1、流式细胞分析术和分选术流式细胞分析术和分选术及其医学生物学应用及其医学生物学应用交通大学医学院交通大学医学院石学耕石学耕FLOW CYTOMERTY AND ITS APPLICATION ON MEDICAL SCIENCESHI XUEGENGFLOW CYTOMERTY简称简称FCML/M WBC+DCE/M细胞生物学的每一重大发展都是与细胞生物学的每一重大发展都是与其其研究手段上的革命研究手段上的革命分不开的。分不开的。FCM 是继是继 E/M 后细胞学研究手段后细胞学研究手段的重大进展。的重大进展。FCM技术在国际上已被广泛的应用于技术在国际上已被广泛的应用于肿瘤肿瘤血液病血液病免疫
2、性疾病免疫性疾病艾滋病艾滋病器官移植等方面器官移植等方面 的常规临床检查中，并已成为上述的常规临床检查中，并已成为上述疾病诊断、疾病诊断、疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计等等至关重要、甚至唯一的方法。至关重要、甚至唯一的方法。近年近年WHO已公布了全新的血液已公布了全新的血液淋巴组织肿瘤分类标准淋巴组织肿瘤分类标准 见见:美国临床肿瘤协会举办美国临床肿瘤协会举办“临床肿瘤杂志临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical OncologyJournal of Clinical Oncology，Vo17 Vo17 No12No12，19991
3、999：PP3835PP383538493849）;世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册（SpringerSpringerVerlayVerlay出版社，出版社，20002000版）版）新分类标准将传统的新分类标准将传统的细胞组织形态细胞组织形态学学和和临床特征临床特征与与现代的免疫表型现代的免疫表型和和遗传遗传变异变异相整合，比现有的相整合，比现有的FABFAB白血病分类方白血病分类方案，多种淋巴瘤分类方案有明显的改进案，多种淋巴瘤分类方案有明显的改进和提高。和提高。目前已在欧美，日本等西方国家中目前已在欧美，日本等西方国家中开始逐步采用，成为血液肿瘤的国际标
4、开始逐步采用，成为血液肿瘤的国际标准分类方案。准分类方案。新的新的WHO分类标准中分类标准中细胞免疫表型分析细胞免疫表型分析主要是依靠主要是依靠 FCM 来检测来检测19781978年年 国家科委重点项目：国家科委重点项目：研制国内第一台激光流式细胞仪研制国内第一台激光流式细胞仪19821982年年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生19841984年年 国家科委组织科研成果的鉴定验收国家科委组织科研成果的鉴定验收19851985年年 获国家卫生部科技成果乙等奖获国家卫生部科技成果乙等奖19851985年年-灵敏度、信噪比、更多参数灵敏度、信噪比、更多参数 流
5、式分选仪研制流式分选仪研制 计算机四参数软件开发计算机四参数软件开发 样品制备、医学生物学应用样品制备、医学生物学应用第一幅直方图：鸡红血细胞第一幅直方图：鸡红血细胞+蛙红血细胞蛙红血细胞LXJ 流式细胞计流式细胞计填补国内空白填补国内空白全部采用国产元器件全部采用国产元器件培养了一批有综合能力的人才培养了一批有综合能力的人才促进了促进了FCMFCM先进技术在各领域应用先进技术在各领域应用19841984年在全国率先开设：年在全国率先开设：研究生课程研究生课程分析细胞学技术分析细胞学技术 细胞生物学细胞生物学在医学科学乃至生命科学在医学科学乃至生命科学中占有十分重要的地位。近代细胞生物学发中占
6、有十分重要的地位。近代细胞生物学发展十分迅速，其展十分迅速，其研究方法逐步从传统的定性研究方法逐步从传统的定性描述发展到描述发展到定量定量的、的、细胞群体的研究细胞群体的研究，以获，以获得更为客观的、具有统计学意义的测量数得更为客观的、具有统计学意义的测量数据，供进一步深入的研究。由此形成了一个据，供进一步深入的研究。由此形成了一个新的领域，新的学科新的领域，新的学科-分析细胞学分析细胞学。分析细胞学分析细胞学:年轻的交叉学科年轻的交叉学科 激光技术激光技术 数字计算机技术数字计算机技术 电子物理技术电子物理技术 电子摄像技术电子摄像技术 光电测量技术光电测量技术 荧光细胞化学技术荧光细胞化学
7、技术 单克隆抗体等免疫学技术等单克隆抗体等免疫学技术等 一、一、FCM原理原理&仪器结构仪器结构二、二、FCM医学生物学应用医学生物学应用一、一、FCM原理原理&仪器结构仪器结构二、二、FCM医学生物学应用医学生物学应用FluorescenceActivatedCellSorterOrtho 30FACS 420FACScanFACScaliburFACStarPlusFACSVantageEPICS ALTRA FC500FACSAria FCM 能高速度地自动分析能高速度地自动分析单个单个细胞的多个生物学特征细胞的多个生物学特征或多种细胞生或多种细胞生化成分的含量（几千化成分的含量（几千几
8、万个细胞几万个细胞/秒），一般在一、二分钟内就能完成对秒），一般在一、二分钟内就能完成对细胞大群体的定量分析细胞大群体的定量分析测定。测定。FCM 还还可可在在对对样样品品细细胞胞多多参参数数分分析析测测定定的的基基础础上上，结结合合多多种种细细胞胞生生物物学学特特性性，将将样样品品中中特特定定的的细细胞胞亚亚群群高高纯纯度度地地分分选选(s so or rt ti in ng g )出出来来(活活细细胞胞点点对对点点分分选选)，单单独独收收集集以以供供进进一一步步的的深深入入研研究究。如如：形形态态学学检检查查 细细胞胞功功能能研研究究 细细胞胞培培养养 分分子子生生物物学学研研究究 FCM
9、细胞大群体的分析细胞大群体的分析 高统计学精度高统计学精度 单细胞多参数相关分析单细胞多参数相关分析更多、更精确的信息更多、更精确的信息以往其它细胞学技术不可比拟的以往其它细胞学技术不可比拟的（一一）FCM 仪仪器器的的原原理理 FCM 从从原原理理上上讲讲是是一一种种在在计计算算机机技技术术支支持持下下的的高高度度自自动动化化的的细细胞胞显显微微荧荧光光脉脉冲冲分分光光光光度度仪仪。FCM 的的诞诞生生与与发发展展是是与与激激光光技技术术、电电子子物物理理技技术术、光光电电测测量量技技术术、数数字字计计算算机机技技术术，以以及及荧荧光光细细胞胞化化学学技技术术、单单克克隆隆抗抗体体等等免免疫
10、疫学学技技术术的的发发展展密密切切相相关关的的。1 1、FCM仪器的一般结构仪器的一般结构2 2、细胞信号的检测与分析、细胞信号的检测与分析3 3、FCM测量数据的处理测量数据的处理1 1、FCM仪器的一般结构仪器的一般结构2 2、细胞信号的检测与分析、细胞信号的检测与分析3 3、FCM测量数据的处理测量数据的处理细胞样品细胞样品荧光荧光荧光荧光荧光荧光侧向散射光侧向散射光流动室流动室鞘液鞘液前向散射光检测器前向散射光检测器光束成形系统光束成形系统针孔装置针孔装置负高压板负高压板正高压板正高压板充电环充电环细胞分选细胞分选收集器收集器废液收集器废液收集器收集器收集器激光激光激光激光(X、Y、Z
11、三轴互为正交三轴互为正交)(1)流动室与液流驱动系统流动室与液流驱动系统 流动室流动室(Flow Chamber(Flow Chamber 或或 Flow Cell)Flow Cell)是流式细胞仪的是流式细胞仪的核心部件核心部件。被检样品的。被检样品的细胞悬液流经流动室时，由液体动力学细胞悬液流经流动室时，由液体动力学层流技术层流技术保证，其中的细胞一个一个排保证，其中的细胞一个一个排列成单行，逐个依次通过检测区。列成单行，逐个依次通过检测区。流动室也可称为流动室也可称为单细胞流发生器单细胞流发生器。(2)(2)激发光源与光束成形系统激发光源与光束成形系统 FCMFCM 的激发光源大多采用的
12、激发光源大多采用氩离子氩离子气体激光器气体激光器(488nm)(488nm)。一些。一些 FCMFCM 也配也配有其他各种激光器，如氪离子激光有其他各种激光器，如氪离子激光器、氦镉激光器、氦氖激光器、染料器、氦镉激光器、氦氖激光器、染料激光器和激光器和半导体激光器半导体激光器等。等。为了实现为了实现单个细胞的均匀照射单个细胞的均匀照射，FCM 一般都采用二块相互垂直放置的一般都采用二块相互垂直放置的柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透柱面透镜或一块柱面透镜和一块球面透镜所组成的镜所组成的光束成形系统光束成形系统对激光束进行对激光束进行适当的聚焦，形成适当的聚焦，形成截面为椭圆形的照射截面为椭圆形
13、的照射光斑光斑。此光斑正处于此光斑正处于 FCM 仪器中三条正仪器中三条正交轴线的交点，即仪器的交轴线的交点，即仪器的检测区检测区。TEM00细胞样品细胞样品荧光荧光荧光荧光荧光荧光侧向散射光侧向散射光流动室流动室鞘液鞘液前向散射光检测器前向散射光检测器光束成形系统光束成形系统针孔装置针孔装置负高压板负高压板正高压板正高压板充电环充电环细胞分选细胞分选收集器收集器废液收集器废液收集器收集器收集器激光激光激光激光X、Y、Z三轴互为正交三轴互为正交(3)(3)细胞信号检测与分析处理系统细胞信号检测与分析处理系统 样品细胞流经仪器检测区时受到激样品细胞流经仪器检测区时受到激发光的照射，同时产生细胞的
14、发光的照射，同时产生细胞的散射光信散射光信号号和和细胞的荧光信号细胞的荧光信号。这些信号以被检。这些信号以被检细胞为中心向空间细胞为中心向空间 360 360 度立体角发射。度立体角发射。FCM关键技术关键技术单细胞流单细胞流 单细胞照明单细胞照明 单细胞检测单细胞检测1 1、FCM仪器的一般结构仪器的一般结构2 2、细胞信号的检测与分析、细胞信号的检测与分析3 3、FCM测量数据的处理测量数据的处理(1)(1)细胞散射光信号细胞散射光信号前向角散射信号前向角散射信号 （Forward Scatter,Forward Scatter,简称简称 FSCFSC）前向角散射信号与被测细胞的大小和活力
15、有关前向角散射信号与被测细胞的大小和活力有关侧向角散射光信号侧向角散射光信号（Side Scatter,Side Scatter,简称简称 SSCSSC）侧向角散射信号包含有细胞内部结构形态学信息侧向角散射信号包含有细胞内部结构形态学信息特别是细胞浆中的颗粒性成分特别是细胞浆中的颗粒性成分(2)细细胞胞荧荧光光信信号号 未未经经荧荧光光染染色色的的样样品品细细胞胞在在激激发发光光的的照照射射下下可可测测到到有有微微弱弱的的荧荧光光信信号号，称称为为细细胞胞自自发发荧荧光光。FCM 检检测测分分析析的的细细胞胞荧荧光光信信号号主主要要是是指指经经过过特特异异荧荧光光染染色色后后细细胞胞受受照照发
16、发射射的的荧荧光光信信号号。近年来近年来荧光素化学技术荧光素化学技术发展很发展很快，现在已可做到用快，现在已可做到用一束激光一束激光(488nm)(488nm)激发三种染料激发三种染料(甚至四种甚至四种或更多染料或更多染料)而得到各自波长不同而得到各自波长不同的荧光。的荧光。这已能这已能满足目前大多数研满足目前大多数研究和临床检验工作的需要究和临床检验工作的需要。荧光染料化学技术的发展荧光染料化学技术的发展降低仪器造价降低仪器造价简化仪器设计简化仪器设计方便仪器调试、操作方便仪器调试、操作推动推动FCMFCM的应用的应用起着十分积极的作用。起着十分积极的作用。1 1、FCMFCM仪器的一般结构
17、仪器的一般结构2 2、细胞信号的检测与分析、细胞信号的检测与分析3 3、FCMFCM测量数据的处理测量数据的处理（1）FCM数据的数据的存贮存贮 List Mode(2)(2)FCM数据数据显示显示方式方式 a.a.单参数单参数显示显示 单参数直方图单参数直方图表示的是一个测量参数表示的是一个测量参数与细胞数量间的与细胞数量间的统计分布关系统计分布关系 细胞多个测量参数中每一参数的测量数据细胞多个测量参数中每一参数的测量数据都可整理为其统计分布，以都可整理为其统计分布，以分布直方图分布直方图(distribution histogram)来显示。来显示。图中横轴为该参数测量强度相对值，单位图中
18、横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。图中纵轴一般为细胞数。数的。图中纵轴一般为细胞数。b.b.双参数双参数数据的显示数据的显示点阵图、等高线图、密度图和点阵图、等高线图、密度图和三维立体显示等三维立体显示等 细胞双参数测定不仅能提供细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二参数之间更重要的是获得了这二参数之间的的相关关系相关关系，其中包含了更多、，其中包含了更多、更重要的生物学信息更重要的生物学信息。在在FCM分析中，形态与结构相似、具分析中，形态与结
19、构相似、具备相同功能的细胞群体其测量值总是相近备相同功能的细胞群体其测量值总是相近的。的。这些细胞在单参数直方图上以一个这些细胞在单参数直方图上以一个分分布峰布峰出现。在双参数散点图上，测量值相出现。在双参数散点图上，测量值相近或离散的细胞群总表现为散点的近或离散的细胞群总表现为散点的密集或密集或稀疏稀疏，这在等高线轮廓图上可用不同颜色，这在等高线轮廓图上可用不同颜色或标有不同细胞数的各种或标有不同细胞数的各种曲线轮廓曲线轮廓来表示。来表示。要记住，在要记住，在FCM数据显示中，数据显示中，结构结构和和功能功能相同的细胞亚群总表相同的细胞亚群总表现为现为集中分布集中分布的趋势。的趋势。不同的细
20、胞亚群有其各自的不同的细胞亚群有其各自的分布区域分布区域。Flow Sortingc c.多参数多参数数据的显示、分析数据的显示、分析 若干个单参数直方图和各种不若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。种信息的。多参数测量另一重要意义是通多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行过有关参数进行“设门设门”(gating)分析。分析。可以是单参数设门，也可以是可以是单参数设门，也可以是双参数设门。通过设门来调阅其他双参数设门。通过设门来调阅其他参数的有关信息。参数的有关信息。（一）（一）仪器的原理仪器的原理（二）（二）样品制备技术样品制备技术
21、 FCM FCM 作为作为高精度高精度的单细胞定量的单细胞定量分析的仪器，对细胞样品的制备技分析的仪器，对细胞样品的制备技术有着术有着特殊的要求特殊的要求。1.1.单个分散细胞悬液的制备单个分散细胞悬液的制备2.2.选择性分离细胞亚群选择性分离细胞亚群3.3.细胞荧光染色技术细胞荧光染色技术1 1.单个分散细胞悬液单个分散细胞悬液的制备的制备制备合格的单个分散的细制备合格的单个分散的细胞悬液是非常关键的一环胞悬液是非常关键的一环对于不同来源和不同形式对于不同来源和不同形式的样品，根据各种样品的特点的样品，根据各种样品的特点可选择不同的分散方法可选择不同的分散方法 酶消化法酶消化法机械法机械法化
22、学试剂处理法化学试剂处理法 常用的酶类试剂常用的酶类试剂酶反应的条件酶反应的条件酶消化法的一般程序和步骤酶消化法的一般程序和步骤机械法：机械法：剪碎法、网搓法、研磨法等剪碎法、网搓法、研磨法等化学试剂处理法：化学试剂处理法：将对细胞的贴壁粘连行为有重要作将对细胞的贴壁粘连行为有重要作用的二价钙、镁离子结合掉，从而用的二价钙、镁离子结合掉，从而使细胞分散使细胞分散常用的试剂：常用的试剂：EDTAEDTA、EGTAEGTA、TPBTPB等等实实际际工工作作中中，一一个个理理想想的的单单个个细细胞胞分分散散的的细细胞胞悬悬液液样样品品的的制制备备往往往往不不是是单单用用以以上上方方法法的的某某一一种
23、种，而而是是两两种种或或多多种种方方法法的的结结合合使使用用。评判评判细胞悬液制备的细胞悬液制备的标准标准细胞团块、细胞碎片尽可能少细胞团块、细胞碎片尽可能少细胞细胞呈呈单个分散状态单个分散状态分散过程中细胞的活性不受到分散过程中细胞的活性不受到明显的损害明显的损害以保证下一步的荧光染色处理以保证下一步的荧光染色处理。2 2.选择性分离细胞亚群选择性分离细胞亚群如：血液样品中有红血细胞和白细如：血液样品中有红血细胞和白细 胞，并各自有不同的亚群胞，并各自有不同的亚群 肿瘤组织中一般都有大量的浸肿瘤组织中一般都有大量的浸 润淋巴细胞润淋巴细胞 将将所研究的细胞所研究的细胞从从混杂的细胞群体混杂的
24、细胞群体中中分离出来分离出来 利用利用细胞物理学特性细胞物理学特性差异差异自然沉降法自然沉降法密度梯度离心法密度梯度离心法电泳法电泳法离心鼓淘汰法离心鼓淘汰法利用利用细胞吸咐等细胞吸咐等的生物学特性的生物学特性利用利用选择性破坏选择性破坏部分细胞部分细胞MACSMACS&FCMFCM多参数分析多参数分析评判评判细胞分离结果的细胞分离结果的指标指标：收获率：收获率：所得的细胞数占原细胞样品所得的细胞数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比中该亚群细胞数的百分比纯度：纯度：是指分离后的样品中该亚群细是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。胞所占的百分比。进行进行 FCMFCM 分析的样品要真实反分析
25、的样品要真实反映研究对象的映研究对象的实际组成实际组成情况，避免情况，避免造成造成 FCMFCM 分析的分析的失真与误差失真与误差 3.3.细胞荧光染色技术细胞荧光染色技术悬液中荧光细胞化学方法的特点悬液中荧光细胞化学方法的特点 单细胞悬液中单细胞悬液中固定剂的使用易引固定剂的使用易引起细胞凝集起细胞凝集，形成细胞团块等。，形成细胞团块等。在整个样品处理过程中需多种试在整个样品处理过程中需多种试剂处理时，每换一种试剂必须剂处理时，每换一种试剂必须反复离心反复离心与漂洗与漂洗。这必然会造成。这必然会造成大量的细胞丢大量的细胞丢失失。注意注意:实际工作中实际工作中 避免使用固定剂避免使用固定剂 尽
26、可能减少离心和漂洗次数尽可能减少离心和漂洗次数 FCM的荧光细胞化学过程要求的荧光细胞化学过程要求有有足够的特异性足够的特异性，即所用荧光染料与，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成份是否为特异性结所感兴趣的细胞成份是否为特异性结合。合。严格控制各种反应条件严格控制各种反应条件是保证反是保证反应特异性的重要因素。应特异性的重要因素。在在相同的条件下相同的条件下，荧光反，荧光反应产物的应产物的量（荧光强度）量（荧光强度）与所与所研究的生化成份的研究的生化成份的含量或活性含量或活性之间有之间有严格的化学定量关系严格的化学定量关系一、一、FCMFCM原理原理&仪器结构仪器结构二、二、FCMFCM医学生物
27、学应用医学生物学应用FCMFCM 在医学生物学的在医学生物学的各领域各领域中已有中已有广泛的应用广泛的应用研究对象是各种类型细胞研究对象是各种类型细胞正常细胞正常细胞 异常细胞异常细胞A.A.百分率计算百分率计算（细胞群体组成）（细胞群体组成）各种阳性细胞所占的百分含量（各种阳性细胞所占的百分含量（%）例如：例如：CD3CD3：70%70%淋巴细胞淋巴细胞 CD19CD19：10%10%淋巴细胞淋巴细胞 在各种生理、病理情况下的变化在各种生理、病理情况下的变化遵循一定的规律。遵循一定的规律。B.B.绝对计数绝对计数 阳性群体的绝对数量（个细胞阳性群体的绝对数量（个细胞/微升）微升）例如：例如：
28、AIDSAIDS患者患者CD4CD45050个细胞个细胞/ul/ul血血;CD34+CD34+造血造血干干/祖细胞绝对计数祖细胞绝对计数C.C.抗原分子表达绝对定量抗原分子表达绝对定量抗体结合数量，若知道抗原与抗体结合抗体结合数量，若知道抗原与抗体结合的化合价，可以计算出抗原的表达量的化合价，可以计算出抗原的表达量（个分子（个分子/细胞）。细胞）。例如：败血症患者：例如：败血症患者：264264个个CD64CD64抗原分抗原分子子/个中性粒细胞个中性粒细胞D D.单细胞多色荧光分析单细胞多色荧光分析三色、四色或更多色荧光的检测三色、四色或更多色荧光的检测从多个不同角度更客观地更可靠地识别从多个
29、不同角度更客观地更可靠地识别各类功能不同的细胞亚群各类功能不同的细胞亚群如：如：ThTh细胞，细胞，CD3+CD4+CD8-CD45+CD3+CD4+CD8-CD45+白血病细胞免疫表型分析等白血病细胞免疫表型分析等E.E.膜、胞浆、核相关分析膜、胞浆、核相关分析膜免疫表型膜免疫表型+细胞浆内功能状态细胞浆内功能状态如：如：Th1/Th2细胞分析：细胞分析：cytokines的分泌的分泌 急性髓系白血病：膜抗原急性髓系白血病：膜抗原+胞浆胞浆MPO（髓（髓过过 氧化物酶）等氧化物酶）等膜抗原表达膜抗原表达+FISH：表型和核型：表型和核型F.F.可溶性物质分析可溶性物质分析CBA系统系统（Cy
30、tometric Bead Assay）Luminex 100 系统系统 细胞因子、趋化因子、激素分子、蛋白激细胞因子、趋化因子、激素分子、蛋白激酶、过敏原、细胞信号传导相关蛋白和核苷酶、过敏原、细胞信号传导相关蛋白和核苷酸片段等酸片段等 FCM 在医学生物学的各领域在医学生物学的各领域中已有广泛的应用。中已有广泛的应用。它的研究对象是各种类型细它的研究对象是各种类型细胞，可以是各种胞，可以是各种正常细胞正常细胞，也可，也可以是各种不同的以是各种不同的异常细胞异常细胞。一、一、细胞生物学细胞生物学中的应用中的应用(一一)细胞动力学细胞动力学中的应用中的应用1.1.细胞周期与细胞动力学参数测定细
31、胞周期与细胞动力学参数测定2.2.丰富发展对细胞周期的认识丰富发展对细胞周期的认识3.3.理化因素及药物的细胞动力学作用机理理化因素及药物的细胞动力学作用机理4.4.研究抗肿瘤药物合理使用与配伍方案设计研究抗肿瘤药物合理使用与配伍方案设计(二二)细胞分化细胞分化研究研究 细胞分化过程中同时分析其增殖细胞分化过程中同时分析其增殖过程的变化，常常可提供十分重要的过程的变化，常常可提供十分重要的信息。信息。通过检测和定量细胞膜上各种分通过检测和定量细胞膜上各种分化抗原。化抗原。不同分化阶段的造血细胞不同分化阶段的造血细胞 形态形态有其一定变化有其一定变化 膜分化抗原膜分化抗原的不同组合的不同组合 特
32、殊抗原表达量特殊抗原表达量的变化的变化（三）（三）细胞凋亡细胞凋亡研究研究 细胞坏死细胞坏死(Necrosis)细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis)细胞凋亡过程中细胞凋亡过程中形态学形态学变化变化细胞生化细胞生化变化变化细胞功能细胞功能改变改变FCM凋亡检测的基础和依据凋亡检测的基础和依据二二.细胞遗传学细胞遗传学中的应用中的应用流式核型分析流式核型分析(Flow karyotype)特定的染色体分选纯化特定的染色体分选纯化三三.免疫学免疫学中的应用中的应用1.1.各种免疫细胞的表型分析各种免疫细胞的表型分析 T淋巴细胞淋巴细胞 B淋巴细胞淋巴细胞 NK淋巴细胞淋巴细胞 巨噬细胞巨噬细胞 D
33、C等等2.2.杂交瘤细胞的筛选与克隆杂交瘤细胞的筛选与克隆3.3.免疫活性细胞功能的测定免疫活性细胞功能的测定(1)(1)混合淋巴细胞培养试验混合淋巴细胞培养试验(MLC)(2)(2)细胞介导细胞毒试验细胞介导细胞毒试验(3)(3)细胞吞噬功能试验细胞吞噬功能试验(4)(4)血清中自身免疫抗体的检测血清中自身免疫抗体的检测(5)(5)细胞因子（细胞因子（cytokines）的分泌能力）的分泌能力四四.肿瘤学肿瘤学中的应用中的应用肿瘤细胞肿瘤细胞增殖动力学增殖动力学DNA异倍体异倍体细胞群体细胞群体异倍体细胞多少异倍体细胞多少异倍体异倍体DNA偏离的程度偏离的程度肿瘤细胞生物学特征肿瘤细胞生物学
34、特征癌前病变癌前病变生物学行为：肿瘤生长、转移、生物学行为：肿瘤生长、转移、复发、化疗疗效复发、化疗疗效交界瘤交界瘤细胞细胞DNA倍体测定倍体测定一个一个客观客观的、的、定量定量的指标的指标临床肿瘤病理不可缺少的一个方面临床肿瘤病理不可缺少的一个方面五五.血液学血液学中的应用中的应用(一一)各种血细胞的计数与分类各种血细胞的计数与分类(二二)各种造血细胞的研究各种造血细胞的研究(三三)血液病学中的应用血液病学中的应用 各种膜抗原在正常造血细胞分化成各种膜抗原在正常造血细胞分化成熟过程的不同阶段或出现或消失，或表熟过程的不同阶段或出现或消失，或表达增强，或表达降低，都达增强，或表达降低，都遵循一
35、定的规遵循一定的规律律 研究表明这些抗原都是具有研究表明这些抗原都是具有一定生一定生物学功能的效应分子物学功能的效应分子，它们参与造血细，它们参与造血细胞发育成熟过程中的胞发育成熟过程中的免疫应答和调控免疫应答和调控作作用用造血干造血干/祖细胞的分选纯化祖细胞的分选纯化白血病细胞白血病细胞分化成熟分化成熟受阻受阻增殖增殖异常异常凋亡凋亡障碍障碍白血病细胞白血病细胞“双表型双表型”现象现象(Biphenotype)血病细胞作为一种恶性细胞血病细胞作为一种恶性细胞异常细胞的分化程序异常细胞的分化程序“发育不同步发育不同步”(Developmental Asynchronous)“系列不保真性系列不
36、保真性”(Lineage Infidelity)细胞遗传学改变细胞遗传学改变所致所致分化过程中分化过程中基因表达基因表达的异常的异常细胞细胞功能功能和细胞和细胞表型表型等等一系列的异常一系列的异常1.白血病细胞白血病细胞免疫表型分析免疫表型分析细胞系抗原：细胞系抗原：B B细胞系细胞系(CD19(CD19，CD20)CD20)T T细胞系细胞系(CD7(CD7，CD3)CD3)髓细胞系髓细胞系(CD13(CD13，CD33)CD33)红细胞系红细胞系(glycophorin A)(glycophorin A)巨核细胞系巨核细胞系(CD61)(CD61)血液淋巴组织肿瘤分类标准血液淋巴组织肿瘤分
37、类标准美国临床肿瘤协会举办的美国临床肿瘤协会举办的“临床肿瘤杂志临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical Journal of Clinical OncologyVo17.No12OncologyVo17.No12，19991999：PP3835PP383538493849）世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册（SpringerSpringerVerlayVerlay出版社，出版社，20002000版）版）MICMICM高度专业化的服务高度专业化的服务FlexibilityReverse Transcriptase MutationsSpectra
38、l-notSpatial Separation BD FACSArray谢谢！谢谢！2.2.白血病细胞动力学白血病细胞动力学3.3.白血病化疗效果分析白血病化疗效果分析 微小残留病变微小残留病变(MRD)检测检测4.4.白血病的诱导分化治疗白血病的诱导分化治疗 诱导凋亡治疗诱导凋亡治疗5.5.其他恶性血液病中的应用其他恶性血液病中的应用 高分辨流式细胞术是一种高分辨流式细胞术是一种血液病理学检测方法，它利用血液病理学检测方法，它利用先进的流式细胞术和产权独有先进的流式细胞术和产权独有的数据分析方法来为临床血液的数据分析方法来为临床血液肿瘤提供一种肿瘤提供一种早期早期和和准确准确的诊的诊断和断和分型分型手段手段早期而准确早期而准确地发现异常的肿瘤细胞地发现异常的肿瘤细胞血液肿瘤的原发性诊断和鉴别血液肿瘤的原发性诊断和鉴别分型分期分型分期疗效观察疗效观察残存瘤细胞检测残存瘤细胞检测肿瘤复发的早期发现肿瘤复发的早期发现骨髓移植后的成功与再生检测骨髓移植后的成功与再生检测
