1、液相色谱新进展液相色谱新进展 超高效液相色谱超高效液相色谱nWatersWaters公司的公司的UPLC:UPLC:Ultra Performance Liquid Ultra Performance Liquid Chromatography Chromatography (超高效液相色谱）超高效液相色谱）nAgilentAgilent公司的公司的RRLC:RRLC:Rapid Resolution Liquid Rapid Resolution Liquid ChromatographyChromatography（快速高分离度液相色谱）（快速高分离度液相色谱）一、定义：一、定义：用细粒径
2、填料（用细粒径填料（sub-2m)、细内径柱子获得柱效高达细内径柱子获得柱效高达(100,000-300,000/m)的液相的液相色谱技术，简称超高效液相色色谱技术，简称超高效液相色谱谱为什么关注小颗粒色谱填料？根据Van Deemter方程H=A+B/v+Cv 颗粒度越小，HETP越低，柱效越高，分离度越好对于小颗粒，通过高流速获得高分离速度对于小颗粒，提高流速时HETP不会提高提高分离速度n节约时间节约时间n节约溶剂节约溶剂n超高灵敏度超高灵敏度n超高分离度超高分离度缺点：缺点：n高压力高压力 Agilent RRLC 约约450bar Waters UPLC 约约700bar优点：优点：
3、4.4614.6918.0808.189AU0.000.050.100.150.200.250.300.350.40分钟1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00AU0.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.20分钟0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.00Rg1ReRb1西洋参成分的分离比对西洋参成分的分离比对HPLCUPLC4.6250mm，5m2.150mm，1.7m1、提高分离速度、提高分离速度u小颗粒填料的速度优势小颗粒填料的速度优势 分离度分离度RSL/d
4、p，即保持，即保持L/dp，同比缩短柱长，同比缩短柱长,以提高分离速度以提高分离速度 提高流速小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度提高流速小颗粒填料的保持柱效，不降低分离度u提高速度的辅助手段提高速度的辅助手段温度温度不同色谱柱和温度的分离速度比对不同色谱柱和温度的分离速度比对2、提高分离度和灵敏度、提高分离度和灵敏度n提高提高L/dp（dp变小）提高柱效提高分离变小）提高柱效提高分离度对于4.6150mm，5m色谱柱，L/dp 30对于4.6150mm，1.8m色谱柱，L/dp 83.3 -改善分离度，保持分离速度对于4.6100mm，1.8m色谱柱，L/dp 55.6 -改善分离度，提高速度
5、分离度：颗粒对药物杂质分离的影响改善分离度和灵敏度四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）1、分离目标化合物：、分离目标化合物：根据中国药典（根据中国药典（2005年版）确定分离人参皂苷年版）确定分离人参皂苷Rg1、Re与与Rb1，结构如下：，结构如下：2、药典色谱条件、药典色谱条件样品：西洋参提取液样品：西洋参提取液仪器：仪器：Agilent 1100高效液相色谱系统高效液相色谱系统流动相：以乙腈为流动相流动相：以乙腈为流动相A，以，以0.1磷酸为流动相磷酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱，按下表进行梯度洗脱四、应用实例：西洋
6、参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）色谱柱：色谱柱：ZORBAX SB CZORBAX SB C1818 4.6 4.6150 mm150 mm，5m5m柱温：柱温：40 C 40 C 流速：流速：1.0 mL/min 1.0 mL/min 检测波长：检测波长：203 nm 203 nm 进样量：进样量：5L5L四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）HPLCHPLC色谱柱规格色谱柱规格:4.6 x150 mm:4.6 x150 mm，5m,(L/d5m,(L/dp p=3
7、0)=30)。根据根据L/dL/dp p值初步确定值初步确定RRLCRRLC色谱柱规格：色谱柱规格：4.6 x 50mm4.6 x 50mm，1.8m1.8m，(L/d(L/dp p2828）故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度故可以获得相近的分离效率，但分离速度大大提高，并且可以改善灵敏度。3、色谱柱的选择：、色谱柱的选择：四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）4、方法转换的初步参数确定、方法转换的初步参数确定在在Method TranslatorMethod Translator相应栏目中输入
8、原始相应栏目中输入原始HPLCHPLC条件，包括条件，包括HPLCHPLC色谱柱规格、进色谱柱规格、进样量、流速、梯度表等参数，并选择样量、流速、梯度表等参数，并选择RRLCRRLC色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱色谱柱的规格，即可获得根据洗脱柱体积相同原则折算而得的体积相同原则折算而得的RRLCRRLC分离的初步参数。分离的初步参数。五、方法优化：五、方法优化：由于人参皂苷由于人参皂苷Rg1、Re未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离未达到基线分离，可通过温度进一步优化分离四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）应用实例：
9、西洋参的液相色谱分析应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）6 6、RRLCRRLC色谱条件确定：色谱条件确定：RRLCRRLC色谱条件：色谱条件：Agilent 1200Agilent 1200高分离度快速液相色谱高分离度快速液相色谱(RRLC)(RRLC)，色谱柱：，色谱柱：ZORBAX SB C18 4.6x50mm,ZORBAX SB C18 4.6x50mm,1.8um1.8um流动相：流动相：A:0.1%H3PO4A:0.1%H3PO4，B:B:乙腈，乙腈，梯度分离梯度分离柱温：柱温：25C 25C 流速：流速：2mL/min 2mL/min 检测波长
10、：检测波长：203nm 203nm 进样量：进样量：5L5L四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）7、西洋参分析：、西洋参分析：HPLC与与RRLC分离色谱图比较分离色谱图比较n在在RRLC系统上可以实现系统上可以实现HPLC分离分离,此外还可以大幅度缩短分析时间，降低此外还可以大幅度缩短分析时间，降低溶剂消耗，大大提高工作效率。溶剂消耗，大大提高工作效率。n与与HPLC相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的相比，在保持相同进样量的前提下，使用小颗粒填料的RRLC可以显可以显著改善分离灵敏度。著改善分离灵敏度。n温度对温度对RRLC分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，分离影响较大，可通过调节温度改善分离度，或加快分离速度，节约时间节约时间四、应用实例：西洋参的液相色谱分析四、应用实例：西洋参的液相色谱分析(Agilent液相色谱仪）液相色谱仪）8、结论五、展望及结语五、展望及结语n填料粒径进一步减小增大柱效，进一步提高灵敏度和通量。n提高温度（流动相的粘度和温度成正比，适当的提高温度可进一步降低压力，同时温度升高有利于传质、加快吸附脱附平衡均可以带来柱效的进一步提高。但要注意安全性。）n总之，随着商品仪器的应用及逐渐推广，超高效液相色谱将成为复杂样品分析的一个强有力的工具。
