1、Chapter 5 Immobilized enzyme and cell固定化酶和细胞固定化酶和细胞酶应用过程中的一些不足酶应用过程中的一些不足n酶的稳定性较差酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。n酶的一次性使用酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。n产物的分离纯化较困难产物的分离纯化较困难：酶反应后成为
2、杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。固定化技术固定化技术Contents of chapter 5-1 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化 1、什么是固定化技术和固定化酶2、固定化酶的研究历史3、酶的固定化技术4、固定化酶的特点GoGoGoGo5、细胞、原生质体的固定化 固定化生物技术固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。复利用。1.1.酶酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。机溶剂对
3、其有影响）。2.2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.3.分离纯化困难。分离纯化困难。游离酶的缺点：游离酶的缺点：固定化酶和固定化细胞的定义及特点固定化酶和固定化细胞的定义及特点 固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)被局限在某一特定区域上的、并且保被局限在某一特定区域上的、并且保留了它们的催化活力，可以反复、连续使留了它们的催化活力，可以反复、连续使用的酶。用的酶。5.1 5.1 酶与细胞的固定化酶与细胞的固定化什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性
4、酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术优点：优点：(1)(1)可提高稳定性可提高稳定性。(2)(2)能回收，能回收，易与产物分离，易与产物分离，可反复使用。可反复使用。缺点：缺点：(1)(1)存在扩散限制。适于催化小分子物质存在扩散限制。适于催化小分子物质。(2)(2)酶活性下降酶活性下降。2.2.固定化细胞（固定化细胞（immobilized cellimmobilized cell）固定在载体上并在一定空间范围内进行固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。优越性：优越性：(1)(1)降低成本降低成本，省去酶的
5、分离纯化工作，省去酶的分离纯化工作;(2)(2)既既可作为单一酶，也可作可作为单一酶，也可作为为复合酶系复合酶系 完成部分代谢过程。完成部分代谢过程。局限性：局限性：(1)(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。产物。(2)(2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。作用。3.3.固定化原生质体固定化原生质体 意义意义：(1)(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。胞内产物的分泌。(2)
6、(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高由于载体的保护作用，稳定性提高。n制备固定化酶的依据制备固定化酶的依据1.1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。能力和常温、常压下能起催化反应等特点。2.2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。3.3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。常有一定的机械强度。4.4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶
7、液的活性。即固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。要保护活性中心基团。5.5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。量。具有最小的空间位阻。6.6.固定化酶应有最大的稳定性。固定化酶应有最大的稳定性。7.7.固定化酶应易与产物分离。固定化酶应易与产物分离。n固定化酶的研究从固定化酶的研究从50年代开始，年代开始，1953年德国的年德国的 Grubhofer和和Schleith采用采用聚氨基苯乙烯树脂聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。酶
8、、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。n60年代后期，固定化技术迅速发展起来。年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产氨基酸连续生产L-氨基酸氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。，实现了酶应用史上的一大变革。n在在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。5.2 固定化酶的研究历史n随着固定化技术的发展，出现随着固定化技术的发
9、展，出现固定化菌体固定化菌体 。19731973年，日年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。n在固定化酶和固定化菌体的基础上，在固定化酶和固定化菌体的基础上，7070年代后期出现了年代后期出现了固定化细胞固定化细胞技术。技术。19761976年，法国首次用固定化酵母细胞年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，生产啤酒和酒精，19781978年日本用固定化枯草杆菌生产淀年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。粉酶，开始了
10、用固定化细胞生产酶的先例。n19821982年，日本首次研究用年，日本首次研究用固定化原生质体固定化原生质体生产谷氨酸，生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。变革提供了新的方向。5.3 5.3 酶固定化技术酶固定化技术n活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需
11、要在非常严密的条件下进行。化酶时，需要在非常严密的条件下进行。n功能基团功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合不参与酶的固定化结合n酶的高级结构酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进
12、行。此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化酶操作的注意事项固定化酶操作的注意事项 5.3 5.3 酶固定化技术酶固定化技术固定化方法固定化方法酶的固定化方法酶的固定化方法 吸附法吸附法 结合法结合法 交联法交联法 包埋法包埋法网格型网格型微微囊型囊型共价键共价键结合法结合法离子键离子键结合法结合法 1 1、吸附法、吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。定化的方法。常用的固体吸附剂有常用的固体吸附剂有活性炭、活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石
13、玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。等。操作简便，条件温和，不会引操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。且可反复使用。由于靠物理吸附作用，由于靠物理吸附作用，结合力结合力较弱较弱，酶与载体结合不牢固而容易，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。脱落，所以使用受到一定的限制。优点：优点：条件温和，操作条件温和，操作简便，酶活力损失少。简便，酶活力损失少。缺点：缺点：结合力弱，易解结合力弱，易解吸附吸附。2、结合法、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。键与酶结
14、合在一起的固定化方法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有剂。常用的有DEAE-DEAE-纤维素纤维素、TEAE-TEAE-纤维素纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶等。等。共价键结合法共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共
15、价键结合法所采用的载体主要有：合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素纤维素、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶、葡聚糖葡聚糖凝胶凝胶、甲壳质甲壳质、氨基酸共聚物氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物甲基丙稀醇共聚物等。等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化载体活化。第一个离子结合法固定化酶：第一个离子结合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：第一个工业化的固定化
16、酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶固定化氨基酰化酶 借助共价借助共价键将酶的活性键将酶的活性非必需侧链基非必需侧链基团和载体的功团和载体的功能基团进行偶能基团进行偶联。联。共价结合法（共价结合法（covalent binding covalent binding or covalent couplingor covalent coupling）1 1）载体：）载体：亲水载体优于疏水载体亲水载体优于疏水载体 如如:天然高分子衍生物天然高分子衍生物:纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差亲和性好，机械性能差 琼脂糖琼脂糖 合成聚合物：合成聚合物：聚丙烯酰胺聚
17、丙烯酰胺 聚苯乙烯聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构机械性能好，但有疏水结构 尼龙尼龙 使载体活化的方法很多，主要使载体活化的方法很多，主要的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。法、烷基化法等。优点：优点：酶与载体结合牢固，不会轻酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。易脱落，可连续使用。缺点：缺点：反应条件较激烈，易影响酶反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。的空间构象而影响酶的催化活性。3 3、交联法、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法定
18、化酶的方法。戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（应，形成席夫（SchiffSchiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。化酶或固定化菌体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。交联法制备的固定化酶或固定化菌体交联法制备的
19、固定化酶或固定化菌体结合牢固结合牢固，可以长时间使用。，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶酶活力损失较大活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小颗粒较小，给使用带来不便。为此，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短以取长补短。常用的双功能试剂有戊二醛、常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。
20、戊二醛。酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶本章目录 缺点：缺点：(1)(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。被交联，酶活力损失大。(2)(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。带来不便。4.4.包埋法（包埋法（entrapmententrapment）将酶用物理的方法将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚包埋在各种载体（高聚物）内。分为：物）内。分为：网格型：网格型：
21、将酶包埋在高将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型：微囊型：将酶包埋在高将酶包埋在高分子半透膜中。分子半透膜中。1）网格型包埋法网格型包埋法（gel(latticgel(lattic)entrapment)entrapment）又称凝胶包埋法又称凝胶包埋法凝胶凝胶包埋条件包埋条件 酶活性酶活性强度强度天然凝胶天然凝胶琼脂、海藻酸钙、琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶、明胶角叉菜胶、明胶温和温和不变不变差差合成凝胶合成凝胶聚丙烯酰胺、光聚丙烯酰胺、光交联树脂交联树脂聚合反应聚合反应 部分失活部分失活 高高使用的多孔载体及其特点使用的多孔载体及其特点海藻酸钙凝胶包埋法：海藻酸钙凝胶包埋法
22、：滴至滴至海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液E(or cell)CaCl2 溶液中溶液中 IE(or IC)角叉菜胶包埋法：角叉菜胶包埋法：滴至滴至角叉菜胶角叉菜胶E(or cell)KCl 溶液中溶液中 IE(or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法：聚丙烯酰胺凝胶包埋法：APAcr+Bis+E(or cell)IE(or IC)TEMED2 2）微囊型包埋法）微囊型包埋法（microencapsulationmicroencapsulation）又称半透膜包埋法又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几。半透膜：直径几十微米到几
23、百微米，厚约百微米，厚约25nm25nm。半透膜孔径半透膜孔径 80%80%活性。活性。（三）酶的最适温度三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多数酶固定化后热稳定性上升，最适温多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）度也上升（有例外）。（四）酶的最适（四）酶的最适pHpH 带负电荷载体带负电荷载体 ：最适：最适pH pH 向碱性偏移。向碱性偏移。带正电荷载体带正电荷载体 ：最适：最适pH pH 向酸性偏移。向酸性偏移。固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数K Km m随载体的带电随载体的带电性能变化。性能变化。固定化载体与底物电荷相反固定化载体与
24、底物电荷相反,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值降低。值降低。固定化载体与底物电荷相同固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的固定化酶的表观表观K Km m值显著增加。值显著增加。（五）酶的动力学特征（五）酶的动力学特征 与自然酶基本相同。但大分子底与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。发生改变。（六）酶的作用专一性（六）酶的作用专一性 5.4 5.4 固定化酶的特性：固定化酶的特性：n将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变
25、化。由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。n固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。n固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。变化不大。n酶经过固定化后，其作用的最适酶经过固定化后，其作用的最适pHpH值往往会发生一些变化。值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适最适pHpH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。一个
26、是酶催化反应产物的性质。n固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。本章目录 与固定化酶相比，固定化细胞的情与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。况比较复杂。（1 1）有活性升高的现象。）有活性升高的现象。（2 2）稳定性的增加）稳定性的增加 。（3 3）最适温度和最适）最适温度和最适pHpH常保持不变。常保持不变。二、固定化细胞的性质二、固定化细胞的性质
27、 (一一)酶酶(细胞细胞)的活力的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。化酶。(二二)蛋白总量蛋白总量 1.1.双辛可宁酸法双辛可宁酸法(BCA(BCA法法)2.2.考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法 三、固定化酶（细胞）的评价指标三、固定化酶（细胞）的评价指标 (三三)偶联率及相对活力偶联率及相对活力 偶联率偶联率=(=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/)/加入蛋白活力加入蛋白活力100%100%活力回收活力回收=固定化酶总活力固定化酶总活力/加入酶的总活力
28、加入酶的总活力100%100%相对活力相对活力=固定化酶总活力固定化酶总活力/(/(加入酶的总活加入酶的总活力力-上清液中未偶联酶活力上清液中未偶联酶活力)100%100%(四四)半衰期半衰期 在连续测定条件下，固定化酶在连续测定条件下，固定化酶(细胞细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以工作时间，以t t1/21/2表示。表示。是衡量稳定性的一项重要指标。是衡量稳定性的一项重要指标。不同固定化方法的比较不同固定化方法的比较carriersRecovery of enzyme activity(%)Agar 54.0po1yacrvlamld
29、el5.24Gelatin40.77carragheenan69.13Glutaraldehyde0乙酰乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酸乙酰乙酰-D Ala第三节第三节 固定化酶与固定化细胞的应用固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1.氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化固定化酶柱子酶柱子晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala 2.2.葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶 世界上生产规模世界上生产
30、规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。二、固定化酶在医学上的应用二、固定化酶在医学上的应用 1.消血栓：消血栓：n纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。反应，无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。能自由进出。2.2.人工肾：人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再
31、用活性炭吸附。即：用固定化脲酶氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。和微胶囊活性炭组成人工肾。1.1.酶传感器酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分析检测中的应用三、在分析检测中的应用 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定
32、在疏水膜技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器世界上第一个生物传感器葡萄糖葡萄糖氧化酶电极氧化酶电极。葡萄糖酶电极 酶电极示意图D葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极GlucoseGluconic acidGlucose oxidaseOxygenHydrogen peroxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，的量，可以用氧电极、可以用氧电极、pHpH电极和电
33、极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。继酶传感器（继酶传感器（enzyme sensorenzyme sensor）后，又出现：）后，又出现：n细胞器传感器（细胞器传感器（cell organelle sensorcell organelle sensor）n组织传感器（组织传感器（tissue sensortissue sensor）n微生物传感器（微生物传感器（microbe sensormicrobe sensor）n免疫传感器（免疫传感器（immunosensorimmunosensor）1）酶传感器的原理）酶传感器的原理n生物传感器生物传感器 由
34、生物识别单元（如酶、微生物、由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。分析仪器。生物识别元件生物识别元件(Biological recognition element)(Biological recognition element)n 是酶、抗原是酶、抗原(体体)、细胞器、组织、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。物质有选择性的分子识别能力。换能器换能器(Transducer)(Transducer
35、)将识别元件上进行的生化反应中将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系比例关系。酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器酶传感器主要由主要由固定化酶膜和变换器固定化酶膜和变换器组成：组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质并催化被检测物质发生化学反应；发生化学反应；变换器：变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。信号，通过仪表显示出来。2）酶传感器的应用）酶传感器
36、的应用 n水质监测水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物器，可检测大多数酚类化合物。医疗方面医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。可测定血液中葡萄糖浓度。手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glu
37、cose)(glucose)分析仪分析仪SBA-50SBA-50型单电极生物传感分析仪型单电极生物传感分析仪SBA-70型血糖乳酸自动分析仪型血糖乳酸自动分析仪n食品鲜度食品鲜度鱼鲜度传感器鱼鲜度传感器 在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内度的测定。鱼死后体内ATPATP经酶解依次形成经酶解依次形成ADPADP、AMPAMP、IMPIMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用鲜度可用K K值表示：值表示：K=K=肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+/ATP+ADP+AMP+IMP+肌肌苷苷+次黄嘌呤次黄嘌
38、呤+尿酸尿酸 大多数鱼死后大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP和和AMPAMP已分解尽，超过已分解尽，超过24h24h，鲜度主要取决于，鲜度主要取决于IMP-IMP-肌苷肌苷-次黄嘌呤次黄嘌呤-尿酸。尿酸。将这三个步骤的三种酶（将这三个步骤的三种酶（55核苷酸核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。n 当当K K2020时，鱼极新鲜，可供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。n K K在在20204040之间为新鲜，必须熟食。之间为新鲜，必须熟食。n K K大于大于4040，不新鲜，
39、不宜食用，这与嗅觉，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。检验结果相一致。肉鲜度传感器肉鲜度传感器n肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。类测定能反映肉类的新鲜程度。n用用腐胺氧化酶腐胺氧化酶与与过氧化氢电极过氧化氢电极构成多胺生构成多胺生物传感器，或用物传感器，或用单胺氧化酶膜单胺氧化酶膜和和氧电极氧电极组组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。污染微生物及病原菌的检测污染微生物及病原菌的检测n1通过免疫学方法，即获得相应的特异性通过免疫学方法，即获得相应的特异性抗原和抗体进行分析和检测。抗
40、原和抗体进行分析和检测。(1)(1)将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。制成酶标抗体（或酶标抗原成酶标抗体（或酶标抗原 ）；）；(2)(2)将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待将酶标抗体（或酶标抗原）与样品中的待测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者测抗原（或抗体）混合，通过免疫反应二者即可特异性地结合在一起，形成酶抗体即可特异性地结合在一起，形成酶抗体抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测抗原复合物。通过酶催化反应的速度即可测定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待定复合物中酶的含量，进而测出样品中的待测抗原（或抗体）的量。测抗原（或抗体）的量。2.2.酶联免疫测定酶联免疫测定
