1、第五章第五章 工业微生物产生菌工业微生物产生菌的分离筛选的分离筛选v第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集 v第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养 v第三节第三节 好养微生物的分离好养微生物的分离 v第四节第四节 厌氧微生物的分离厌氧微生物的分离v第五节第五节 野生型菌株的筛选和菌株鉴定野生型菌株的筛选和菌株鉴定v第六节第六节 极端环境微生物的分离筛选极端环境微生物的分离筛选v第七节第七节 生物可降解塑料菌株的分离筛选生物可降解塑料菌株的分离筛选v 菌株分离（菌株分离（sepsepa arationration）就是将一个混杂着各）就是将一个混杂着各种微生物的
2、样品通过分离技术区分开，并按照实种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生法对它们进行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。物的过程。v工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：工业微生物产生菌的筛选一般包括两大部分：一一是从自然界分离所需要的菌株，是从自然界分离所需要的菌株，二是把分离到的二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。菌种是发酵工业的关键菌种是发酵工业的关键v菌种可从以下几个途径进行收集和筛选：菌种可从以
3、下几个途径进行收集和筛选：（1 1）向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。向菌种保藏机构和个人索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。国际承认的培养物保藏单位国际承认的培养物保藏单位 保藏单位保藏单位(简称简称)所在国家所在国家 保藏范围保藏范围澳大利亚国家分析试验室澳大利亚国家分析试验室(AGAL)澳大利亚澳大利亚 微生物菌种微生物菌种比利时微生物保藏中心比利时微生物保藏中心(BCCM)比利时比利时 大部分微生物菌种大部分微生物菌种保加利亚菌种保藏库保加利亚菌种保藏库(NBIMCC)保加利亚保加利亚 微生物菌种微生物菌种中国典型培养物保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)中国
4、中国 几乎所有的培养物几乎所有的培养物中国普通微生物菌种保藏中心中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)中国中国 普通菌种普通菌种捷克微生物保藏所捷克微生物保藏所(CCM)捷克捷克 普通微生物菌种普通微生物菌种法国微生物保藏中心法国微生物保藏中心(CNCM)法国法国 几乎所有的培养物几乎所有的培养物德国微生物保藏中心德国微生物保藏中心(DSM)德国德国 普通微生物菌种普通微生物菌种匈牙利国家农业和匈牙利国家农业和 工业微生物保藏中心工业微生物保藏中心(NCAIM)匈牙利匈牙利 工业菌种工业菌种 日本国家生命科学日本国家生命科学 和人类技术研究所和人类技术研究所(NIBH)日本日本 几乎所有的培
5、养物几乎所有的培养物荷兰真菌保藏所荷兰真菌保藏所(CBS)荷兰荷兰 真菌类真菌类韩国细胞系研究联盟韩国细胞系研究联盟(KCLRF)韩国韩国 动植物细胞系动植物细胞系 韩国微生物保藏中心韩国微生物保藏中心(KCCM)韩国韩国 微生物菌种微生物菌种韩国典型培养物保藏中心韩国典型培养物保藏中心(KCTC)韩国韩国 培养物培养物俄罗斯微生物保藏中心俄罗斯微生物保藏中心(VKM)俄罗斯俄罗斯 工业微生物工业微生物俄罗斯科学院微生物理化所俄罗斯科学院微生物理化所(IBFMVKM)俄罗斯俄罗斯 所有培养物所有培养物俄罗斯国家工业微生物保藏中心俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)俄罗斯俄罗斯 工业菌种工业
6、菌种斯洛伐克酵母保存所斯洛伐克酵母保存所(CCY)斯洛伐克斯洛伐克 酵母菌酵母菌西班牙普通微生物保藏中心西班牙普通微生物保藏中心(CECT)西班牙西班牙 普通微生物菌种普通微生物菌种英国藻类和原生物动物保藏中心英国藻类和原生物动物保藏中心(CCAP)英国英国 藻类、原生动物藻类、原生动物欧洲动物细胞保藏中心欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)英国英国 动物细胞系等动物细胞系等国际真菌学研究所国际真菌学研究所(IMI)英国英国 真菌、细菌等真菌、细菌等英国国家食品细胞保藏中心英国国家食品细胞保藏中心(NCFB)英国英国 工业细菌工业细菌英国国家典型培养物保藏中心英国国家典型培养物保藏中心(NCTC
7、)英国英国 普通微生物普通微生物英国国家酵母菌保藏中心英国国家酵母菌保藏中心(NCYC)英国英国 酵母菌酵母菌英国国家工业和海洋细菌保藏中心英国国家工业和海洋细菌保藏中心(NCIMB)英国英国 工业及海洋细菌工业及海洋细菌美国北方农业研究所培养物保藏中心美国北方农业研究所培养物保藏中心(NRRL)美国美国 以微生物菌种为主以微生物菌种为主美国典型培养物保藏中心美国典型培养物保藏中心(ATCC)美国美国 几乎所有的培养物几乎所有的培养物（2 2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。等，从中进行分离筛选。（3 3）从一些发酵制品中分离目
8、的菌株。从一些发酵制品中分离目的菌株。v菌株的分离和筛选一般可分以下菌株的分离和筛选一般可分以下几个步骤几个步骤:v采样采样v富集富集v分离分离v产物鉴别产物鉴别v生化鉴定生化鉴定第一节第一节 含微生物样品的采集含微生物样品的采集v一、从土壤中采样一、从土壤中采样1 1克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（细菌（10108 8）放线菌（）放线菌（10107 7）霉菌（）霉菌（10106 6）酵母菌（酵母菌（10105 5）藻类（）藻类（10104 4）原生动）原生动物（物（10103 3）v（一）根据土壤特点（一）根据土壤特点 1 1土壤有机质含量和通气
9、状况土壤有机质含量和通气状况 耕作土、菜园土、近郊土壤，森林土，贫瘠土壤耕作土、菜园土、近郊土壤，森林土，贫瘠土壤 土样最好的土层是土样最好的土层是5-25cm5-25cm、一般每克土中含菌数约、一般每克土中含菌数约几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几几十万到几十亿个，并且各种类型的细菌和放线菌几乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约乎都能分离到。总的来说酵母菌分布土层最浅，约5-5-10 cm10 cm；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。厌氧菌；霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。厌氧菌分布较深。分布较深。2 2土壤的酸碱度和植被状况土壤的酸碱度和植被状况 3 3地理条件：南方
10、、北方地理条件：南方、北方 4 4季节条件季节条件 ：710710个月个月v（二）采样方法（二）采样方法v 用取样铲，将表层用取样铲，将表层5cm5cm左右的浮土除去，取左右的浮土除去，取5-25cm5-25cm处的土样处的土样101025 g25 g，装入事先准准备好的，装入事先准准备好的塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。土质、植被名称、时间及其他环境条件。v 北方土壤干燥在北方土壤干燥在10-30cm10-30cm处取样。处取样。v 一般样品取回后应马上分离，以免微生物死一般样品取回后应马上分离，以免微生
11、物死亡。亡。v 样品较多时，可先采用选择性培养基做好试样品较多时，可先采用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。管斜面，随身带走。v v二、根据微生物生理特点取样二、根据微生物生理特点取样v 1 1根据微生物的营养类型根据微生物的营养类型v每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、若需要筛选代谢合成某种化合物的微生物，从大量使用、生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满生产或处理这种化合物的工厂附近采集样品，容易得到满意的效果。意的效果。v森林、肉类加工厂、面粉厂、糖厂、柑橘、油田、
12、化工厂森林、肉类加工厂、面粉厂、糖厂、柑橘、油田、化工厂等等v不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳不少微生物对碳源的利用是不完全专一的，如以油脂为碳源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生源的某些脂肪酶产生菌同样也可以分解淀粉获得能源而生长。长。v2.2.根据微生物的生理特性根据微生物的生理特性v高温、低温、耐压、耐高渗等高温、低温、耐压、耐高渗等v 三、特殊环境下采样三、特殊环境下采样v1 1局部环境条件的影响局部环境条件的影响v2 2极端环境条件的影响极端环境条件的影响特定微生特定微生物的分离物的分离 嗜嗜 极极 菌菌嗜压、嗜酸嗜压、嗜酸嗜减嗜减v一一、控制培养基的
13、营养成分、控制培养基的营养成分v1 1 根据环境条件选择合适的培养基根据环境条件选择合适的培养基v2 2、根据微生物的类型、根据微生物的类型v3 3、根据微生物对环境的耐受范围具有可塑性、根据微生物对环境的耐受范围具有可塑性的特点的特点(抗性菌株、污染物分解菌）抗性菌株、污染物分解菌）第二节第二节 含微生物样品的富集培养含微生物样品的富集培养富集培养（富集培养（enrichment breeding)：是在目的：是在目的微生物含量较少时根据微生物的特点设计一种微生物含量较少时根据微生物的特点设计一种选择培养基，创造有利的生长条件，使目的微选择培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境
14、下迅速生长繁殖，数量增加，生物在最适的环境下迅速生长繁殖，数量增加，由原来的自然条件下的劣势菌株变成人工环境由原来的自然条件下的劣势菌株变成人工环境下的优势种，以利分离到所需菌株。下的优势种，以利分离到所需菌株。富集培养主要是根据微生物的富集培养主要是根据微生物的碳源碳源、氮源氮源、pH、温度温度、需氧需氧等生理因素加以控制。等生理因素加以控制。v二、控制培养条件二、控制培养条件 细菌、放线菌的生长繁殖要求偏碱（细菌、放线菌的生长繁殖要求偏碱（pH7.0-7.5)pH7.0-7.5)霉菌和酵母菌的生长繁殖要求偏酸（霉菌和酵母菌的生长繁殖要求偏酸（pH4.5-6.0pH4.5-6.0）温度、通气
15、量等温度、通气量等 极端微生物极端微生物 微生物的生理特点微生物的生理特点v三、抑制不需要的菌类三、抑制不需要的菌类 1、分离真菌时可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌、分离真菌时可在培养基中加入四环素等抗生素抑制细菌 2、分离放线菌时在培养基中加入、分离放线菌时在培养基中加入10滴滴10%的酚或加青霉素、的酚或加青霉素、链霉素等抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，或加入丙酸钠链霉素等抑制革兰氏阳性菌和阴性菌，或加入丙酸钠10ug/ml抑制霉菌和细菌生长抑制霉菌和细菌生长 3、加入放线菌酮可以有效抑制真菌的生长、加入放线菌酮可以有效抑制真菌的生长4 4、在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑
16、、在富集培养基中加人适量的胆盐和十二烷基磺酸钠可抑制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用制革兰阳性菌的生长，对革兰阴性菌无抑制作用5 5、分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂、分离厌氧菌时，可加人少量硫乙醇酸钠作为还原剂6 6、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样、在分离除链霉菌以外的放线菌时，先将土样在空气中干燥，再加热到在空气中干燥，再加热到100100保温保温1h1h，可简，可简少细菌和链霉菌的数量。少细菌和链霉菌的数量。7 7、分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别、分离耐高浓度酒精和高渗酵母菌时，可分别将样品在高浓度酒精和高浓度甘蔗溶液中处理将样品在高浓度酒精和高浓度甘
17、蔗溶液中处理一段时间。杀死非目的微生物后再进行分离。一段时间。杀死非目的微生物后再进行分离。v从土壤中分离芽孢杆菌从土壤中分离芽孢杆菌v对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生对于含菌数量较少的样品或分离一些稀有微生物时，采用富集培养可以提高分离工作效率。物时，采用富集培养可以提高分离工作效率。第三节第三节 好氧微生物的分离好氧微生物的分离较粗放的分离方法较粗放的分离方法 “菌落纯菌落纯”如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等如稀释涂布法，划线分离法，组织分离法等 。组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离组织分离法则通常是从有病或特殊组织中分离菌株。菌株。较细的分离方法较细的分离方法 “菌株
18、纯菌株纯”单细胞或单孢子分离方法单细胞或单孢子分离方法”这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显这类方法需采用专门的仪器设备，复杂的如显微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作微操纵装置，简单的可利用培养皿或凹玻片作分离小室进行分离、分离小室进行分离、v一一 稀释涂布法稀释涂布法v二二 划线分离法划线分离法v三三 利用平皿的生化反利用平皿的生化反应进行分离应进行分离1 1透明圈法透明圈法2 2变色圈法变色圈法 3 3生长圈法生长圈法4 4抑菌圈法抑菌圈法饱浸含某种指示饱浸含某种指示剂的固体培养基剂的固体培养基的滤纸片变色圈的滤纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌
19、落周围形成体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。质形成透明圈。利用一些有特别营养要利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物物的前体转化成营养物 能力，工具菌就能围绕能力，工具菌就能围绕该菌生长该菌生长 待筛选的菌株能待筛选的菌株能分泌产生某些能分泌产生某些能抑制工具菌生长抑制
20、工具菌生长的物质的物质 v四四 组织分离法组织分离法v1 1对一般有病组织的分离方法对一般有病组织的分离方法 用用10%10%漂白粉或漂白粉或0.10.1升汞浸泡升汞浸泡v2 2食用菌孢子分离法食用菌孢子分离法 （1 1）多孢子分离法）多孢子分离法 （2 2）单孢子分离法：单孢子稀）单孢子分离法：单孢子稀释释v五五 单细胞或单孢子分离法单细胞或单孢子分离法v1 1、小滴分离纯化方法、小滴分离纯化方法 稀释样品为稀释样品为1500/ml1500/ml，滴管，滴管4000d/ml4000d/mlv2 2、滤纸片法、滤纸片法 六、通过控制营养和培养条件进行分离六、通过控制营养和培养条件进行分离v1.
21、1.培养基的营养成分培养基的营养成分 v2.2.培养基的培养基的pHpHv3.3.排除不需要的菌类排除不需要的菌类v4 4控制培养温度控制培养温度 50-6050-6020-4020-401515或更低或更低 （1 1）分离细菌时，在培养基中加入浓度为）分离细菌时，在培养基中加入浓度为50U50Umlml制霉菌素；制霉菌素；可以抑制霉菌和酵母菌的生长。可以抑制霉菌和酵母菌的生长。（2 2）分离放线菌时，在样品中加入）分离放线菌时，在样品中加入 0.05 0.05 十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠（SDSSDS）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢子的菌）不仅可以抑制细菌的主长；还能激活放线菌孢
22、子的菌丝。加人氟哌酸（丝。加人氟哌酸（5mg/L5mg/L）+制霉菌素（制霉菌素（50mg/L50mg/L）+青霉素青霉素（0.5mg/L0.5mg/L）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的）也可有效地抑制细菌和真菌，而不影响放线菌的生长。生长。（3 3）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素）分离霉菌和酵母菌时，在培养基中加入青霉素、链霉素和四环素各和四环素各30U30Umlml，可以抑制细菌和放线菌生长。，可以抑制细菌和放线菌生长。（4 4）分离根霉和毛霉在培养基中添加）分离根霉和毛霉在培养基中添加0.1%0.1%去氧胆酸钠或山梨去氧胆酸钠或山梨醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小
23、而紧密。醇防止菌丝蔓延，使菌落长得小而紧密。第四节第四节 厌氧微生物的分离厌氧微生物的分离v一、厌氧培养中几种除氧的方法一、厌氧培养中几种除氧的方法v（一）加还原剂（一）加还原剂 分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、分离培养基内加人还原剂，如半胱氨酸、D D型维生素型维生素C C、硫化钠等，操作时以最快的速、硫化钠等，操作时以最快的速度划线分离，然后立即置于事先已抽真空度划线分离，然后立即置于事先已抽真空密闭的容器内（充密闭的容器内（充COCO2 2或或N N2 2），适温培养。），适温培养。（二）焦性没食子酸法（二）焦性没食子酸法 （1,2,3-1,2,3-三羟基苯）三羟基苯）（三）平皿厌气
24、培养法（三）平皿厌气培养法（四）试管厌气培养法（四）试管厌气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（五）玻璃板隔绝空气培养法（六）生物吸氧法（六）生物吸氧法 除以上的方法外，还有肝块肉汤培养，除以上的方法外，还有肝块肉汤培养，高层琼脂法，共栖培养法等高层琼脂法，共栖培养法等 实例：实例：1 1）保加利亚乳杆菌的分离筛选）保加利亚乳杆菌的分离筛选 2 2）反硝化细菌的分离）反硝化细菌的分离（1 1）单个平皿法）单个平皿法 按常规在琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器中按常规在琼脂平板上划线接种。将固体石蜡置于一容器中加热融化。取方形玻板一块加热融化。取方形玻板一块 ,中央置纱布或重叠滤纸一小块中央
25、置纱布或重叠滤纸一小块 ,上面放焦性没食子酸上面放焦性没食子酸 0.5g 0.5g，加，加 10 10 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 0.5ml 0.5ml 后迅速将平皿底倒置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。置后迅速将平皿底倒置于其上，周围立即用融化石蜡封闭。置 37 37 温箱培养温箱培养 2-3d 2-3d，取出观察。，取出观察。（2 2）试管培养法）试管培养法 取约取约 100cm3 100cm3 容积的大试管一支，在管底放焦性没食子容积的大试管一支，在管底放焦性没食子酸酸 10g 10g 及玻璃珠数个。将已接种的培养管放入大试管中，加入及玻璃珠数个。将已接种的培养管放入大试管中，加入 20
26、 20 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 1m1 1m1，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时四周围封以石蜡，四周围封以石蜡，3737培养培养 2-3d 2-3d 观察。观察。3 3）干燥器（玻罐）法）干燥器（玻罐）法 计算好容器的体积，根据其体积称取焦性没食子酸（置计算好容器的体积，根据其体积称取焦性没食子酸（置于平皿内）和配制氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液倒人干燥器于平皿内）和配制氢氧化钠溶液。将氢氧化钠溶液倒人干燥器底部，把盛有焦性没食子酸的平皿轻轻漂浮于液面上。放好隔底部，把盛有焦性没食子酸的平皿轻轻漂浮于液面上。放好隔板，将接种好的平板或试管置于隔板上，把干燥器盖盖上
27、密封板，将接种好的平板或试管置于隔板上，把干燥器盖盖上密封（可预先在罐口抹一薄层凡士林）。轻轻摇动干燥器，使焦性（可预先在罐口抹一薄层凡士林）。轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸和氢氧化钠溶液混合，置没食子酸和氢氧化钠溶液混合，置 37 37 温箱培养温箱培养 2-3d 2-3d，取，取出观察出观察第五节第五节 野生型目的菌株的筛选野生型目的菌株的筛选 和菌株鉴定和菌株鉴定v 一、初筛一、初筛v1 1平板筛选平板筛选 较粗放的检筛方法较粗放的检筛方法 v2 2摇瓶筛选摇瓶筛选 效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广效果比较一致，由此筛选到的菌株易于推广,通通过该法可淘汰过该法可淘汰85-90%85
28、-90%不符合要求的微生物不符合要求的微生物 v 二、复筛二、复筛 一个菌株通常要重复一个菌株通常要重复3-53-5个瓶，培养后的发酵液个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定采用精确分析方法测定 v三三 菌株鉴定菌株鉴定 三个步骤：三个步骤：1 1、获得该微生物的纯种培养物；、获得该微生物的纯种培养物；2 2、测定一系列必要的鉴定指标；、测定一系列必要的鉴定指标；3 3、根据权威性的鉴定手册进行菌种鉴定、根据权威性的鉴定手册进行菌种鉴定。四个水平：细胞形态和习性水平；细胞组分水平；四个水平：细胞形态和习性水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因或蛋白质水平；基因或DNADNA水平。水平。菌落形态
29、，个菌落形态，个体形态，革兰体形态，革兰氏染色，生理氏染色，生理生化，分子鉴生化，分子鉴定定例子例子：高产类胡萝卜素红酵母的高产类胡萝卜素红酵母的分离分离筛选筛选取样取样富集培养（初筛和复筛）富集培养（初筛和复筛）菌株鉴定菌株鉴定取样及筛选取样及筛选1 1、水池边红色附着物中红酵母的分离、水池边红色附着物中红酵母的分离2 2、公共浴室红色附着物中红酵母的分离、公共浴室红色附着物中红酵母的分离3 3、空气中红酵母的分离、空气中红酵母的分离4 4、果园土壤、汽车修理厂土壤中红酵母的分离、果园土壤、汽车修理厂土壤中红酵母的分离5 5、醪糟、葡萄汁中红酵母的分离、醪糟、葡萄汁中红酵母的分离分离分离筛选
30、用筛选用培养基培养基1 1、平板筛选培养基（、平板筛选培养基（20%20%PDAPDA）：）：马铃薯马铃薯2020%，葡萄糖，葡萄糖2%2%，琼脂，琼脂1.8%1.8%，自然，自然p pH H，121121灭菌灭菌30min30min；2 2、富集培养基：、富集培养基：马铃薯马铃薯2020%，葡萄糖，葡萄糖2%2%，自然，自然p pH H，121121灭菌灭菌30min30min；3 3、斜面保存培养基（、斜面保存培养基（20%20%PDAPDA）：）：马铃薯马铃薯20%20%，葡萄糖，葡萄糖2%2%，琼脂，琼脂1.8%1.8%，自然，自然p pH H，121121灭菌灭菌30min30min
31、；4 4、液体种子培养基、液体种子培养基(YEPD)9(YEPD)9：葡萄糖葡萄糖2%2%，酵母，酵母膏膏1%1%，蛋白胨，蛋白胨1%1%，自然，自然p pH H，121121灭菌灭菌2 20min0min；5 5、液体发酵培养基、液体发酵培养基(YEPD)9(YEPD)9：葡萄糖葡萄糖4 4%，酵母，酵母膏膏1 1%，蛋白胨，蛋白胨1 1%，p pH H 6.06.0，121121灭菌灭菌2 20min0min；6 6、鉴定用培养基、鉴定用培养基1010：5%5%麦芽汁培养基，麦芽汁培养基，12.5%12.5%豆芽汁培养基，尿素液体培养基，无碳培养基，豆芽汁培养基，尿素液体培养基，无碳培养基
32、，无氮培养基，尿素液体培养基，无氮培养基，尿素液体培养基，GorodkowaGorodkowa培养基，培养基，马铃薯块培养基马铃薯块培养基。红酵母的鉴定红酵母的鉴定参照参照BarenttJAYeastscharacteristicsandidentifaction1717有选择性地对筛选所得酵母菌进行有选择性地对筛选所得酵母菌进行形态特征形态特征（细胞形态、群体培养特征、子囊孢子的形成、假（细胞形态、群体培养特征、子囊孢子的形成、假菌丝的形成和形态、掷孢子的形成）菌丝的形成和形态、掷孢子的形成）生理生化特性生理生化特性（糖类发酵特性、碳源同化特性、氮源同化特（糖类发酵特性、碳源同化特性、氮源同
33、化特性、耐高渗特性、脲酶试验特性、重氮基蓝性、耐高渗特性、脲酶试验特性、重氮基蓝B B盐显色特性）盐显色特性）鉴定。鉴定。第六节第六节 极端环境微生物的分离筛选极端环境微生物的分离筛选一、极端环境微生物的采样、分离筛选一、极端环境微生物的采样、分离筛选（一）（一）极端环境微生物选育主要流程极端环境微生物选育主要流程样品采集样品采集富集培养富集培养分离纯化分离纯化菌种鉴定菌种鉴定菌种改良菌种改良接种实验接种实验效果明显菌效果明显菌效果不明显菌效果不明显菌工业生产工业生产菌种保藏菌种保藏继续驯化继续驯化提取宏基因组提取宏基因组建立宏基因组文库建立宏基因组文库分析宏基因组文库分析宏基因组文库利用利用
34、PCRPCR或杂交筛选特定功能基因或杂交筛选特定功能基因筛选表达特定表型的基因筛选表达特定表型的基因随机测序分析微生物生态随机测序分析微生物生态（二）（二）采集样品采集样品不同的微生物到不同的环境中去取样不同的微生物到不同的环境中去取样（三）采集样品的方法（三）采集样品的方法（四）样品的富集培养（四）样品的富集培养（五）菌株分离（五）菌株分离1 1、嗜热好氧菌培养基、嗜热好氧菌培养基2 2、嗜热厌氧菌培养基、嗜热厌氧菌培养基根据自己的需要，采用根据自己的需要，采用不同的方法：直接分离不同的方法：直接分离培养；带回培养；直接培养；带回培养；直接提取提取DNADNA 嗜热菌培养时注意哪嗜热菌培养时
35、注意哪些问题？液体或固体些问题？液体或固体培养培养嗜热菌与普通菌分离培养有什么不同？嗜热菌与普通菌分离培养有什么不同？1 1、在固体平板分离培养时，由于水分的蒸发，而使平板培养、在固体平板分离培养时，由于水分的蒸发，而使平板培养容易发生皱裂。容易发生皱裂。2 2、液体培养基培养时，置于、液体培养基培养时，置于6060培养，转速高于培养，转速高于180rpm180rpm以上，以上，蒸发和通氧均不会造成影响，而高于蒸发和通氧均不会造成影响，而高于7070时，蒸发成为突出问时，蒸发成为突出问题。题。二、极端微生物酶分子生物学研究二、极端微生物酶分子生物学研究1 1、极端酶基因的克隆、极端酶基因的克隆
36、2 2、极端酶基因表达系统的构建、极端酶基因表达系统的构建1 1、分离纯化极端酶、分离纯化极端酶2 2、测定目的蛋白的、测定目的蛋白的N N和和C C端端3 3、根据氨基酸序列推导核苷、根据氨基酸序列推导核苷酸序列，设计引物酸序列，设计引物4 4、通过、通过PCRPCR扩增基因扩增基因5 5、构建基因文库或、构建基因文库或cDNAcDNA文库文库6 6、通过分子杂交或目的蛋白、通过分子杂交或目的蛋白活性检测活性检测研究极端微生物多样性及其应用的意义：研究极端微生物多样性及其应用的意义：1 1、极端环境微生物的基因是构建遗传工程菌的资源宝库。、极端环境微生物的基因是构建遗传工程菌的资源宝库。2
37、2、极端环境微生物的生态、结构、分类、代谢、遗传等、极端环境微生物的生态、结构、分类、代谢、遗传等均有别于普通微生物，使得极端环境微生物的活性物质均有别于普通微生物，使得极端环境微生物的活性物质具有普通微生物活性物质所不具备的特性。具有普通微生物活性物质所不具备的特性。3 3、为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。、为生物进化、生命起源的研究提供新的材料。第七节第七节 生物可降解塑料（生物可降解塑料（PHAPHA）菌株的分离筛选菌株的分离筛选一、生物可降解塑料概况一、生物可降解塑料概况二、获得生物可降解塑料的微生物途径和菌株分离二、获得生物可降解塑料的微生物途径和菌株分离 方法方法1 1、从
38、自然界分离产生、从自然界分离产生PHAPHA的微生物的微生物2 2、利用食品工厂活性污泥生产、利用食品工厂活性污泥生产PHAPHA3 3、构建基因工程菌株合成生物可降解塑料、构建基因工程菌株合成生物可降解塑料三、三、PHAPHA合成机制和发酵特点合成机制和发酵特点1 1、碳源、碳源2 2、氮源、氮源3 3、溶氧、溶氧4 4、pHpH、温度及无机元素、温度及无机元素 特殊菌类特殊菌类环保降解菌的分离环保降解菌的分离v1 1、自然界存在着大量废物及污染物，如多环、自然界存在着大量废物及污染物，如多环芳烃（芳烃（PANPAN）、有机染料和颜料、表面活性剂、）、有机染料和颜料、表面活性剂、农药、酚类和
39、卤代烃等。在分离筛选这类物农药、酚类和卤代烃等。在分离筛选这类物质的降解微生物时，通常采用以该物质为唯质的降解微生物时，通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培养。一碳源或氮源的培养基进行富集培养。2 2、分离平板可采用该污染物为底物的鉴别培、分离平板可采用该污染物为底物的鉴别培养基，通过水解圈和变色圈进一步提高筛选养基，通过水解圈和变色圈进一步提高筛选效率。采用该方法分离苯胺、效率。采用该方法分离苯胺、DDTDDT、甲基对硫、甲基对硫磷（磷（MPMP）、石油、甲胺磷等污染物都取得了）、石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。良好的效果。3 3、在筛选环保降解菌时要注意，某些有毒污染
40、物、在筛选环保降解菌时要注意，某些有毒污染物由于本身对微生物的生长有抑制作用，如果直接由于本身对微生物的生长有抑制作用，如果直接在培养基中加人该物质连续富集培养，可能效果在培养基中加人该物质连续富集培养，可能效果不佳。这时就需根据不同情况设计更合理的筛选不佳。这时就需根据不同情况设计更合理的筛选模型。模型。如在分离以氰化物为氮源的细菌时，把浸如在分离以氰化物为氮源的细菌时，把浸透了透了KCNKCN溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生溶液的滤纸放到平皿盖上，滤纸所产生的含的含CNCN蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每蒸气逐渐渗入含无机盐的分离培养基，每天用新制备的浸湿天用新制备的浸湿KCNKCN
41、的滤纸更换，培养一段时的滤纸更换，培养一段时间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易间后，从平皿上长出的菌落中进行分离，便容易得到能分解氰化物的菌株。得到能分解氰化物的菌株。复习题复习题1 1、名词解释、名词解释菌株分离菌株分离 筛选筛选 富集培养富集培养 PHA PHA 2 2、菌株分离的步骤、方法、菌株分离的步骤、方法 3 3、从土壤中采集样品的依据是什么、从土壤中采集样品的依据是什么4 4、如何富集微生物、如何富集微生物5 5、好氧微生物的分离方法、好氧微生物的分离方法6 6、常用的厌氧培养的方法有哪些、常用的厌氧培养的方法有哪些7 7、极端环境微生物的选育流程、极端环境微生物的选育流程8 8、极端微生物的培养与普通微生物的培养有什么区别、极端微生物的培养与普通微生物的培养有什么区别9 9、请你设计一实验，从海水中分离一株能够降解几丁质的、请你设计一实验，从海水中分离一株能够降解几丁质的酵母菌菌株（详细写明方法、培养基、培养条件等）酵母菌菌株（详细写明方法、培养基、培养条件等）
