1、大家好大家好神经系统遗传病的基因诊断神经系统遗传病的基因诊断杜万良北京天坛医院神经内科基因wDNA上的功能单位。w基因结构模式图：基因突变wDNA分子结构的化学变化。突变的类型突变的类型w碱基替换：某个碱基被另一个碱基所取代（点突变）。嘌呤或嘧啶之间的取代为转换；嘌呤与嘧啶之间的取代为颠换。w同义突变：突变后密码子改变但氨基酸不变化。w错义突变：突变后氨基酸发生改变。w无义突变：突变后变为终止密码。w碱基插入和缺失：由于碱基的增多或减少造成阅读框架的改变移码突变。以上突变为稳定突变，即传递中不再变化的突变。w动态突变：传递中不断发生变化的突变，如三联体核苷酸数目的变化，一般是由于不等交换所致。
2、突变的一般特性w可逆性(Aa,aA)w多向性(Aa1,a2,a3,a4)w有害性w稀有性(Human,10-6)w可重复性(Hot site)遗传病w由于遗传物质缺陷或发生改变而导致的机体结构和功能的紊乱。遗传病的危害w1、发病率逐年上升w2、住院儿童近1/3为遗传相关疾病w3、自然流产胚胎60%有染色体畸变w4、平均每人携带56个有害基因w5、人群中25%患有各类不同程度的遗传相关疾病w6、绝大多数遗传病目前没有理想的治疗方法遗传病的分类遗传病的分类w染色体病w单基因病w多基因病w线粒体基因病染色体病w染色体病:染色体数目或结构异常。w常染色体病的共同特征：w智力低下、发育迟缓、多发畸形。w
3、性染色体病的共同特征：w性征发育不全或畸形、智力较低。21-三体综合征w21-三体又称先天愚型，Down综合征。w 1866年英国医生JLH Down首先描述，1959年法国Lejeune证实该病的病因是由于G组染色体多了一条，后确定为21号。w发病率：1/6001/800。w临床表现：w、特殊面容眼距宽、鼻塌平、口半开、流口水、耳廓小、手足短。w、发育不良、肌张力低、关节松弛、新生儿有第三囟门。w、部分患者有特殊肤纹，如通贯手、atd角达64(正常人41)，w、半数患者伴有先天性心脏病，白血病发病率高于正常20倍。男性基本无生育能力，女性少数可有生育能力。大部分寿命不长，少数可达50岁以上。
4、单基因病w单基因病：染色体上单一基因的一个或两个等位基因突变。w严格按照孟德尔规律遗传w临床上最多见。多基因病w多基因病：一个或多个基因与一种或多种环境因素共同作用产生的疾病。w没有严格的孟德尔传递规律。w病种少，但患病者多。线粒体遗传病w线粒体遗传病是由于mtDNA的突变所导致。w有性生殖的方式决定了线粒体遗传属于母系遗传。（细胞质遗传）w 1987年首次提出线粒体病概念，目前已经发现100多种疾病与线粒体DNA突变有关线粒体遗传病线粒体基因组编码线粒体基因组编码：2个个rRNA基因和基因和22个个tRNA基因基因13种多肽基因：种多肽基因：核糖体蛋白基因核糖体蛋白基因rps4，rps13，
5、rps14细胞色素细胞色素C氧化酶复合体基因氧化酶复合体基因coxI，coxII，coxIIIATP酶复合体基因酶复合体基因atpA1，atpA2，atpA6，atpA9，atpA10NADH脱氢酶复合体脱氢酶复合体I基因：基因：ND-1，DN-5遗传病w大多数遗传病为先天性疾病，但先天性疾病不一定是遗传病。w大多数遗传病表现出家族聚集性，但家族性疾病不一定是遗传病。遗传病诊断遗传病诊断w1、病史、症状、体征 病史采集、外貌特征、发育状况。w2、系谱分析 单基因，多基因；显性，隐性；常染色体，性染色体。表现度、外显率、隔代遗传。遗传方式、发病风险。w3、染色体检查标本外周血、绒毛、羊水、活检组
6、织。分带G-,R-,C-,荧光原为杂交(FISH)分析数目（单体、多体）、结构（易位、缺失、倒位)指征智力障碍、发育畸形、多发流产、不育等。w 4、生化检查 主要用于分子病和先天性代谢缺陷。w5、基因诊断 直接诊断被检者的DNA或RNA。发展最快，前景最好。直接DNA检测缺失、突变、重排.。间接遗传标记检测多态性，连锁分析。基因诊断技术：分子杂交、分子扩增、分子测序。传统的诊断（举例）：传统的诊断（举例）：、问、望、听、触经验型诊断、化验/检验材料：细胞、组织、大分子、小分子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生物化学、免疫学、病理学等。、影像学X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等。、特
7、殊检查染色体检查、肌电/心电/脑电、骨密度等。在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测也就是说“发病”了才能诊断。基因诊断wGene Diagnosis：detection of genetic disorders by DNA analysis w直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检测，从而辅助临床进行的诊断。w基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一类崭新的诊断技术，它依托DNA重组技术，直接从基因型入手，诊断表现型即可以越过产物（酶和蛋白质）直接检测基因结构而作出
8、诊断。（逆向诊断）w基因诊断始于1978年，Kan第一次成功进行了镰状细胞贫血病的产前基因诊断。w基因诊断具有灵敏度高、特异性强、费用低，并对许多疾病特别是遗传性疾病具有预测性的特点，是一种极具潜力的诊断方法。基因诊断的对象基因诊断的对象w1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、艾滋病w2、单基因遗传性疾病，如苯丙酮尿症、无丙种球蛋白血症w3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 w4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法医物证神经系统遗传病wWilsons disease(WD)wHuntingtons disease(HD)wCadasilwMelasw(DMD)wCMTwSCAwLeigh基因变异的类型基因变
9、异的类型1、点突变）单个碱基置换）单个碱基的缺失或插入2、片段缺失编码片段；调节序列3、片段插入编码片段；调节序列4、重排融合基因5、扩增拷贝大量增加6、动态突变遗传物质传递过程中不等交换使STR重复数增加原理：找突变基础：PCR（聚合酶链反应）DNA DNA以指数形式扩增以指数形式扩增(2(2n n)，其中长片段以线性形式扩增其中长片段以线性形式扩增 (2(2n+2)n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。最终主产物片段长度在两个引物之间。预变性(92-95C,2-5m)变性(92-95C,30s)复性(40-60C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,7m)(25-35
10、)PCRPCR的一般过程：的一般过程：经过30次的循环,扩增的DNA片段可达100万倍以上。2401625611452228200短片段（单链）1412108642长片段（单链）128643216总片段（单链）循环数策略1w直接诊断：直接检查致病基因本身的异常。它通常使用基因本身或紧邻的DNA序列作为探针，或通过PCR扩增产物，以探查基因无突变、缺失等异常及其性质，这称为直接基因诊断，它适用已知基因异常的疾病；w间接诊断：当致病基因虽然已知但其异常尚属未知时，或致病基因本身尚属未知时，也可以通过对受检者及其家系进行连锁分析，以推断前者是否获得了带有致病基因的染色体。连锁分析是基于紧密连锁的基因
11、或遗传标记通常一起传给子代，因而考察相邻DNA是否传递给了子代，可以间接地判断致病基因是否传递给子代。连锁分析多使用基因组中广泛存在的各种DNA多态性位，特别是基因突变部位或紧邻的多态性位点作为标记。RFLP、VNTR、SSCP、AMPFLP等技术均可用于连锁分析。遗传标记遗传标记1、第一代遗传标记限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)8kb5kb3kb在个体和群体中，片段长度表现出多态性。如3kb,5kb,7kb,8kbRFLP呈现孟德尔式遗传。常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。产生多态性的原因是内切酶位点
12、的变化。原位点的消失；新位点的产生。GAATTCCTTAAGGATTTCCTAAAG1 21 21 2III2kb3kb5kb7kb2、第二代遗传标记微卫星DNA(Micro-satellite DNA)属高度重复序列，重复单元26bp，重复区大多几十几百bp，分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫星DNA已经发现了万余个位点。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG常用检查方法：PCR等。微卫星微卫星DNA PCRDNA PCR扩增结果（示例）
13、：扩增结果（示例）：500bp400bp300bp240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重复片段只有2个碱基）。2、第三代遗传标记单核苷酸多态性(SNP)某些DNA位点上，单个碱基存在着变化。如：AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCTAATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCTAATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT个体A个体B个体C SNP分布于整个基因组，可在基因内，也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。在人类DNA序列变异中，SNP占90
14、%。单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。目前已知基因组中含有150万个芯片杂交结果示意图A C G T位点1位点2位点3常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。常用技术等位基因特异性寡核苷酸杂交（allele-specific oligonucleotide，ASO）当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种
15、与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。异常探针 T A G正常人 患者 DNA DNA点杂交正常探针 G A G正常人 患者 DNA DNA点杂交单链构象多态性单链构象多态性PCR(SSCP-PCR)PCR(SSCP-PCR)DNA分子在电泳中的行为取决于分子量和分子构象。DNA单链的构象取决于序列。PCR产物变形后于中性胶中
16、电泳，与正常对照比较，若电泳行为异常，则认为内含突变的碱基。对照对照 实验实验等位基因特异性等位基因特异性PCR(Allele-PCR(Allele-Specific PCR,AS-PCR)Specific PCR,AS-PCR)利用末端突变的引物进行PCR。实际应用中，常使用三个引物：A35G3553正常上游引物正常下游引物突变上游引物使用正常引物，在正常人有扩增，异常人无扩增。使用突变引物，在异常人有扩增，正常人无扩增。（严格条件下的PCR）ACGTATGGTACCGCAT染色体FISH探针整条染色体涂染探针染色体重复序列探针染色体专一位点探针基本过程：1、染色体标本制备2、探针制备3、杂
17、交4、显微观察（染色体分带）整条染色体涂染通过整条染色体涂染判断易位染色体引物原位标记技术引物原位标记技术(Primed in situ(Primed in situ Labeling,PRINS)Labeling,PRINS)针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合,然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中,最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。举例1wDMDBMD的缺失型诊断：wDMDBMD是一种
18、连锁隐性遗传的神经肌肉系统受累的致死性遗传病。wDMDBMD有70左右为缺失型。w此基因很大，缺失可发生在不同部位，因此应尽可能采用多对引物作PCR扩增（多重PCR）来检测。如扩增产物电泳后发现有带纹的缺失，即可作出诊断并对缺失定位。w在进行产前诊断时，一般可先通过检测家系中有关成员，即确定先证者的缺失区，然后有针对性地作PCR扩增，包括缺失部分的两端，以判断胎儿或有关患儿是否也获得了相同的基因缺失，但非缺失型不能用此法查出。举例2w脊肌萎缩症（SMA）w5q13.1 wSMN1,SMN2举例3wHuntingtons Disease(HD)wIT15 w（CAG）n举例4w腓骨肌萎缩症（CM
19、T）wHereditary motor and sensory neuropathieswa clinically and genetically heterogeneous group of inherited neuropathieswdemyelination(CMT1)waxonal loss(CMT2)wautosomal-dominant,autosomal-recessive,and X-linked inheritance.wmyelin protein zero(MPZ),wearly growth response gene 2(EGR2)wperipheral myeli
20、n protein 22(PMP22)wmyotubularin related protein 2 gene(MTMR2)wthe N-myc downstreamregulated gene 1(NDRG1)wthe L-periaxin gene(PRX)wthe ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 gene(GDAP1)wconnexin 32 gene(GJB1)GJB1 alteration(323TC)GJB1 mutation 323TC举例5wCADASIL：subcortical ischemic
21、 stroke and vascular dementia in human adults.wNotch3 is a large gene composed of 33 exons encoding for a 2321 amino-acids protein.wmutations are highly stereotyped missense mutations,located within the 23 exons encoding for the 34 Epidermal Growth Factor(EGF)-like repeats of the extracellular domai
22、n of the Notch3 receptor,all mutations resulting either in a gain or a loss of a cysteine residue.wHigh G-C Content up to 88%(mean G-C content 66%).wIn 65%of the patients,these mutations are clustered within exons 3 and 4 but in the 35%remaining ones,mutations are scattered through the 21 other exon
23、s.举例6wMERRF综合症肌阵挛性癫痫和破碎红纤维病w多系统紊乱，肌阵挛性癫痫，共济失调，轻度痴呆，耳聋，脊髓退化。w大量团块状线粒体聚集于肌细胞中（可被特异性染料染成红色，破碎红纤维）。大脑卵圆核与齿状核有神经元的缺失。w当线粒体中90%存在这种突变，将出现典型症状，当突变比例下降时，症状也随之变轻。MTTK*MERRF8344G线粒体突变转运RNA基因 赖氨酸 疾病缩写突变位置该位原碱基问题w各种遗传病的基因异常是不同的，同一遗传病也可以有不同的基因异常。w根据对基因异常类型的了解，可以采用不同的诊断方法 w如基因缺失可用基因探针杂交，PCR扩增直接检测；点突变可用等位基因特异的ASO探
24、针、SSCP等直接检查。一般无需对家系成员进行分析。但条件是必需知道基因异常的性质，并肯定该异常与疾病之间的关系。w然而，由于许多疾病的遗传异质性，以及多数遗传的基因异常尚属未知，目前能直接诊断的病种虽日益增多，但仍然是比较有限的。策略2w热点突变w全基因扫描肝豆状核变性1.AR 2.临床症状：进行性肝硬化，伴有基底神经节豆状核变性，引起神经症状。3.病因：存在细胞膜上的与铜转运有关的ATP7B缺陷导致铜不能从细胞内及时清除而在组织中沉积。4、基因定位：13q14.3wATP7B gene maps to chromosome 13q14.3,contains 21 exons,and enc
25、odes a copper-transporting P-type ATPase.wATP7B mutations are scattered over the entire geneWilsons Disease(WD)Rapid identification of Wilsons disease carriers by denaturing high-performance liquid chromatographyPrev Med 2002 Sep;35(3):278-84Wilsons Disease(WD)Wilsons Disease(WD)Wilsons Disease(WD)w
26、the carrier status wadditional sequence changes(K952R and T991T)wThe K952R change obviously does not contribute to the WND phenotypewAnalysis of the offspring identified WND patients(III-1,III-3)as compound heterozygotes for N505X and V1146M wno falsepositive results and a single false-negative resu
27、lt(IVS18+6ct)wthe short PCR product of the 5 UTR(117 bp)eluted well注意事项w一定要结合临床，突变疾病。w详细询问家族史，画出家系图。遗传病治疗遗传病治疗w遗传病的治疗至今没有理想的方法。以预防为主。w手术治疗移植、修补、矫正。w药物及饮食禁其所忌：如苯丙酮尿症者低苯丙氨酸饮食w去其所余：排泄剂、螯合剂、血液过滤等w补其所需：补充酶或其他蛋白遗传病治疗遗传病治疗w基因治疗的发展为遗传病治疗带来了新的希望。w基因治疗是一种用正常或野生型基因导入靶细胞，校正或置换致病基因的治疗方法。参考书w梁秀龄.神经系统遗传性疾病.人民军医出版社，2001.w曾溢滔.遗传病的基因诊断与基因治疗.上海科学技术出版社，1999.
