1、1111 1 1微生物生理生化微生物生理生化胡小兵胡小兵市政工程专业市政工程专业建筑工程学院建筑工程学院二二0一五年七月一五年七月2第八章、核酸化学第八章、核酸化学二、核酸的组成成分二、核酸的组成成分三、三、DNA的结构的结构四、四、DNA和基因组和基因组五、五、RNA的结构的结构六、核酸生物合成六、核酸生物合成一、一、核酸的生物学功能核酸的生物学功能七、核酸的分子生物学七、核酸的分子生物学问问 题题1.DNA分子有几级结构，细菌的DNA的结构如何？2.基因与基因组有和区别？基因与基因组有和区别？3.遗传中发生点突变的依据是什么？4.生物遗传中发生了生物遗传中发生了“差错差错”，这是好事还是坏
2、事？，这是好事还是坏事？5.细菌的DNA 重组主要的方式有哪些？6.对于难降解的有机物如何筛选与培养特效菌种？对于难降解的有机物如何筛选与培养特效菌种？7.分子生物学技术在水处理中有何作用？34一、核酸的生物学功能一、核酸的生物学功能（一）核酸与遗传信息的传递（一）核酸与遗传信息的传递1.DNA是基本遗传物质2.RNA在传递遗传信息上的作用 1)mRNA是蛋白质合成的模板；2)tRNA识别mRNA上的遗传密码，转运特定氨基酸到核糖体上合成肽链；3)rRNA是核糖体的主要成分，是翻译工作的场所。（二）核酸与蛋白质的生物合成（二）核酸与蛋白质的生物合成DNA有选择地转录为mRNA，tRNA、rRN
3、A也是DNA转录产物。5生物遗传的变异起源于DNA碱基配对的改变。）由于DNA碱基的颠倒（如TA被颠倒为AT）或被调换（如GC被换为TA）；）由于在DNA复制过程中被遗漏了一对或多了一对核苷酸；）或者在转译时发生了差误，如氨酰tRNA合成酶错将一个结构与正常氨基酸十分相似的物质交给tRNA。）还有一些生物的遗传性状发生了突变。（三）核酸结构改变与生物变异（三）核酸结构改变与生物变异变异和进化都是DNA结构改变而引起蛋白质改变结果。6（四）遗传工程（四）遗传工程遗传工程是用人工方法改组DNA，从而培育新型生物品种的技术。实验室中将细菌作材料研究遗传工程过程可分为：（1）重组DNA分子（基因重组）
4、；（2）将重组DNA引入受体细胞（转化或转导）。（五）克隆与克隆化（五）克隆与克隆化由单一亲代细胞用无性繁殖产生的子代细胞称克隆，形成克隆的过程称克隆化。二、核酸的组成成分二、核酸的组成成分核酸 nucleic acid核苷酸 nucleotide核苷 nucleoside磷酸 phosphate嘌呤碱 purine base 或 嘧啶碱 pyrimidine base（碱基 base）核糖 ribose 或 脱氧核糖脱氧核糖 deoxyribose（戊糖 amyl sugar）（一）核糖和脱氧核糖（一）核糖和脱氧核糖OHOH2COHOHOH12OHOH2COHOH12-D-2-核糖-D-2-
5、脱氧核糖O核糖+H+糠醛甲基间苯二酚FeCl3绿色产物绿色产物脱氧核糖+H+-羟基-酮戊醛二苯胺蓝色产物蓝色产物RNA和和DNA定性、定量测定定性、定量测定（二）嘌呤碱和嘧啶碱（二）嘌呤碱和嘧啶碱NNNNHHHHNNNNHHHH123 456789嘌呤NH2腺嘌呤 adenine（A）NNNNHHHHOH2N鸟嘌呤 guanine（G）NNHHHH123645嘧啶NNHHHHNH2OH胞嘧啶 Cytosine（C）NNHHHHOOHH尿嘧啶 uracil（U）NNHHHHOOHHCH3胸腺嘧啶 thymine（T）（三）核苷（三）核苷OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHHH9腺嘌
6、呤腺 苷OHOH2COHOHOH12345核 糖OHOH2COHOH12345核 糖NNOOHHH尿嘧啶H1尿苷NCOONHHH51OH假尿苷（）NH2（四）核苷酸（四）核苷酸OHOH2COHOHOH12345核 糖NNNNHHHH9腺嘌呤胸 苷PO-OO胸苷-5-磷酸AMPP O-OOADPATPP O-OOOHO-O OCH2 TO=PO-35OHOHO-O OCH2 GO=PO-35OHO OCH2OHOH AO=POO-35351PPPOHATGpGpTpAOHpG-T-ApGTA141、各种核苷三磷酸、脱氧核苷三磷酸是体内合成RNA 和DNA合成的直接原料。2、能量代谢中的能量直接载
7、体。ATP能量“货币”UTP参加糖的互相转化与合成CTP参加磷脂的合成GTP参加蛋白质和嘌呤的合成核苷酸作用核苷酸作用三、三、DNA的结构的结构（一）（一）DNA的一级结构的一级结构1)DNA 序列常被认为是碱基序列碱基序列（base sequence)。2)通常碱基序列由DNA链的53方向方向写。3)DNA中有4种类型的核苷酸，有n个核苷酸组成的DNA链中可能有的不同序列总数为4n。16（二）（二）DNA的双螺旋结构的双螺旋结构17鸟嘌呤胞嘧啶碱基对腺嘌呤胸腺嘧啶碱基对18磷酸二酯键磷酸二酯键192.双螺旋结构模型要点双螺旋结构模型要点（1）两条多核苷酸链反向平行。（2）碱基内侧，A与T、G
8、与C配对，分别形成3和2个氢键。（3）双螺旋每转一周有10个bp，螺距3.4nm，直径2nm。3.双螺旋结构的稳定因素双螺旋结构的稳定因素 （1）氢键氢键（太弱）；（2）碱基堆积力碱基堆积力（base stacking force，由芳香族碱基电子间的相互作用引起的，能形成疏水核心疏水核心，是稳定DNA最重要的因素；（3）离子键离子键（减少双链间的静电斥力）。202122染色体包装的结构模型染色体包装的结构模型多级螺旋模型多级螺旋模型压缩倍数 7 6 40 5 DNA 核小体 螺线管 超螺线管 染色单体 2nm 10nm 30(10)nm 400nm 210m 一级包装 二级包装 三级包装 四
9、级包装 （三）（三）DNA的三级结构的三级结构线形分子、双链环状(dcDNA)超螺旋四、四、DNA与基因组织与基因组织DNATranscription RNA（mRNA、tRNA、rRNA）TranslationProtein基因基因基因基因是DNA片段的核苷酸序列，DNA分子中最小的功能单位。结构基因调节基因基因组基因组25五、五、RNA结构结构2627主要特征主要特征：1.1.四臂四环；四臂四环；2.2.氨基酸臂氨基酸臂33端有端有CCACCAOHOH的的共有结构；共有结构；3.3.D D环上有二氢尿嘧啶环上有二氢尿嘧啶(D)(D)；4.4.反密码环上的反密码子与反密码环上的反密码子与mR
10、NAmRNA相互作用；相互作用；5.5.可变环上的核苷酸数目可可变环上的核苷酸数目可以变动；以变动；6.6.T TC C环含有环含有T T和和；7.7.含有修饰碱基和不变核苷含有修饰碱基和不变核苷酸酸。28291、原核微生物的单链环状DNA主要采用滚环式滚环式复制一）一）DNA的生物合成的生物合成-半保留半保留DNA复制的起点和方向复制的起点和方向53535六六 核酸的生物合成核酸的生物合成302、真核生物、真核生物DNA的多起点复制的多起点复制n31二）原核细胞的二）原核细胞的DNA复制复制1.DNA聚合酶聚合酶（Pol）（dNMP）n+dNTPMg2+（dNMP）n+1+PPi特点特点（1
11、）不能催化从无到有的聚合反应。（2）催化的反应只能在引物的3延伸。（3）3接上的核苷酸决定于模板链。（4）具有53和35外切酶活性。322.Pol和和Pol PCR（多聚酶链式反应）551 热变性热变性2 退火退火55553 DNA聚合酶聚合酶5555重复重复1，2，3PCR反应全过程反应全过程333.双链双链DNA复制的分子机制复制的分子机制（1）冈崎片段和半不连续复制）冈崎片段和半不连续复制533553355335复制叉上复制叉上DNA合成的三种可行性合成的三种可行性34（2）冈崎片段的）冈崎片段的RNA引物引物利福酶素利福酶素对RNA聚合酶有抑制作用。氯霉素氯霉素对蛋白质合成有抑制作用。
12、引物RNA在复制过程中暂时存在，最后通过Pol的53外切酶活力水解。（3）DNA连接酶连接酶 催化一条DNA链的3末端与相邻的另一条DNA链的5末端之间的磷酸二酯键的合成。35 其它功能：其它功能：（1）修补双螺旋DNA中单股的缺口；（2）连接线状双螺旋DNA以产生环状DNA；（3）重组过程中将几段DNA链连接起来。（4）母本）母本DNA双链的分离双链的分离DNA解螺旋酶（DNAhelicase）拓扑异构酶（type topoisomerase）36（5）DNA聚合酶的聚合酶的“校对校对”作用作用 DNA聚合酶的35外切酶活力是校对新生DNA链和改正聚合酶活性所造成“错配”的一种手段。4.真核
13、细胞真核细胞DNA的复制的复制（1）真核细胞DNA复制有多个起始点。（2）至少有5种DNA聚合酶，即、。（3）端粒由端粒酶催化复制。生物细胞生物细胞DNA复制分子机制的基本特点。复制分子机制的基本特点。375.反转录作用反转录作用 利用反转录酶可制造与任何RNA（mRNA、tRNA、rRNA）的互补DNA（cDNA）。6.DNA的损伤与修复的损伤与修复（1）DNA损伤的各种结构变化损伤的各种结构变化碱基缺失或插入碱基改变形成TT二聚体（2）修复机制）修复机制光复活；切除修复；重组修复；SOS修复387.重组修复重组修复55重组重组修复修复5 三位科学家Tomas Lindahl、Paul Mo
14、drich和Aziz Sancar 因“DNA修复的机制研究”获2015年诺贝尔化学奖。39391）细菌的转化）细菌的转化4041412）细菌的转导）细菌的转导423）细细菌菌的的结结合合438.细菌的限制细菌的限制修饰系统修饰系统限制性核酸内切酶5GTTAAC33CAATTG55GTT AAC33CAA TTG5平头末端平头末端Hpa 5GAATTC33CTTAAG55G TT AAC53 G AATT C 3粘性末端粘性末端EcoR44二二 RNA的生物合成的生物合成（一）转录（一）转录转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。1.原核细胞的转录原核细胞的转录E.coli 的RNA聚合酶中，
15、2称为核心酶。因子辨认模板DNA的起始位点。452.真核细胞的转录真核细胞的转录真核细胞RNA聚合酶有、三类。3.转录产物的加工转录产物的加工（1）rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工原原核核细细胞胞30S前体17S25S16S23S5S真真核核细细胞胞45S前体18S28S5.8S（2）tRNA前体的加工前体的加工（3）真核细胞）真核细胞mRNA的加工的加工468、DNA的分子生物学技术的分子生物学技术(后面我来讲）后面我来讲）方法应用局限性变形梯度凝胶电泳(DGGE)利用基因序列和长度差异分析群落多样性，适于分析较多种微生物条带序列较短，灵敏度有限，不能定量末端限制性片段长度多态性分析
16、(TRFLP)利用限制性位点差异分析群落多样性，快速，半定量分析限制性酶切不完全；高效高通量需要多次反复酶切克隆文库(Cloning library)利用序列差异和测序可知群落中各种群系统分类；为新引物和探针设计提供信息克隆步骤耗时较长,不适合大量分析,不适合反应器监测荧光原位杂交(FISH)原位定量和识别特定菌群背景荧光会干扰检测，探针的穿透性差会造成假阴性实时荧光定量PCR(QRT-PCR)目标基因的扩增和定量分析不适合各种基因的快速同时分析；PCR 高灵敏度易造成污染基因芯片(Microarray)高通量快速检测群落多样性，鉴定微生物并明确其生态作用环境样品特异性和灵敏度低，不能定量，样
17、品处理复杂，仪器贵重47变形梯度凝胶电泳变形梯度凝胶电泳 微生物群落遗传多样性以及 PCR 扩增 DNA 片段的多态性。变性剂梯度 低低 高高PCR等长DNA产物1 2 3 4 5 6 7聚丙烯酰胺凝胶到达变性梯度时DAN解链，速度下降A BC DE FG48DGGE技术主要操作过程如下技术主要操作过程如下:l样品预处理;l 样品DNA(或RNA)提取及纯化;l16S rDNA 或基因片段的PCR扩增;l预实验(DGGE 条件优化);l 制胶;l样品的DGGE 分析;l图谱分析;l条带序列分析。49DGGE过程示意图过程示意图50DGGE特点：特点：lDGGE 技术快速简便、分离效果好。技术快
18、速简便、分离效果好。从理论上讲，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE 技术对于DNA 片段的分辨率可以达到一个碱基差异水平，lDGGE 法只能对微生物群落中数量上大于大于1%的优的优势种群进行分析势种群进行分析。lDGGE 技术无法提供代谢活性无法提供代谢活性、细菌数量和基因表达水平方面的信息。511、微生物取样微生物取样 稳定运行条件下，不同温度条件(1)生物强化一体化反应器的填料上生物膜(2)生物滤塔填料上生物膜。52532、样品预处理样品预处理-土壤基因组提取试剂土壤基因组提取试剂盒快速提取生物膜中的总盒快速提取生物膜中的总DNA具体操作如下：1）取0.1-
19、0.3g污泥（生物膜）样本，加入1 ml Buffer SW，涡旋振荡1-3 min（让管底的污泥土壤振动起来），12000 rpm离心1 min，倒去上清液；2）加入750 l 70%乙醇，涡旋振荡1min，12000 rpm离心1min，倒去上清液；并用移液枪吸尽余液；3）在污泥中加入500 l Buffer SL，涡旋振荡1-3min，65水浴20 min，每隔5 min涡旋振荡5秒；4）12000 rpm离心3 min，上清液移至1.5 ml离心管中；上清液中加等体积Buffer SGL，颠倒混匀15-20次，冰上放置5 min，室温12000 rpm离心5min；5)上清液转入Spi
20、n column DM 微试管中（管内先放1个2 ml collection tube），12000 rpm离心1 min，弃废液，将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；54556)向Spin column DM加入500 l Buffer GWS，12000 rpm离心1min，弃 废液，将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；7)向Spin column DM中加入700 l Buffer GW1，12000 rpm离心1min弃废液，2 ml collection tube 重新放入Sp
21、in column DM 微试管；8)向Spin column DM中加入500 l Buffer GW2，12000 rpm离心1min弃废液，2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管；9)将2 ml collection tube 重新放入Spin column DM 微试管中，最大转速离心2 min，将Spin column DM管中上清液转到1.5 ml离心管中，打开盖子，室温放置数分数以充分晾干；10)再加入5-100 l Buffer GE，12000 rpm离心1min，把离心管中的液体重新加到原来的Spin column DM管中。
22、室温放置1 min，12000 rpm离心1 min，液体离心管中溶液（DAN样品）放置冰箱-20保存。563、DNA提出物分离与鉴别提出物分离与鉴别 1)称琼脂糖210 ml，加入TBE缓冲液30 ml，80微波溶化，加入2.0 l goldview新型核酸染料上胶到电泳槽上。2)把分离的总DNA样品加入到琼脂糖电泳凝胶上，同时点入marker DNA/Hind。3)电流条件：U=97V，I=61-63 mA，电泳时间为1h30 min到1h 50 min。4)然后把DNA分离后的凝胶放到凝胶成像系统中观察DAN分离效果，并拍摄图像。5758Marker58Marker23130bp9416
23、bp6559bp2322bp2927bp591、反应体系：试剂50ul体系终浓度Foward primer（F468）2ul0.4uMReverse primer（R468）2ul0.4uM22Taq MasterMix25ul1Template DNA1ug1ug/reactionRNase-free WaterUp to 50ul6060Primer名称名称序列序列(5to3)碱基数碱基数细菌通用引物F 468CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG ACT CCT ACG GGA GGC AG56细菌通用引物R 468GAC
24、TAC CAG GGT ATC TAA TCC2161步骤温度时间预变性942min变性9430s退火55-6530s延伸7230s终延伸722min变性延伸，25-35个循环；2、PCR反应条件：623、琼脂糖电泳后紫外成像。Marker6364DGGE分离具体过程：分离具体过程：1）配制高（70%）、低（30%）浓度的变性琼脂糖胶，加入聚合剂 TEMED和DGGE染料。2）用透明胶封固玻璃板两头，在距底板0.5-1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶放架子上打入胶模中，排气，凝胶厚度为3-5 mm。3）在凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将玻璃板移至装有1TAE缓冲液的电泳槽中，
25、轻轻拔去梳子，且使缓冲液没过胶面约1 mm。654）DNA样品与10Loading-buffer（含有溴酚蓝和甘油等物质）混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。5）电泳条件：60 C、电泳电压60 V，电泳12 h后，打开夹板，加入10%EB染料缓冲液中20 min，取出夹板，清水冲洗2遍后，擦干放在凝胶放到凝胶成像系统中观察，并拍摄图像。6）用洁净刀片将条带切下，放入1.5 mlEP 管，送测序公司纯化测序。66DGGE产物紫外呈像DGGE条带切割后呈像五）测序过程五）测序过程（一）测序过程1、对回收的DGGE条带进行二次PCR扩增及产物回收；2、目的片断TA克隆；3、蓝白斑筛选；4
26、、质粒提取；5、M13+/-测序。67（二）测序结果（二）测序结果DGGE条条带编号带编号测序编号测序编号V3区区菌种属名菌种属名14.19X1323-1198bpNovosphingobium新鞘氨醇杆菌属24.19X1324-4193bpDeltaproteobacteria-变形菌纲30514X1554-1174bpActinomycetales放线菌44.19X1326-6194bpNitrosomonadaceae亚硝化单胞菌科54.19X1327-5 164bpOceanibaculum海洋细菌64.19X1328-2168bpThalassobacter-变形菌纲一种74.19X
27、1329-2188bpFlavobacteriales黄杆菌目一属84.23X1386-1193bpPseudomonas asplenii铁角蕨假单胞菌6869DGGE条带编号条带编号测序编号测序编号V3区区菌种属名菌种属名94.19X1331-1193bpAquabacterium纤发菌属104.19X1332-2 188bpCrocinitomix黄杆菌目一属114.23X1387-1 193bpPseudomonaspsychrophila124.19X1334-4168bpAsticcacaulis不粘柄菌属 or Sphingomonas aurantiaca 单胞菌属134.19
28、X1335-5192bpMethylococcus 甲基球菌属144.19X1336-7 170bpFusibacter小纺锤状菌154.19X1337-4 193bpAeromonas气单胞菌属 or Shewanella希瓦氏菌属164.25X1338-5168bpParacoccus，-变变形菌纲，副球菌属五、结论五、结论1、生物强化一体化反应器、HPES反应生物滤塔中的微生物优势种类相同；但前者中的生物多样性要高一些，约高20%。2、生化反应器中的微生物以耐盐性菌类为主。如，新鞘氨醇杆菌属、-变形菌纲的红螺菌、纤发菌属等；3、生物中存在着一些硝化细菌，如：甲基球菌属、亚硝化单胞菌等。4、在冬季取样中发现有耐寒性微生物，如单胞菌属一种Sphingomonas aurantiaca。70
