1、第九章第九章 噬菌体噬菌体 噬菌体噬菌体(Bacteriophage)又称细菌病毒又称细菌病毒(bacterialvirus)，具有其它病毒的共同特性。具有其它病毒的共同特性。在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体在自然界中分布广泛，土壤、空气、水中或生物体内都可存在。内都可存在。据噬菌体与宿主细胞的关系可分为据噬菌体与宿主细胞的关系可分为:烈性噬菌体（烈性噬菌体（virulent phage）温和噬菌体（温和噬菌体（temperate phage）据噬菌体的核酸类型、粒子形状和有无囊膜存在，据噬菌体的核酸类型、粒子形状和有无囊膜存在，可分为可分为12个科。个科。噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体
2、噬菌体噬菌体Electron micrograph of ssRNA phageMS2 attached to F pili.Virions attach along the length of the sex pilus via the maturation protein.主要存在于发酵工业。如乳制品、酶制剂、主要存在于发酵工业。如乳制品、酶制剂、氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和氨基酸、有机溶剂、抗生素、微生物农药和菌肥生产等。菌肥生产等。一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒一旦发生噬菌体污染，会导致发酵异常、倒罐罐,使工业生产遭到严重损失。使工业生产遭到严重损失。微生物发酵污染分
3、析微生物发酵污染分析(比例比例%)发酵产品发酵产品 空气系统空气系统 环境污染环境污染 设备设备 消毒操作消毒操作 管道管道 二级种子二级种子 味精味精 30.33 33.25 14.63 10.73 4.07 1.63 抗生素抗生素 11.13 33.85 19.96 9.64 25.39发酵液受噬菌体污染时出现：发酵液受噬菌体污染时出现：发酵周期延长发酵周期延长C源消耗缓慢源消耗缓慢发酵液变清，镜检有大量异常菌体发酵液变清，镜检有大量异常菌体发酵产物不形成或少发酵产物不形成或少敏感菌检查有噬菌斑敏感菌检查有噬菌斑电镜检查有噬菌体粒子电镜检查有噬菌体粒子1.不用可疑菌种不用可疑菌种2.环境卫
4、生环境卫生3.不排放或丢弃活菌液不排放或丢弃活菌液4.注意通气质量注意通气质量5.管道及发酵罐灭菌彻底管道及发酵罐灭菌彻底6.筛选抗性菌种筛选抗性菌种7.严格执行会客制度严格执行会客制度1.尽快提取产品尽快提取产品2.药物抑制药物抑制(金属螯合剂、表面活性剂等金属螯合剂、表面活性剂等)3.改用抗噬菌体生产菌株改用抗噬菌体生产菌株 在丙酮丁醇连续发酵的工业生产中，容易受到该噬在丙酮丁醇连续发酵的工业生产中，容易受到该噬菌体的侵染，危害极大。菌体的侵染，危害极大。常见的异常发酵有：常见的异常发酵有：发酵停止，不产生气泡，醪液上层澄清，呈暗发酵停止，不产生气泡，醪液上层澄清，呈暗黑色，出现睡眠症。黑
5、色，出现睡眠症。正常发酵正常发酵12-18h，丙酮产量可达，丙酮产量可达200mg/L，异常发，异常发酵时达到相同水平则需酵时达到相同水平则需36-42h，丁醇量也偏低，丁醇量也偏低，醪，醪液的蒸馏效率低于正常的液的蒸馏效率低于正常的10-20%。现分离获得的丙酮丁醇梭菌噬菌体为肌尾和长尾噬现分离获得的丙酮丁醇梭菌噬菌体为肌尾和长尾噬菌体科。菌体科。国内谷氨酸生产菌株国内谷氨酸生产菌株钝齿棒杆菌钝齿棒杆菌(T6-13)普遍发生噬菌体的污染，导致：普遍发生噬菌体的污染，导致：生产延滞或产酸降低，甚至倒罐，给味精生生产延滞或产酸降低，甚至倒罐，给味精生产造成较严重的损失。产造成较严重的损失。目前国
6、内分离的噬菌体在形态上相似。根据血目前国内分离的噬菌体在形态上相似。根据血清学可分成两型：清学可分成两型：B271和和B275，有四种类型的，有四种类型的噬菌斑。噬菌斑。预防：预防：轮换使用不同菌株，避免被迫停产。轮换使用不同菌株，避免被迫停产。苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌防治农林害虫防治农林害虫 生产过程中易受噬菌体的侵染，严重影响了生产过程中易受噬菌体的侵染，严重影响了细菌农药的生产和应用。细菌农药的生产和应用。苏云金芽孢杆菌噬菌体的特征：苏云金芽孢杆菌噬菌体的特征：头部为多面体，有颈部，尾部由尾管和尾鞘头部为多面体，有颈部，尾部由尾管和尾鞘组成。组成。苏云金芽孢杆菌噬菌体苏云金芽孢杆菌噬
7、菌体红霉素链霉菌噬菌体红霉素链霉菌噬菌体（Streptomyces erythreus phage）红霉素发酵液污染噬菌体后，往往在红霉素发酵液污染噬菌体后，往往在数小时至十几小时突然出现发酵液变数小时至十几小时突然出现发酵液变稀，氨态氮上升，稀，氨态氮上升，pH值升高，菌丝自值升高，菌丝自溶，细胞破碎，一般噬菌体数可达溶，细胞破碎，一般噬菌体数可达1010pfu/ml以上。以上。均为有尾噬菌体科。均为有尾噬菌体科。P13,P8和和P9 鉴定细菌的分型；鉴定细菌的分型；重要的实验工具和最理想的材料；重要的实验工具和最理想的材料；预防和治疗传染性疾病；预防和治疗传染性疾病；测定辐射剂量；测定辐射
8、剂量；检测植物病原菌；检测植物病原菌；筛选目的基因或检测基因产物的活性。筛选目的基因或检测基因产物的活性。细菌的感染治疗：细菌的感染治疗：用各种噬菌体的混合制剂局部外用或口服治疗用各种噬菌体的混合制剂局部外用或口服治疗因耐抗生素等而久治不愈的患者。因耐抗生素等而久治不愈的患者。如：术后绿脓杆菌感染、菌痢患者大肠杆菌感如：术后绿脓杆菌感染、菌痢患者大肠杆菌感染以及呼吸道的金黄色葡萄球菌感染。染以及呼吸道的金黄色葡萄球菌感染。肠道菌噬菌体：伤寒菌、痢疾菌、肠球肠道菌噬菌体：伤寒菌、痢疾菌、肠球菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、链球菌和葡萄球菌等噬菌体。链球菌和葡萄
9、球菌等噬菌体。存在于患者的粪便、医院污水、临床标存在于患者的粪便、医院污水、临床标本及外科病房脓液等。本及外科病房脓液等。单价噬菌体：单价噬菌体：只能寄生在一个只能寄生在一个“变种变种”的细菌细胞上，甚的细菌细胞上，甚至至 只能在一定的菌株上寄生只能在一定的菌株上寄生 例：水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌的检验例：水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌的检验应用噬菌体检验原核微生物应用噬菌体检验原核微生物种子脱壳、磨碎种子脱壳、磨碎6g颖壳颖壳+25ml 0.1%蛋白胨水蛋白胨水,4浸泡浸泡30min低速离心低速离心30min，留沉淀，留沉淀2ml转三角瓶中振荡转三角瓶中振荡5min,+0.2ml(10
10、9pfu/ml)噬菌体噬菌体30振荡吸附振荡吸附10min+2ml 抗血清中和抗血清中和5min 立即立即+16ml蛋白胨水稀释蛋白胨水稀释适当稀释在含指示菌适当稀释在含指示菌的培养基培养的培养基培养12h,计数计数pfu与对照比较与对照比较定性或定量定性或定量 由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用由于噬菌体的结构比细菌和高等细胞简单，故广泛用于复制、转录和调节机理的研究。而于复制、转录和调节机理的研究。而噬菌体在分子克噬菌体在分子克隆中扮演着重要角色。隆中扮演着重要角色。噬菌体以噬菌体以前噬菌体前噬菌体方式存在于方式存在于E.coli K12株系中，利株系中，利用紫外线诱导可以释放
11、用紫外线诱导可以释放噬菌体，可感染已经丧失了噬菌体，可感染已经丧失了噬菌体的噬菌体的E.coli株系。株系。噬菌体具有：噬菌体具有：-DNA可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌；可在体外包装成病毒颗粒，高效感染大肠杆菌；可把可把25Kb长的外源长的外源DNA插入插入-DNA，引入受体细胞；，引入受体细胞；重组重组-DNA的筛选和保藏较易，常作为分子克隆载体。的筛选和保藏较易，常作为分子克隆载体。噬菌体在大肠杆菌中繁殖有两条途径：噬菌体在大肠杆菌中繁殖有两条途径：裂解生长裂解生长 整合到宿主染色体中复制。整合到宿主染色体中复制。Escherichia coli Phage 一种一种基因表达基
12、因表达和和表达产物表达产物亲和选择相结合的技术。亲和选择相结合的技术。以经过改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌以经过改建的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因体外壳蛋白质基因pIII或或PVIII 区，从而使表达的区，从而使表达的外源肽显露在噬菌体颗粒的表面外源肽显露在噬菌体颗粒的表面，并使表达产物呈，并使表达产物呈现良好的现良好的空间构型空间构型、由此提供可用亲和免疫纯化法、由此提供可用亲和免疫纯化法筛选表达特异肽的噬菌体，并通过测定插入的筛选表达特异肽的噬菌体，并通过测定插入的DNA序列，推断所表达目的基因的氨基酸序列。序列，推断所表达目的基因的氨基酸序列。用活的噬菌体方便
13、而高效地筛选目的基因，或检测用活的噬菌体方便而高效地筛选目的基因，或检测基因产物的活性。基因产物的活性。构建噬菌体展示文库构建噬菌体展示文库以一组随机多肽编以一组随机多肽编码序列或基因群体插入噬菌体展示载体。码序列或基因群体插入噬菌体展示载体。(每每个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链个噬菌体粒子只展示一种序列的外源肽链)筛选筛选亲和选择方法挑选出带有外源基因亲和选择方法挑选出带有外源基因的重组噬菌体的重组噬菌体 扩增扩增再感染再感染E.coli。用于抗体基因文库、用于抗体基因文库、cDNA文库、随机多肽文库、随机多肽基因文库和突变基因文库构建基因文库和突变基因文库构建/筛选等研究筛选等研究
14、兴于兴于1990S初，简化了抗体库构建及单克隆抗体的初，简化了抗体库构建及单克隆抗体的筛选过程，很快应用于筛选过程，很快应用于人工抗体制备人工抗体制备，并迅速扩展，并迅速扩展到生物学等其他许多领域。到生物学等其他许多领域。一般使用一般使用丝状噬菌体丝状噬菌体，外源基因插入到噬菌体展示，外源基因插入到噬菌体展示载体上，使其与编码噬菌体外壳蛋白基因相连，从载体上，使其与编码噬菌体外壳蛋白基因相连，从而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融而使外源基因编码的多肽或蛋白质与外壳蛋白以融合蛋白形式展示在噬菌体表面，被展示的多肽蛋白合蛋白形式展示在噬菌体表面，被展示的多肽蛋白可保持相对独立的空间结构和生物活性。可保持相对独立的空间结构和生物活性。E.coli filamentous Phage fd 本章要点本章要点 噬菌体的一般形态噬菌体的一般形态 噬菌体的危害与应用噬菌体的危害与应用 噬菌体展示技术噬菌体展示技术
