1、第二代测序在转化医学中的应用第二代测序在转化医学中的应用The application of Next generation sequencing in Translational MedicineThe application of Next generation sequencing in Translational Medicine 一一.DNA第二代测序技术第二代测序技术 二二.第二代测序技术在转化医学中的应用第二代测序技术在转化医学中的应用 感染性疾病的预防与诊断 无创产前诊断 肿瘤研究和诊断 药物研发 开发新的诊断试剂盒所有的人类生理活动都来源于基因组的调节。人类基因组计划(hum
2、an genome project,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。按照这个计划的设想，在2015年，要把人体内约4万个基因的密码全部解开，同时绘制出人类基因的谱图。换句话说，就是要揭开组成人体4万个基因的30亿个碱基对的秘密。人类基因组计划与曼哈顿原子弹计划和阿波罗计划并称为三大科学计划。被誉为生命科学的“登月计划”。人类基因组计划人类基因组计划基因组调节着人类的生命活动方方面面。DNADNA第二代测序第二代测序技术（技术（NGSNGS）第二代测序技术（next-gen
3、eration sequencing）是一次可对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量的测序技术，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。第二代测序的优势在哪里？第二代测序的优势在哪里？相比于sanger测序，NGS更加省时低成本，速度快，覆盖度深，准确度高；高通量测序人类基因组有助于发现与疾病相关的基因；对于疾病引起的基因突变，高通量测序可以为患者医师提供更为准确的诊断依据；感染性疾病的诊断和预防感染性疾病的诊断和预防 高通量测序非常适合细菌，真菌和病毒等微生物的全基因组测序，可用于这些微生物感染
4、导致的疾病，可对微生物进行鉴定分型，了解感染的类型，已达到预防和诊断的目的。测序可同时给出微生物的耐药性的信息，指导个体用药。诊断实例：诊断实例：Dr.James Gern和Joseph DeRisi合作，用MiSeqDx从一个病危的十几岁的男孩的脑脊液中抽提出核酸样本，测了8百万条核酸序列，从中检出了475条钩端螺旋体的序列，从而判定这个男孩的病是因为钩端螺旋体感染。Dr.James Gern依据上述的判断，给男孩青霉素治疗，治好了这个男孩的病。脑脊液是较难取得的体液，只能是采集很少的量，这就限制了所能得到的核酸总量。钩端螺旋体，在病原体的常见程度排名中是较靠后的种类。在本案例中，如果用PC
5、R方法，挨个排查病原体，可能还没排到钩端螺旋体，核酸就不够了。但高通量测序克服了核酸量不够的问题。在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。Wilson,M.R.,Naccache,S.N.,Samayoa,E.,Biagtan,M.,Bashir,H.,Yu,G.,Chiu,C.Y.(2014).Actionable diagnosis of neuroleptospirosis by next-generation sequencing.The New England Journal of
6、Medicine,370(25),240817.doi:10.1056/NEJMoa14012682009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda,M.,Katano,H.,Nakajima,N.,Tobiume,M.,Ainai,A.,Sekizuka,T.,Sata,T.(2010).C
7、haracterization of quasispecies of pandemic 2009 influenza A virus(A/H1N1/2009)by de novo sequencing using a next-generation DNA sequencer.PloS One,5(4),e10256.doi:10.1371/journal.pone.0010256 MRSA是一种金黄色葡萄球菌，能够抵抗-内酰胺类抗生素。其中包括甲氧苯青霉素和其他更为的常见抗生素，如苯恶洒唑青霉素，青霉素和苯恶洒唑青霉素（阿莫西林）。大多数MRSA的传染是皮肤传染。在这项研究中，研究者使用DN
8、A测序技术来自Illumina公司的MiSeq设备分析从12位病人体内分离出来的MRSA，清晰的论证了MRSA细菌与此密切相关，并且证明这是一次爆发。他们还透露，这次爆发范围比先前意识到的更为广泛，两倍以上的人群携带或被同一种爆发细菌品种感染。Chewapreecha,C.,Croucher,N.J.,Harris,S.R.,Ph,D.,Sanders,M.,Sc,B.,Ph,D.(2012).Rapid Whole-Genome Sequencing for Investigation of a Neonatal MRSA Outbreak.无创产前诊断无创产前诊断唐氏综合征，又称先天愚型或
9、Down综合征，是由染色体异常（多了一条21号染色体）而导致的疾病。60%患儿在胎内早期即流产，存活者有明显的智能落后、特殊面容、生长发育障碍和多发畸形。无创产前诊断是要通过测孕妇外周血中的21号染色体DNA序列的量，来推断胎儿是否有21号染色体三体综合征（唐氏综合征）。怀了唐氏胎儿的孕妇，在3月龄时，其外周血中的21号染色体片段比正常胎儿的孕妇多了约2.5%。但在高通量测序技术出现之前，一直没有太好的技术来检出这2.5%的差异。直到有了高通量测序，检出这2.5%的差异就成了轻而易举的事情。比起传统的穿刺羊水检查，无创检测仅需普通抽血，更加安全，无痛苦。肿瘤研究和诊断肿瘤研究和诊断 癌症是由基
10、因组的突变积累引起的。通过第二代测序，对癌基因组序列和结构的分析可以为了解癌症机制、诊断与治疗提供新的视野。下列是一些药物以及其标记，通过Miseq检测这些基因位点来指导用药。药物研发药物研发 通过测序可寻找新的药物靶点，进行药物筛选。同时可重新估价过去未通过的新药。对原来一些证明“无效”或“毒副反应大”的药物，药物基因组学研究有可能证明其对某些人群有较好的作用，或者说根据基因选择治疗药物可提高药物的有效性，避免不良反应的发生。这样，所有在临床试验中失败的药物都有可能“推倒重来”。靶点鉴定靶点确认临床前开发临产期开发（IIII期）批准认证开发新的诊断试剂盒开发新的诊断试剂盒 目前二代测序在临床
11、诊断上的应用才刚起步，不过其高通量，高准确性，操作便利，成本更低，将来必然替代毛细管测序在临床诊断上的诸多应用，可以基于Miseq开发多种应用于疾病诊断，微生物鉴定，耐药性研究的试剂盒。7月2日，国家药监局网站发布消息，2014年6月30日，药监局批准了BGISEQ-1000基因测序仪、BGISEQ-100基因测序仪和胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(联合探针锚定连接测序法)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)医疗器械注册。这是国家食品药品监督管理总局首次批准注册的第二代基因测序诊断产品。11月5日又有准产批件发布。高通量测序及药物筛选平台高通量测序及药物筛选平台Biacore T200ITC200Envision multimode plate readerHiseq 2500KTA pure
