1、 Western blot Western Blot印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNADNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。埃德温迈勒萨瑟恩（Edwin Mellor Southern）是什么？是什么？DN
2、A重组技术siRNA的转染技术表观遗传学（甲基化，miRNA）凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到凡是涉及蛋白水平检测的研究，均可运用到western blotwestern blot技术技术能做什么？能做什么？n为什么要作蛋白质印迹实验？为什么要作蛋白质印迹实验？q研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中在样品当中q蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。Western Western Blot基本原理
3、基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Western Blot Western Blot 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电
4、泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。既可以定性，又可以半定量的Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。E E3.SDS-PAGE电泳电泳原理：原理：SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用.大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(charge
5、density),所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素Western Blot 的具体步骤-滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜滤纸滤纸+主要试剂 制胶用（1-6）：1.1.0mol/L TrisHCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g 蒸馏水 100ml 溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。2.1.5mol/L TrisHCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.671g 蒸馏水 100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。3.10SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 如溶解困难，可在50水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现
6、沉淀，水浴溶化后，仍可使用。4.10过硫酸胺（AP）过硫酸胺 0.1g 蒸馏水 1ml （现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4保存，保存时间为1周）5四甲基乙二胺原液（TEMED）：4C保存。630%丙稀酰胺：4C保存。下层胶 依次加入 去离子水 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5M Tris-HCl（pH8.8）3.8ml10%SDS 150l10%AP 150lTEMED 6l5%上层胶 依次加入 去离子水 4.1ml30%丙烯酰胺 1ml1M Tris-HCl（pH6.8）0.75ml10%SDS 60l10
7、%AP 60l TEMED 6l 75X电泳液缓冲液 Tris（MW121.14）15.1g 甘氨酸（MW75.07）94g SDS 5.00g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。810X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07）151.1g Tris（MW121.14）30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）910XTBS缓冲液 Tris（MW121.14）24.2g NaCl 80.0g
8、蒸馏水至 1000ml（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。101XTBST缓冲液10XTBS缓冲液 100ml 蒸馏水 900mlTween-20 1 ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：1XTBST缓冲液 95-100 ml 脱脂奶粉 5g 溶解后4保存，可于一周内使用。其他试剂 一抗、二抗、显影液、定影液、ECL化学发光试剂 A 和 B 两种试剂Western Blot 的具体步骤3.SDS-PAGE电泳电泳 凝胶成份：凝胶成份：丙烯酰胺N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS过硫酸铵TEMED
9、H2O仪器：仪器：电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris-甘氨酸溶液Western Blot 的具体步骤3.SDS-PAGE电泳电泳 1.制胶需紧密固定！Western Blot 的具体步骤3.SDS-PAGE电泳电泳 2.上样 每孔上样量为20-50 g蛋白；根据目的蛋白的表达情况的不同而有所变化。Western Blot 的具体步骤3.SDS-PAGE电泳电泳 3.电泳电泳条件：推荐：浓缩胶 80V 3545min 分离胶 120V 4575minWestern Blot 的具体步骤3.SDS-PAGE电泳电泳 考马斯亮蓝染胶考马斯亮蓝染胶转膜转膜Western Blot实验实验SDS-PAGE
10、电泳实电泳实验验SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色Western Blot 的具体步骤4.转膜转膜 原理：原理：蛋白因结合SDS而带电荷，转膜即在电场作用下从胶中转至膜上的过程。Western Blot 的具体步骤4.转膜转膜 半干转半干转湿湿 转转半干式转膜速度快，适合与小分子量蛋白湿式成功率高并特别适合用于分子量大于 100KD的蛋白两种方法的转膜液不同！方法方法仪器仪器特点特点Western Blot 的具体步骤4.转膜转膜 表5 PVDF膜、NC膜、尼龙膜特点比较Western Blot 的具体步骤4.转膜转膜 转膜准备制作“三明治”Western Blot 的具体步骤4.转膜转膜 W
11、estern Blot 的具体步骤4.转膜转膜 转膜条件：推荐：100V，12小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。Western Blot 的具体步骤5.转膜后检测：（转膜后检测：（立春红染色）立春红染色）1x立春红5min染色前染色后Western Blot 的具体步骤6.封闭封闭 封闭条件：4C摇动，封闭1 hour，再用 TBST洗5秒，进入下一步抗体的孵育。为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，常用的封闭液：脱脂奶粉（5）BSA（5）Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）不能用于磷酸化蛋白！Western Blot 的具体步骤7
12、.免疫反应免疫反应 1.按照抗体说明书建议的稀释倍数，用TBST稀释抗体；2.抗体孵育时间：室温下孵育12h或4过夜（一般不超过18小时）；3.保持适当的摇动使抗体与膜的结合均匀；Western Blot 的具体步骤7.免疫反应免疫反应 摆床上，二抗杂交，室温（25左右）1h，或4过夜。PBST(TBST)洗涤3次，每次10分钟。上二抗上二抗Western Blot 的具体步骤7.免疫反应免疫反应 不同二抗稀释浓度的效果图Western Blot 的具体步骤8.显色（结果检测）显色（结果检测）显色方法显色方法代表类型代表类型特点特点酶促底物发光法 DAB显色法稳定性好，灵敏度较高（250pg）
13、，背景一般，成像性较差，药品疑有一定致癌性。化学发光法（推荐使用）ECL发光法稳定性好，灵敏度高（10-12g），背景可以很低，成像性好，且可以重复标记，暗室操作！Western Blot 的具体步骤8.显色（结果检测）显色（结果检测）A液B液11:膜混合ECL工作液滴加ECL工作液 显影、定影n蛋白样品的制备nSDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳l转膜l封闭l一抗杂交l二抗杂交l底物显色 Western Blot（一）蛋白样品制备 （二）蛋白含量的测定 Western Blot1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。We
14、stern Blot 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）Western Blot2、按前面方法配 10分离胶，加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用 10ml 枪吸取 5ml 胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）Western Blot3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等 3min 使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干
15、。Western Blot4、配4 的浓缩胶,加入TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。Western Blot 5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）Western Blot7、加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小
16、玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。Western Blot电泳时间一般45 h，电压为40V 较好，也可用 60V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。Western Blot Western Blot Western Blot（1）转一张膜需准备 6 张7.08.3cm 的滤纸和1 张7.38.6cm 的硝酸纤维素膜。切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸
17、2 h 才可使用。（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。Western Blot（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和 浸过的膜。（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以 擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫 三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去 其中的气泡。Western Blot（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动
18、作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 3 张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）Western Blot（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面
19、，夹的白面对槽的红面。转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用 60V 转移2 h 或40V 转移 3 h。Western Blot1封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。Western Blot2结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张39cm2膜约需2ml一抗稀释液。反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，
20、注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。Western Blot3洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。Western Blot4结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:10001:10000），室温轻摇一小时。5洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST Western Blot六）化学发光，显影，定影 （1）将
21、A 和 B 两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min 后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min 后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入 X-光片夹中。（2）在暗室中，将1显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X光片,用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）；打开X-光片夹，把 X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号 的强弱适当调整曝光时间，一般为1min 或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间一般为 12min （2025），温度过低时（低于 16）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 510min，以胶片透明为止；用自来水冲残留的定影液后，室温下晾干。应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。
