1、第六章 人工种子的研制 第一节 人工种子概述 一、人工种子的概念及发展Murashige（1978）首次提出人工种子（artificial seed）的概念。最初人工种子是指人工种皮（胶囊）包裹单个发育良好的体细胞胚胎（即具有发育成完整植株的能力），适量的人工胚乳及其它成分，使之像种子一样，可以在田间播种萌发。Kitto等（1981）首次用聚氧乙烯包裹胡萝卜胚状体制成人工种子。自Bapat等（1987）首次报道桑树对腋芽包裹、贮藏和萌发以来，人工包裹的繁殖体不一定局限于体细胞胚胎，可以是顶芽、腋芽、带有顶芽或腋芽的微切段、小鳞茎、原球茎、不定芽、花粉胚、小植株等，也可以是未完全分化的拟分生组织
2、、细胞团或愈伤组织等，人工种子的概念已较为宽泛，如以腋芽为材料的作物有烟草、花叶芋、蕹菜、桑树、姜、香蕉、甘薯等。Kamada（1985）就将用人工种膜胶囊包裹能发育成植株的一个培养物、组织块或器官都称为人工种子。以芽等类体胚材料制成的人工种子变异程度低、萌芽率及成苗高，尤其是对于一些木本植物难以获得数量多、质量高的体细胞胚胎，因而具有更大的优越性。人工种子又称为合成种子（synthetic seed）、人造种子（man-made seed）、无性种子或体细胞种子（asexual seed或somatic seed）等。从人工种子的包裹方法、包裹内容及播种方法角度，人工种子分为广义和狭义两种。
3、.狭义的人工种子是指将组织培养中产生的胚状体包裹在含有养分和有保护功能的物质中，能在一定条件下发芽成苗的颗粒体。广义的人工种子研制包括以下几种情况：（1）经或不经干燥处理，不经包裹成球状结构而直接播种的体细胞胚。Gray（1987）报道将鸭茅的体细胞胚干燥，使其水分含量为13%，可播种萌发。（2）用聚氧乙烯等多聚物将多个体细胞胚胎包裹成的饼状物。如Kitto和Janick（1982）用聚氧乙烯包裹胡萝卜胚性悬浮物（包含细胞、细胞团、愈伤组织块及成熟胚状体），有3%包裹的干燥体细胞胚存活。（3）将体细胞胚胎混在胶中，用流质播种法直接播种。如Baker（1985）将胡萝卜体细胞胚与蔗糖、激素及流体
4、胶混合播种。（4）用凝胶包裹顶芽、腋芽或小球（体）茎制成球形人工种子。Redenbaugh等（1986）用海藻酸钠水凝胶法包裹苜蓿单个体细胞胚，播种于温室，成株率可达20%。典型的人工种子由人工种皮、人工胚乳和胚状体（或芽）三部分组成（图6.1）。最外层为人工种皮，要求质地柔软，能保护内部的体细胞胚胎，使人工种子能经得起生产、贮存、运输和种植过程中的机械碰撞，并且不能对胚胎有毒害作用。中间为人工胚乳，人工胚乳应含有营养物质、生长调节物质（加植物激素），以及其他发芽和植物初期生长所需的成分，人工胚乳应能控制营养成分逐渐释放。还可在人工胚乳中加入一些促进生长的微生物、农药、抗生素等，使体细胞胚胎能
5、在不灭菌的土壤中萌发和健康生长。最内侧为体细胞胚或芽，体细胞胚应发育正常，表型一致。人工种子应易于播种，使种植者容易接受等。图6.1 人工种子及其萌发。左图为人工种子示意图（Redenbaugh，1990），中图为用海藻糖包裹胚状体制成的芹菜人工种子，右图为水稻人工种子的发芽 二、人工种子的研制的意义二、人工种子的研制的意义（一）繁殖产生人工种子速度快、数量多、效率高。例如用液体培养基方法在1升培养基中可产生10万个体细胞胚胎，而在一个体积为12升的发酵罐中，20多天内生产的胡萝卜体细胞胚可制成1000万粒人工种子。与微繁殖一样，它不受季节气候和空间的限制，可全年进行，具有占空间小，快速、高效
6、等优点。（二）与微繁殖一样，人工种子属无性繁殖，不存在基因型和表现型的分离，非常适于固定和繁殖杂种（尤其是需三系配套生产的杂种一代）及雄性不育系、优良单株、突变体及遗传工程筛选出的优良基因型等。另外，对一些珍稀名贵品种或经济价值较高的品种、不能产生种子、种子发育不全、或自然条件萌发率极低的植物，以及存在较长的幼年期（或童期）的木本树种等也具有重要的应用前景。（三）人工种子内可以加入农药、菌肥或有益微生物及激素等，改善和调节植物的抗逆能力和生长发育。（四）利用体细胞胚胎发生途径可进行基因转移，因此人工种子可作为遗传工程的受体或向生产实践应用的桥梁。（五）与试管快繁相比，人工种子操作方便，便于运输
7、、贮存及机械化作业，节省劳动力和生产成本。这对快繁苗木及人工造林等方面具有很大的应用优势。第二节第二节 人工种子生产的程序和技术人工种子生产的程序和技术一、人工种子生产的程序和技术 人工种子生产的程序和技术如图6.2。其关键技术包括植物大规模体细胞胚胎发生、体细胞胚胎生长发育的同步化、体细胞胚胎的成熟、单个体细胞胚胎的分离、体细胞胚的包裹及人工胚乳研制、人工种子的贮藏和转换等几个重要环节。图6.2 人工种子生产的程序和技术（一）大规模体细胞胚胎发生 体细胞胚胎可从器官外植体、愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体及花粉等产生。主要针对大规模体细胞胚胎发生的各种条件进行研究，如外植体选择，在培养基中附
8、加植物激素（种类、浓度和组合）、氮源（种类和浓度）、氨基酸、椰子汁、活性炭等物质，培养步骤（一步法或两步法）和培养方法（液体或固体培养）等。目前，能够进行大规模体细胞胚胎发生的植物种类有限。人工种子主要使用二倍体体胚，单细胞的花粉胚会存在遗传分离和不育等问题。胚状体发生若采用两步法，即经愈伤组织培养后间接体细胞胞胚胎发生途径，容易产生体细胞无性系变异。不经愈伤组织培养阶段，直接从外植体上诱导体细胞胚胎，又不能利用发酵罐进行大规模体细胞胚胎发生，产生的数量有限。另外，在体细胞胚胎发育过程中，还会出现胚状体的早熟或提早萌发，或形成次生胚，或形成畸形胚或发育不完全胚等问题。因此通对培养基成分和体外培
9、养条件的控制，探索大规模体细胞胚胎发生的最适培养基、培养条件和培养方法仍然是一个主要的问题。图6.3 大规模胡萝卜体细胞胚胎发生。左图为对细胞悬浮培养所用的旋转-过滤生物反应器；中图为部分生长在反应器内的胡萝卜体细胞胚胎群体；右图为整齐一致的胡萝卜体细胞胚胎 图6.4 芹菜下胚轴培养产生大量体细胞胚（左）及包埋后的人工种子（右）（二）体细胞胚胎生长发育的同步化（二）体细胞胚胎生长发育的同步化 在培养中胚状体的发生往往是不同步的，常常在同一外值体上可以观采到不同发育时期的大大小小的胚状体。胚状体发生的不同步性，为人工种子的研究带来麻烦。体细胞胚胎生长发育的同步化有以下几种：（1）在细胞培养中加入
10、细胞分裂和DNA合成的选择抑制剂如五氨基尿嘧啶等，或采用低温处理和营养物质饥饿法等措施抑制细胞分裂，然后除去抑制剂或抑制条件，细胞可进行同步分裂，从而达到体细胞胚胎发生的同步化。另一方面，在细胞培养液中通入乙烯或氮气可提高分裂细胞所占的比例。（2）利用一定孔径的筛网过滤分选或仪器分选，或Ficoll溶液中密度梯度离心选择胚性细胞团，然后转移到胚胎发育培养基上进行同步发育。（3）利用不同发育阶段的体细胞胚胎对渗透压的不同要求，通过调节渗透压来控制体细胞胚胎同步发育到某一阶段。（三）体细胞胚胎的成熟（三）体细胞胚胎的成熟植物体细胞胚胎发育经历类似于合子胚发育过程。植物体细胞胚或花粉胚发育过程也可明
11、显分为幼胚和成熟胚，只有成熟胚才能在成苗培养基上形成完整小植株。解剖学观察表明，幼胚发育开始即有明显的极性，它们仅具有器官分化的潜力，但还没有器官原基。从幼胚转变为成熟胚的重要标志是器官分化的逐步完成。顶芽和真叶的形成是十分重要的。在草本植物中从幼胚发育为成熟胚的过程很快，所需营养条件也无明显差异，而在木本植物中由幼胚至成熟胚的过程要更换几次相同的或不相同的培养基，才能使整株诱导率有所提高。采用4低温处理对有些植物的体细胞胚胎成熟具有明显的促进作用。除利用解剖观察外，人们现在通过生化和分子标记来同工酶电泳谱带鉴定筛选成熟胚。人工种子研制中获得高质量的体细胞胚胎是十分重要的，这不仅是指体细胞胚要
12、发育正常同步、成熟整齐一致，也要遗传稳定，成株率高，避免采用畸形胚及发生体细胞无性系变异。高质量的体细胞胚胎通常发育完全，具有明显的胚根和胚芽双极性结构，生长健壮，下胚轴不膨大，无愈伤组织化，发育同步性程度高，经分选后大小基本一致，播种后能及时萌发出苗，根与芽几乎同时生长，萌发及成苗整齐、正常、无畸形，具有一定抗逆性，成活力高等。如利用腋芽作为包裹材料时，应注意芽之间的异质性，应选择发育良好的成熟的可萌动的芽，除去休眠芽及发育不良的芽。（四）单个体细胞胚胎的分离 在单个体细胞胚胎包裹这前，可利用机械切割或在2%蔗糖溶液中浮力不同分级筛选1.0 mm长度或以上的单个体细胞胚。（五）体细胞胚的包裹
13、及人工胚乳研制（五）体细胞胚的包裹及人工胚乳研制 1.胶囊和胶囊膜制备胶囊和胶囊膜制备材料人工种子研制所用的包裹材料（有时也称为人工种皮或内种皮）要求质地柔软，能保护内部的体细胞胚胎并且不能对胚胎有毒害作用，另外要求通气效果好，能形成胶囊，抗压性好，不粘连，适于贮藏、运输和播种。常用的包裹材料有藻酸盐、藻酸盐-明胶、琼脂糖、琼脂等，但由于藻酸盐胶凝性好、使用方便、无毒性和价格低廉，目前以藻酸盐应用较多。Redenbaugh等（1986）采用海藻酸钠作包裹材料，制成苜蓿人工种子，离体成株率达86%，播种于温室，成株率可达20%。虽然海藻酸钠应用较广，但以海藻酸钠单一材料包埋体细胞胚及类体胚材料也
14、存在不少缺点，如保水性差、水溶性成分及助剂易渗漏、易干燥失水、干燥后不能吸水回胀、易粘连、机械强度差，从而影响到人工种子的贮藏、运输、播种和萌芽。许光学等（1990）采用纤维素衍生物与海海藻酸钠制成复合改性的包埋基质，可提高包裹材料的透气性。黄绍兴等（1995）用木薯淀粉与海海藻酸钠制成复合包埋基质，可改善海海藻酸钠的吸水性。Timber等（1995，1996）在海海藻酸钠中加入多糖、树胶、高岭土等可减慢凝胶脱水的速度。日本麒麟啤酒公司与美国植物遗传工司（PGI）联合研制成一种新的包埋胶胶衣，可在一定条件下自行裂开，顺利萌发。由于单一包裹材料存在的缺陷，因此许多研究者对胶囊膜材料（外种皮）进行
15、了试验，但只有Elvax 4260效果较好。Ling-Fong Tay（1993）年用壳聚糖作为外种皮制作油菜人工种子。除涂复外膜外，许多研究者还采用组合包埋法、流体播种法、液胶包埋法、琼脂或铝胶囊等包埋法等新的方法。许光学等（1990）筛选聚合物材料对人工种子进行包埋。George等（1995）用硅胶包埋谷子体细胞胚，萌发率达82%，在4条件下贮藏14天可自行裂开萌发。胶囊和胶囊膜制备方法 胶囊制备法有点滴胶体络合法（gel complexation via a dropping procedure）和铸模法（molding）。下面以Redenbaugh等（1986，1990）用2%海藻酸钠
16、对苜蓿的体细胞包裹介绍一下用点滴胶体络合法进行的胶囊制备法方法。首先将体细胞胚放入2海藻酸钠点滴中，然后将海藻酸钠包裹的体细胞胚圆滴滴入适量的二价或三价的金属盐（如100 mM硝酸钙），通过离子交换反应，表面的络合作用立即开始，点滴在1530分钟内可形成胶囊，但不同络合时间对多少胶囊凝固及胶囊的硬度有影响。胶囊的大小可以通过改变滴出藻酸盐点滴的吸管或漏斗出口内径来控制，制作直径约5 mm的胶囊，可选用内径为4.0 mm毫米的吸管口（图6.5）。胶囊膜制备时，首先将0.1 g葡萄糖和0.2 ml甘油放入2 ml氢氧化钙溶液，再加入4 g藻酸钙胶囊，搅拌一分钟，这样可改变藻酸盐胶囊表面特性，形成弱
17、亲水性的表面。另外，配制Elvax 4260聚合溶液（先制备好50 ml环乙烷，其中含有10的Elvax 4260。将5 g硬脂酸、10 g鲸蜡醇、25 g鲸蜡替代物在40的条件下混合在一起，然后将配制的溶液与含有Elvax 4260的295 ml石油醚和155 ml二氯甲烷混合在一起，制成Elvax 4260聚合溶液），将胶囊小心地浸入热的Elvax 4260聚合溶液中1至6次，每次浸10秒钟，每次浸入之前，要将胶囊用流动的暖风吹干，干了后再浸第二下。这样Elvax 4260聚合溶液凝结在藻酸盐胶囊的周围，形成一层疏水外皮。最后用石油醚清洗胶囊，然后吹干即可。图6.5 用漏斗分离器生产藻酸钙
18、包裹体 2.人工胚乳的研制人工胚乳的研制 人工胚乳对人工种子提高成苗率至关重要。研究表明，即使无胚乳植物苜蓿体细胞胚的包裹材料中不加任何东西，成苗率也为零。大量元素、碳水化合物如淀粉、粗制藻酸盐和蔗糖等用来研究作为人工胚乳的材料。目前采用两条技术途径来研究人工胚乳，一条是在凝胶囊中加入碳水化合物，另一条是微型包裹养分，使其在人工种子内有控制地释放。Redenbaugh（1990）研究表明，在苜蓿人工种子包裹材料中加入1/2 SH成分，以小麦淀粉或粗制藻酸盐作为碳源可提高成苗率。另外，也研究了利用溶剂蒸发法和络合凝聚法对蔗糖进行包裹成微胶囊，风干后放入藻酸盐胶囊内或表面的方法，但效果并不理想。黄
19、绍兴等（1995）利用木薯淀粉与1.5%海藻酸钠（1/2MS培养基配制）混合制作胚乳。在人工胚乳中加入赤霉素可能有利于人工种子的萌发，加氯化钙有利于供氧，加活性炭有利于营养固定的缓释等。为了能在有菌土壤中播种，人工胚乳还可加入防腐剂、抗生素、农药、有益细菌等。（六）人工种子的贮藏 人工种子的贮藏是人工种子应用农林生产的一个十分重要的问题，也是难题之一。目前对人工种子的贮藏的方法有低温法、干燥法（或干化处理法）、抑制剂法、液体石蜡法及这些方法的组合，以干燥法与低温法结合应用最多。在干化处理前用ABA预处理可提高胚状体的干化耐受性和存活率。高浓度的蔗糖预处理、脯氨酸等也可提高胚状体的干化耐受性。（
20、七）人工种子的转换 人工种子在一定条件下萌发和生长成完整植株称为转换（transformation）。可以将人工种子播种在无菌培养基（如1/4 MS+1.5%麦芽糖+8 g/l琼脂）上，也可将人工种子直接播种在蛭石、珍珠岩（附加1/6 MS+0.75%麦芽糖可提高转换率），甚至土壤中，测定其转换率。转换率高低既与体细胞胚质量好坏有关，也与人工种子中包含的营养成份或施加的营养成分有关。二、问题与展望二、问题与展望 人工种子研制已进行了二十多年，但有关人工种子生产的各个环节如植物大规模体细胞胚胎发生、体细胞胚胎生长发育的同步化、体细胞胚胎的成熟、单个体细胞胚胎的分离、体细胞胚及人工胚乳的包裹、人工种子的贮藏等问题仍然有待突破，目标是提高成人工种子的成苗率、延长人工种子的贮藏时间、人工胚乳营养的有效性和缓释性。另一方面，为了大批量生产，机械化生产的工艺流程也应加以研究。从经济方面而言，人工种子成本远高于自然种子，真正具有应用价值的植物应该是多年生或无性繁殖植物，但这类植物（多为木本植物）在组织培养方面存在困难，难以获得数量众多的高质量的体细胞胚胎。尽管如此，人工种子的研制仍然前景光明，并引起更多研究者的重视，相信不远的将来人工种子会从实验室研制走向商业化生产。
