过程的特点：a a）对核酸酶敏感；）对核酸酶敏感；b b）不需要活的）不需要活的DNADNA供体细胞；供体细胞；c c）转化是否成功及转化效率的高低主要）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化供体菌株和转化受体菌株之取决于转化供体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；间的亲源关系；d d）通常情况下质粒的自然转化效率要低）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多。得多。转导的种类 完全普遍性转导流产普遍性转导局 限 性 转 导溶 源 转 变低频转导高频转导遗传物质通过噬菌体的携带而转移的基因重组遗传物质通过噬
37、菌体的携带而转移的基因重组 转导的发现Transduction Transduction 转导转导转导的特点 完全普遍转导完全普遍转导流产普遍转导流产普遍转导降解降解普遍性转导普遍性转导局局 限限 性性 转转 导导转导的特点转导的特点 需要噬菌体做媒介，不需要细胞间直接接触 噬菌体DNA不接合到寄主染色体 噬菌体蛋白质包裹寄主任何一部分DNA片段噬菌体DNA整合到寄主染色体上 噬菌体DNA与寄主染色体特定基因发生交换 普遍性转导普遍性转导 局限性转导局限性转导溶源转变溶源转变温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象温和噬菌体的基因整合到宿主核基因组上的现象温和噬菌体并不携带外源供体菌的基因这
38、种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是转导子获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失接合及其发现接合及其发现因子和接合因子和接合 接合(Conjugation)雄性菌株与雌性菌株接合结果雄性菌株与雌性菌株接合结果接合及其发现接合及其发现通过细胞间的直接接触能进行大通过细胞间的直接接触能进行大段的转移的过程，叫接合段的转移的过程，叫接合 U U型管实验表明，通过接合发生的遗传型管实验表明，通过接合发生的遗传重组，需要细菌间直接的物理连接。重组，需要细菌间直接的物理连接。雄性菌株 Hfr菌株 F 菌株 菌株 （雌株）因子和接合因子和接合 F+菌株FF+F+F+F+FF
39、F+FHfrHfrF（多数情况下）F+HfrHfrHfr（少数情况下）雄性菌株与雌性菌株接合结果雄性菌株与雌性菌株接合结果细菌接合作用的机制细菌接合作用的机制F FF F-HfrHfrF F-HfrHfr菌株的菌株的F F因子插入到染色体因子插入到染色体DNADNA上，因此上，因此只要发生接只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F F-细胞并发生重组，由此而得名为细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株高频重组菌株。HfrHfr F-杂交杂交Hfr菌株仍然保持着菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有细胞的特征，具有F性菌毛，并性菌
40、毛，并象象F+一样与一样与F-细胞进行接合。细胞进行接合。所不同的是，当所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，口后，F因子的先导区因子的先导区(leading region)结合着染色体结合着染色体DNA向受体细胞转移。向受体细胞转移。F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入因子不易转入受体细胞中。受体细胞中。HfrF-杂交后的受体细胞杂交后的受体细胞(或接合子或接合子)大多数仍然是大多数仍然是F-。F F接合作用
41、接合作用三者根本区别在于三者根本区别在于DNADNA转移的方式不同转移的方式不同 转化：转化：供体供体DNADNA片断片断注入受体细胞，通过细胞膜注入受体细胞，通过细胞膜接合：接合：供体进入受体通过性纤毛供体进入受体通过性纤毛转导：转导：供体供体DNADNA片断通过媒介噬菌体携带进入受体片断通过媒介噬菌体携带进入受体 第四节第四节 微生物遗传变异的应用微生物遗传变异的应用v 诱变育种诱变育种v 原生质体融合育种原生质体融合育种v 基因工程基因工程原生质体融合（原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）通过人为的方法，使遗传性状不通过人为的方法，使遗传性
42、状不同的两个细胞的原生质体进行融合，同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。组子的过程。原生质体融合育种的优越性原生质体融合育种的优越性v打破了微生物的种属界限，可以实现远打破了微生物的种属界限，可以实现远 缘间菌株的基因重组。缘间菌株的基因重组。v可使遗传物质传递更为完整、获得更多基可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。因重组体的机会，有利于提高育种速度。v借助聚合剂可同时将几个亲本的原生质体借助聚合剂可同时将几个亲本的原生质体随机融合在一起，从而获得几个亲本性状的随机融合在一起，从而获得几
43、个亲本性状的重组体，加速育种进程。重组体，加速育种进程。v可与其他育种方法相结合，将二者所获得可与其他育种方法相结合，将二者所获得的优良性状进行融合。的优良性状进行融合。原生质体融合技术及育种步骤原生质体融合技术及育种步骤q原生质体的制备原生质体的制备q原生质体再生原生质体再生q原生质体融合原生质体融合q融合子的检出与鉴定融合子的检出与鉴定 原生质体再生原生质体再生 去壁后的原生质体能重建细胞壁，去壁后的原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态、并能生长、分裂恢复细胞完整形态、并能生长、分裂的过程。的过程。基因工程基因工程（gene engineeringgene engineering、gen
44、e technologygene technology）又称遗传工程（又称遗传工程（genetic engineeringgenetic engineering）利用分子生物学的理论和技术，自觉利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心心基因组，从而使生物体的遗传性状基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异的体外发生定向变异的体外DNADNA重组技术。重组技术。获得目的基因获得目的基因选择基因载体选择基因载体体外重组体外重组外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）外源基因导入（细菌、植物、动物、基因枪）筛选和鉴定筛选和鉴定应用应用基
45、因工程的基本操作基因工程的基本操作复制子复制子限制性内切酶位点限制性内切酶位点 选择性遗传标记选择性遗传标记可大量增殖可大量增殖 载体的特性载体的特性常用载体常用载体原核受体细胞：原核受体细胞：松弛型细菌质粒、松弛型细菌质粒、噬菌体噬菌体真核细胞受体：真核细胞受体：SV40病毒（动物）、病毒（动物）、Ti质粒（植物）质粒（植物）第五节第五节 菌种退化、复壮与保藏菌种退化、复壮与保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：影响微生物菌种稳定性的因素：a a）
46、变异）变异 b b）污染）污染 c c）死亡）死亡几个概念几个概念菌种退化（菌种退化（degenerationdegeneration）：）：指群体中指群体中退化细胞在数量上占一定数值后表现出退化细胞在数量上占一定数值后表现出菌种生产性能下降的现象。菌种生产性能下降的现象。菌种复壮：菌种复壮：采取一定的措施，使退化的采取一定的措施，使退化的群体中保持原有菌种特性的细胞生长、群体中保持原有菌种特性的细胞生长、繁殖以更新退化菌株的过程。繁殖以更新退化菌株的过程。一、菌种的衰退与复壮一、菌种的衰退与复壮菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变纯菌种纯菌种自发突变自发突
47、变不纯菌种不纯菌种突变个体突变个体传代增殖传代增殖原始个体原始个体衰退衰退菌种菌种衰退：菌种出现或表现出负变性状衰退：菌种出现或表现出负变性状1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。新获得具有原有典型性状的菌种。a）纯种分离；）纯种分离；b）通过寄主体进行复壮；）通过寄主体进行复壮；2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变正变”个体。个体。菌种的复壮：菌种的复壮：二、防止衰退的措施二、防止衰退的措施1）减少传
48、代次数；减少传代次数；2）创造良好的培养条件；）创造良好的培养条件；3）利用单核体传代）利用单核体传代4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；5）采用有效的菌种保藏方法；）采用有效的菌种保藏方法；菌种保藏的原理菌种保藏的原理 人为地创造合适的环境条件，人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。繁殖受抑制的休眠状态。人工环境主要从人工环境主要从低温、干燥、缺氧低温、干燥、缺氧三方面设计。三方面设计。三、菌种保藏三、菌种保藏目目 的：在一定时间内使菌种不死、不变、不的：在一定
49、时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用乱，以供研究、生产、交换之用基本原则：基本原则：1、挑选典型菌种的优良纯种、挑选典型菌种的优良纯种 2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体 3、创造有利于休眠的保藏环境、创造有利于休眠的保藏环境 4、尽可能多的采用不同的手段保藏一、尽可能多的采用不同的手段保藏一 些比较重要的微生物菌株些比较重要的微生物菌株菌种保藏的原理：菌种保藏的原理：人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。基本方法基本方法培养基传代培养（培养基传代培养（斜面、平板）斜面、平板）寄主传代培养寄主传代培养低温（低温（液氮、低温冰箱）液氮、低温冰箱）干燥（干燥（沙土管、真空干燥）沙土管、真空干燥）生活态生活态休眠态休眠态
