1、微生物限度检验方法验证主讲：柴海毅为什么验证？与国际通用要求接轨 促进微生物检验定量化 推进微生物检验标准化 提升药品质量的要求中国药典2010年版二部：“凡例”-检验方法和限度 二十三、本药典正文收载的所有品种，均应按规定的方法进行检验；如采用其他方法，应将该方法与规定的方法做比较试验，根据试验结果掌握使用，但在仲裁时仍以本药典规定的方法为准。美国FDA分析方法验证指南：“分析方法验证”分析方法验证是论证某一分析方法适 用于 其用途的过程，分析方法的验证过程是从 申请者有计划地系统性收集验证资料以支 持分析方法开始的。验证目的 -在于确认（寻找）一种有效的检验方法，如果样品（药品）中有一定数
2、量的微生物 存在，那么采用此法可以使得样品（药品 ）中的微生物得以检出。-充分验证样品（药品）本身对微生物生长 的影响。验证目的 确认一种检验方法。验证实验 检验条件 检验方法 检验规程样品量稀释液种类稀释液体积中和剂培养基培养时间培养温度SOP影响微生物检验的因素 微生物检验的检出率很低下 样品/药品自身的特殊性 样品/药品中添加的防腐剂/抑菌剂 培养基的特性 培养条件 人员因素 实验器材的选择恢复试验 微生物方法验证的实质就是评价和考 察微生物恢复试验（恢复生长）的可 信度。恢复试验就是确认某 一检验方法，它可以使加入其中的各种微生物 都能够恢复生长。验证内容（一）计数方法验证（二）控制菌
3、检验方法验证微生物限度检验方法验证（一）计数方法验证供试液制备中国药典2010年版 表面活性剂、中和剂或灭活剂：应证明其有效 性及对微生物的生长和存活无影响。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过 1小时。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过 45。供试液的体积：100ml。稀释剂中国药典2010年版1、0.1%蛋白胨水溶液2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液 固体：10g 供试品+稀释剂至100ml 液体：10ml供试品+稀释剂至100ml 微生物计数方法验证菌种选择原则 普遍性 -G+、G-、-杆菌（长、短杆菌）-球菌 -真菌（丝状真菌、酵母菌）特殊性 -从环境中分离出来的常见杂菌
4、-从样品中分离出来的常见杂菌微生物计数方法验证用菌株：中国药典2010年版 菌株名称 CMCC编号 培养条件大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CMCC(B)44102 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003 营养肉汤培养基 30-35 18-24h枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501 白色年珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001 改良马丁培养基 20-25 24-48h黑曲霉菌(Aspergillus niger)CMCC(F)98003 改良马丁斜面培养基 20-25
5、5-7天微生物计数方法验证用菌株：USP24版 菌株名称 ATCC编号 培养条件大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ATCC 8739 32+2.5金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538 32+2.5铜绿假单胞菌(Staphylococcus aureus)ATCC9027 32+2.5生孢梭菌(Clostridium sporogenes)ATCC11437 32+2.5枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6633 22+2.5白色年珠菌(Candida albicans)ATCC10231 22+2.5黑曲霉菌(Ca
6、ndida albicans)ATCC16404 22+2.5计数方法验证步骤 选定一个方法 确定检测限 设计验证方案样品的选择：合格的样品 （1）按照正常取样方法取样的样品 （2）符合限度标准的样品 检测限：样品中细菌被检出的最低量。细菌 100 cfu/ml 霉菌+酵母菌 100 cfu/ml 细菌 50 cfu/ml 霉菌+酵母菌 50 cfu/ml平板法：薄膜过滤法：检测限设定依据：微生物计数原则 限度/标准 数理统计方法学的要求恢复试验 恢复生长是指人为地添加的测试菌（污染菌）在供试液中的生长水平 回收率则是测试菌（污染菌）在样品供试液中的存活率与测试菌污染菌的检出率的比值 恢复试验
7、的原则 消除样品的抑菌性 样品的处理方法和检验方法不应影响样 品中微生物的生长 如何消抑菌活性 稀释法 中和法 离心法 薄膜过滤法 组合运用中国药典2010年版表l 常见干扰物的中和剂或灭活方法干扰物可选用的中和剂或灭活方法戊二醛亚硫酸氢钠酚类、乙醇、吸附物稀释法醛类稀释法、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物（QACs）、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、聚山梨酯 汞类制剂亚硫酸氢钠、巯基乙酸盐、硫代硫酸盐双胍类化合物卵磷脂碘酒、洗必泰类聚山梨酯卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸（EDTA)镁或钙离子磺胺类对氨基苯甲酸-内酰胺类抗生素-内酰胺酶USP列举出的部分抑菌剂/中和剂抑菌剂抑菌剂中和剂中和剂戊二醛硫酸氢盐酚
8、类、乙醇、山梨酸酯稀释剂醛类稀释剂、甘氨酸、硫代硫酸盐季铵类化合物、对羟基苯甲酸酯卵磷脂、吐温汞类制剂硫酸氢盐、硫乙醇酸盐、硫代硫酸盐二重双胍卵磷脂碘酒、洗必泰类吐温卤化物硫代硫酸盐乙二胺四乙酸Mg+2或Ca+2磺胺类对氨基苯甲酸样品本底含菌量高，怎么处理？样品本底含菌量高：1、稀释：供试液梯度稀释2、过滤：0.45 m滤膜过滤测试菌悬液的要求:中国药典2010年版：1、室温下放置，2小时内使用；2、保存在2 8，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可以保存在 2 8，在验证的贮存期内使用。计数方法验证（平板法）样品组：样品溶液（1/10）9.9ml 104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 稀
9、释剂对照组：蛋白胨稀释液 9.9ml （阴性对照）104 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌种组：104 102 （阳性对照）空白样品组：计数A计数B计数C计数D结果判断依据：1、样品组和稀释剂对照组微生物计数结果吻合，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、稀释剂对照组和菌种组微生物计数结果吻合，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作正确。没有污染事件发生。可以接受的标准 平板法1、重现性良好 -三批不同批次的样品/产品 -三名不同的微生物检验人员2、验证数据合理有效（微
10、生物的回收率）-阴性对照：无污染事件发生 -样品组（回收率）：A=C 30%（偏差 30%）3、样品的处理方法和检验方法与检验规程相符计数方法的验证-各国药典结果判断标准USP：各试验菌的回收率均不低于70%。EP、BP、JP:各试验菌的回收率均不低于80%。中国药典：各试验菌的回收率（包括供试品组和稀释剂对照组）均不低于70%。不可以接受的标准（1）：1、阴性对照：阴性对照(包括蛋白胨组和空白样品组)发生污染事件。菌落鉴别：-污染菌是测试菌：检验员无菌操作培训。-污染菌不是测试菌：偏差调查。2、阳性对照：样品组的试验数据与检测限不符。（微生物的回收率过 高或过低）结论：样品组的试验结果无效。
11、重新开始细菌的恢复试验直至与检测限相符。不可以接受的标准（2）：3、样品组：-三人三次的试验结果应该与检测限相符。-第一次的试验结果要能够被第二次和第三次的 试验证实。-任何一次与检测限不符的结果都说明试验过程 有缺陷，验证需重新进行。优化更新步骤：消除抑菌活性。稀释样品时，应确认检测限（检验限度）低于或等于标准。不同的细菌，一个好的结果可以从不同的稀释度中检测出，最高的稀释度将被用于日常的监测中。平板法优化更新方法：平板法优化更新方法：稀释样品：1/10 1/50 1/100 增加培养基量 延长培养时间 添加抗活性剂计数方法验证（薄膜过滤法）样品组：样品溶液（1/10）10ml 过滤 5x1
12、02 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 蛋白胨对照组：蛋白胨稀释液 10ml 过滤 （阴性对照）5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 菌种组：5x102 cfu/ml菌悬液 0.1 ml 过滤 （阳性对照）过滤 空白样品组：计数A计数B计数C计数D可以接受的标准 薄膜过滤法1、重现性良好 -三批不同批次的样品/产品 -三名不同的微生物检验人员2、验证数据合理有效（微生物的回收率）-阴性对照：没有污染事件发生。-样品组：A=C 30%（偏差 30%）3、样品的处理方法和检验方法与检 验规程相符薄膜过滤法优化更新方法：增加冲洗量 增大样品稀释倍数（1/50，1/100）延长培养时间 添加抗
13、活性剂（冲洗剂里加也可以）2010年版中国药典（附录109页）：若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因 供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品 不能被试验菌污染。然而，供试品也可能仅对 试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有 抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物 限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果 判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高 稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试 验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀 释级的供试液进行供试品检验。2010年版中国药典（附录109页）：计数方法验证时，若采用上述计数方法总存在 一株或多株
14、试验菌的回收率达不到要求，那么 选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进 行供试品的检测。微生物检验方法验证（二）控制菌检验方法验证控制菌检验方法验证菌种选择原则 样品的给药途径和类型决定了采用何种控制菌检查验证。增菌培养基的确定 增菌培养基的实际用量等同控制菌检查方法验证时的用量。验证的开始。控制菌检验方法验证 选定一个方法：CP或USP 设定检测限：不得检出 设计验证方案控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）增菌 （计数）样品组样品组蛋白胨蛋白胨对照对照菌悬液菌悬液对照对照样品样品100ml增菌液增菌液大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu/ml大肠杆菌悬液大肠杆菌
15、悬液 0.1ml、1X102 cfu/ml 蛋白胨蛋白胨100ml 增菌液增菌液 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液0.1ml、1X102 cfu/ml 培培 养养样品组样品组空白样空白样品对照品对照控制菌检验方法验证（平板法）（以大肠杆菌为例）确认培养结束后，需检查大肠杆菌菌落形态并镜检，必要时要鉴别。4 组组测试样品测试样品观察CP法USP法18小时24小时结果判断依据：1、样品组和蛋白胨对照组测试结果一致，表明：-添加的中和剂完全消除了样品的抑菌性。2、蛋白胨对照组和菌种组测试结果一致，表明：-中和剂没有毒性，没有影响测试菌的生长。-测试方法和培养条件不影响测试菌的生长。3、空白样品组测试结果阴性
16、，表明：-本次测试样品合格。-无菌操作正确。没有污染事件发生。可以接受的标准 1、样品检验 -增菌液经培养后明显浑浊 -分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落2、阳性对照 -增菌液经培养后必须是浑浊的 -分离平板上出现大肠杆菌的典型菌落3、阳性菌计数 -菌悬液的计数结果应该 25 cfu/ml 不可以接受的标准（无效试验）1、样品检验 -与可接受的标准不符 结论：重新设计试验步骤2、阳性对照 -与可接受的标准不符 结论：重新试验3、阳性菌计数 -与标准不符 结论：重新开设大肠杆菌的恢复试验，制作 新的菌悬液直到符合规定。优化控制菌验证步骤：扩大增菌液的体积 100ml 200ml 300ml 400
17、ml 500ml 延长增菌液的培养时间 采用薄膜过滤法 加入活性试剂控制菌检验方法验证（薄膜过滤法）（以大肠杆菌为例）加10ml 稀释液到薄膜过滤器中，加湿过滤器。加100ml 样品增菌液到薄膜过滤器中。加0.1ml、5X102 cfu/ml大肠杆菌悬液到薄膜过滤器中并用稀释液冲洗，这样，薄膜上就应该有50 cfu个菌落出现。失败的验证（无效试验）1、样品中有些成分是固有的抑菌成分2、参考防腐剂的实验/验证数据3、参考样品中各成分的理化性质 验证结果 根据验证结果，判断是否符合验证的标准。-符合：按验证的方法和条件继续进行药品的微生物 限度检查；-不符合：重新设计验证方案，再进行验证，直至验证
18、 结果全部符合验证方案。验证报告的形成1、全部验证工作必须按照批准的验证方 案进行。2、验证方案批准后，可以进一步再修订，但必须在验证报告上注明。3、验证结束后，应该同时出具验证数据 记录和验证报告。4、最终样品稀释度及方法必须在SOP中 说明。采用薄膜过滤法的供试品 （1）水溶液 （2）可溶于水的固体制剂 （3）-内酰胺类抗生素 非水溶性制剂 （1）可溶于十四烷酸异丙酯的膏剂和粘性油剂 （2）无菌气（喷）雾剂 装有药物的注射器 （3）具有导管的医疗器具(输血、输液袋等)方法验证的关键点（1）对于同一份培养物，采用相同的测定方法，不同的实验人员的测定结果的可能有很大的 误差，甚至达到50%。所
19、以，在操作过程中，应特别注意能造成误差的各个环节。方法验证的关键点（2）当采用固体培养基上的培养物制备菌悬液时，应尽量使菌苔成单个菌体充分分散于稀释液中，一般将菌苔与微量稀释液先在管壁上混匀。对于那些不易制成均匀菌悬液的菌苔（如枯草芽孢杆菌），一般采用液体培养物制备菌悬液。若液体培养物产生菌膜，取菌液时应避免取出菌膜，一般应取培养管中部的均匀菌悬液。方法验证的关键点（3）为保证每次菌数测定能在预计的范围内，在对菌液做10倍梯度稀释时，要求稀释每个浓度的菌液均应换灭菌吸管。操作时，将灭菌吸管插入原液中，将菌液充分混匀，吸取菌液，贴于试管内壁调整液量至刻度，将菌液移入下一级的稀释管中，移入时，吸管
20、应接触试管内壁并靠近液面（勿接触液面），缓慢地沿管壁放出全部菌液，然后，将吸管放入消毒液中。再取一支灭菌吸管同法往下稀释。什么时候要验证？新药申报/产品组分改变 检验方法改变 回顾性验证举例:样品名称和批号:微晶纤维素1.计数验证 培养时间：4872 h 培养温度：25 or 35 稀释溶液：蛋白胨水培养基 cfu/ml 样品计数 大肠 金萄菌 沙门菌 绿脓 白念 菌液浓度 /259.5 68.5 248 147.5 140稀释度 10-1 0 187.5 75 203 117.5 213.5稀释度 10-2 0 258 82.5 247.5 143 130.5阴性对照 0 /举例:2.控制菌验证 培养时间：24 h 培养温度：35 增菌液：100ml胆盐乳糖 样品量：1克/10克 200ml营养肉汤/100ml营养肉汤 大肠 金萄菌 沙门菌 绿脓 阳性 阴性 MCA/MUG (+)/(+)(-)DHL/MCA /(+)/(+)(-)卵黄氯花钠 /(+)/(+)(-)溴化16烷 /(+)(+)(-)基3甲铵 谢 谢！
