1、 第五节第五节 酶的免疫化学测定酶的免疫化学测定 二十世纪二十世纪7070年代以来，随着免疫学技术年代以来，随着免疫学技术的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利的发展，酶的定量分析技术中出现了许多利用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接用酶蛋白的抗原性，通过抗原抗体反应直接测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶测定酶的免疫化学测定法。与经典的测定酶活性方法比较，这些方法不仅灵敏度高，而活性方法比较，这些方法不仅灵敏度高，而且能测定一些以前不易测定或测定条件不易且能测定一些以前不易测定或测定条件不易掌握的酶。掌握的酶。(一一)测定原理测定原理 放射免疫测定放射免疫测定(RIA)(RIA)分为分为
2、直接法直接法与与间接法间接法。直接法直接法是将放射性核素标记的酶分子与相应是将放射性核素标记的酶分子与相应抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量抗体作用产生沉淀，然后将沉淀分离并进行定量测定。测定。间接法间接法是将样品中无放射性的酶蛋白与放射是将样品中无放射性的酶蛋白与放射性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争，性标记的标准酶共同对有限量的抗体进行竞争，根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间根据其竞争程度来定量样品中的酶蛋白量。以间接法为最常用。接法为最常用。另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定另外还有免疫抑制法、化学发光免疫测定(CLIA)(CLIA)、酶免疫测定、酶免疫测定(EI
3、A)(EIA)、荧光酶免疫测定、荧光酶免疫测定(FEIA)(FEIA)等。等。报告方式有两类：报告方式有两类：一类是用酶活性浓度单位，如免疫抑制法测定一类是用酶活性浓度单位，如免疫抑制法测定CK-MBCK-MB酶活性酶活性(actiyity)(actiyity)，结果常以，结果常以U UL L报告；报告；另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测定定CK-MBCK-MB酶质量酶质量(mass)(mass)(即蛋白量即蛋白量)，结果常直接用，结果常直接用ngngmlml或或6g6gL L报告。报告。(二二)免疫化学测定的优缺点免疫化学测定的优缺点 血清酶活性
4、变化分为酶蛋白质量和酶活血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化性同步变化及酶蛋白质量未变而酶活性变化两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条两种情况。酶在一些病理条件下或受操作条件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶件等影响而失活，一些激活剂或抑制剂对酶活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映活性也有影响，因而酶活性常不能正确反映酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一酶的情况，出现酶活性与酶蛋白绝对量不一致，有时甚至出现两者变化完全相反的情况。致，有时甚至出现两者变化完全相反的情况。与传统的酶活性测定法相比，免疫化与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要
5、有：学测定法的优点主要有：灵敏度高，能测定其他方法不易测灵敏度高，能测定其他方法不易测出的少量或痕量酶；出的少量或痕量酶；特异性高，不受体液中其他物质，特异性高，不受体液中其他物质，如酶抑制剂、激活剂等的影响；如酶抑制剂、激活剂等的影响；能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，能用于一些不表现酶活性的酶蛋白，如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变如各种酶原或去辅基酶蛋白，或因遗传变异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；异而导致合成无活性的酶蛋白的酶测定；特别适用于同工酶的测定。特别适用于同工酶的测定。酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有：酶的免疫化学测定也有其局限性。主要有：要制备足够量的提纯酶作为抗原和
6、具有免要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；工作量很大；测定步骤多，操作繁琐；测定步骤多，操作繁琐；测定成本高。测定成本高。第六节第六节 同工酶及其亚型测定同工酶及其亚型测定特别是纸片法简便快速，适用于急诊有机磷中毒的快速筛查。临床上习惯用UL来表示体液中酶催化浓度。-GT4与胆红素增高密切相关。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：ALT有两种不同活性的同工酶(ALTs)、(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。一般CK-MB21.酶是能催化生物体内化学反应的一类特
7、殊蛋白质。血清中的-GT则主要来自肝胆，红细胞中几乎无-GT，因此溶血对其测定影响不大。LD同工酶都出现LDlLD21，即所谓“反转比率”现象，且持续的时间长。但神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。L-丙氨酸+-酮戊二酸 L-谷氨酸+L-丙酮酸另一大类以乳酸为底物的顺向反应(称LD-L法)。迄今测定LPS的方法可分为3类：测定产物(游离脂肪酸)的增加(如滴定法、比色法、分光光度法、荧光法和pH电极法等)；可在340nm波长下测定NADPH生成速率而计算CK活性浓
8、度。电泳法的使用最为广泛。亚型指基因在编码过程中，由于翻译修饰差异所形成的多种形式的一类酶。我国多采用目前IFCC参考方法LD-L法，用连续监测法进行测定。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：一、概一、概 念念 同工酶同工酶 是同一种属中由不同基因或等位基因所是同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、催化功能，但其分子组成、空间构象、理化性质、生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类生物学性质以及器官分布和细胞内定位不同的一类酶。酶。亚型亚型 某些酶
9、或同工酶从组织进入体液后，可进某些酶或同工酶从组织进入体液后，可进一步变化为数个不同类型即所谓一步变化为数个不同类型即所谓“亚型，也称为同亚型，也称为同工型工型(isoform)”(isoform)”。即指基因在编码过程中由于翻。即指基因在编码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。亚型往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作往往在基因编码产物从细胞内释入血浆时因肽酶作用降解而形成。用降解而形成。三、分析方法三、分析方法 临床同工酶的分析大致可分为两步，即临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精确地分离出某酶的各同工酶组分，然首先精确
10、地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的后测定酶的总活性和各同工酶或亚型组分的活性。活性。(一一)电泳法电泳法 1 1方法方法 电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采采用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分离与鉴定离与鉴定。此外还可采用聚丙烯酰
11、胺凝胶电泳、等电聚此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用电泳法进行区带分离的原理与其他蛋电泳法进行区带分离的原理与其他蛋白电泳相似。白电泳相似。2 2显色染料显色染料 常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易溶于水，难溶于一般的有机溶剂。溶于水，难溶于一般的有机溶剂。酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起
12、不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原成紫红色的甲躜成紫红色的甲躜(formazan)(formazan)和紫蓝色的双甲躜。和紫蓝色的双甲躜。常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐(NBT)(NBT)，碘化硝，碘化硝基四唑盐基四唑盐(INT)(INT)、甲基噻唑四唑盐、甲基噻唑四唑盐(MTT)(MTT)等。其中等。其中NBTNBT生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用最多。最多。3 3扫描定量扫描定量 显色后的区带一般用光密度计或荧光
13、计扫显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出各同工酶或亚型区带的活力。各同工酶或亚型区带的活力。图图6-6为琼脂糖凝胶电泳分离的血清为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工同工酶谱酶谱(图谱中从左至右分别为图谱中从左至右分别为LD1-LD5)。4 4注意事项注意事项 用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时
14、，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：酶形成的原因主要有：酶与免疫球蛋白形成的复合物，如酶与免疫球蛋白形成的复合物，如 CKBB-IgGCKBB-IgG、CK-MM-IgACK-MM-IgA、LD-IgALD-IgA等；等；酶与其他蛋白质形成的复合物，如酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-LD-脂蛋脂蛋白；白；酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CKMtCKMt聚合物、聚合物、LDLD亚基自身聚合等。亚基自身聚合等。如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，同工如患者临床症状不明显，血清酶活性不正常，
15、同工酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造酶图谱异常时要特别警惕血清中有无巨分子酶，以免造成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。成对酶测定结果的错误判断和临床误诊。(二二)色谱法色谱法 常用色谱法是柱色谱，如离子交换色谱和常用色谱法是柱色谱，如离子交换色谱和亲和色谱等用于同工酶的提纯与制备，但方法亲和色谱等用于同工酶的提纯与制备，但方法费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。费时繁琐，通常不适合临床同工酶常规检测。目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微目前国外已有供临床同工酶分析用的商品化微型色谱柱。也有应用阴离子交换色谱结合免疫型色谱柱。也有应用阴离子交换色谱结合免疫化学法、聚焦色
16、谱结合电化学检测法进行化学法、聚焦色谱结合电化学检测法进行CKCK亚亚型分析和研究的报道。型分析和研究的报道。(三三)免疫分析法免疫分析法 由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化由于同工酶的一级结构不同，因而免疫化学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制学性质也不同。利用纯化的同工酶免疫动物制备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生备特异性的抗血清，此抗体只与该同工酶产生特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同特异性免疫反应。因此，抗原决定簇不同的同工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的工酶可用特异的免疫反应来识别。应用较多的免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉淀法等。免疫分析法有免疫抑制法、免疫沉
17、淀法等。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。假如能同时测定AST，并计算ASTALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。CK极度升高(3000UL)主要见于全身疾病，特别是肌肉疾病，此时CK测定有助于肌萎缩病因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CK显著升高。临床常规中以电泳法最常用。血清中ALP主要来自肝脏和骨骼。其中底物浓度对酶促反应的影响可用米-曼氏方程表示。ALT速率法测定中酶偶联反应式为：由于ChE在肝脏合成后立即释放到血浆中，故是评价肝细胞合成功能的灵敏指标，与清蛋白生成有密切关系，故测定血清ChE一般用作肝功能试验。谷氨酰转移酶(-GT或GGT)又称
18、-谷氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。ALT4为渗出液，反之为漏出液。ALT有两种不同活性的同工酶(ALTs)、(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清-GT活性。用电泳法进行同工酶分析时，如显示的区带数与同工酶数不一致时，要特别注意巨分子酶的存在。4为渗出液，反之为漏出液。若同时测定一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化，就能根据酶增高或减少的“谱型”做出诊断，此种同时检测一组酶，称为酶谱。测定步骤主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。与传统的酶活性浓度测定法相比，这些免疫化学法具有灵敏度高、特异性强等特点，能用于
19、一些不表现酶活性或无活性的酶测定，而且特别适用于同工酶的测定。急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时ACP可轻度升高。碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。(四四)动力学分析法动力学分析法(五五)蛋白酶水解法蛋白酶水解法 第七节第七节 临床常用血清酶、同工酶及其临床常用血清酶、同工酶及其 亚型分析亚型分析 临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。临床上可根据酶浓度的变化用以辅助诊断。若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引若酶浓度变化由细胞坏死或细胞膜通透性变化引起，表示脏器或组织损伤；若
20、为细胞内酶合成增起，表示脏器或组织损伤；若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起或提示有恶性肿瘤的可能；若为酶排泄障碍引起者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反者说明有梗阻存在。同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。应疾病的部位、性质和程度。由于酶广泛分布于全身各器官、组织，在由于酶广泛分布于全身各器官、组织，在血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一酶的活性变化，很难做出独立诊断。若同时测酶的活性变化，很难做出独立诊断。若同时测定
21、一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化，定一组性质不同的酶，比较各酶活性的变化，就能根据酶增高或减少的就能根据酶增高或减少的“谱型谱型”做出诊断，做出诊断，此种同时检测一组酶，称为酶谱。此种同时检测一组酶，称为酶谱。如：如：(1)心肌酶谱心肌酶谱：传统的心肌酶谱由：传统的心肌酶谱由CK、AST、LD和和-HBD组成，这一组合在我国临床化学实验室组成，这一组合在我国临床化学实验室一直应用至今。目前最简单而有效的心肌酶谱可由一直应用至今。目前最简单而有效的心肌酶谱可由CK、CK-MB、CK-MB 型或型或CK-MM 型组成。近型组成。近年来心肌酶谱在年来心肌酶谱在AMI的早期诊断中的应用价值受到的早
22、期诊断中的应用价值受到了心肌肌钙蛋白的挑战。了心肌肌钙蛋白的挑战。(2)肌酶谱肌酶谱：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。可供选择的酶有护。可供选择的酶有CK、LD、AST及其各自同工酶。及其各自同工酶。若能再加若能再加CK-MM亚型则更为理想。亚型则更为理想。(3)肝酶谱肝酶谱：主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、主要是用来判断有无肝实质细胞损伤、肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。肝内外胆汁淤积等肝胆疾病。(4)肿瘤酶谱肿瘤酶谱：具有器官特异性的有具有器官特异性的有ACP及其同工酶、及其同工酶、ALP及其同工酶、及其同工酶、-GT及其同工酶、及其同工酶、AFU、AMY及其
23、同工酶、及其同工酶、LPS等；非器官特异性的等；非器官特异性的有有ALT、CK同工酶、同工酶、ALD同工酶、同工酶、LD同工酶同工酶等。等。(5)胰酶谱胰酶谱：主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别主要用于急性胰腺炎的诊断和鉴别诊断。可供选择的有诊断。可供选择的有AMY及其同工酶、及其同工酶、LPS、弹力蛋白酶、弹力蛋白酶-1、磷脂酶、磷脂酶A2、尿胰、尿胰蛋白酶原蛋白酶原-2等。等。一、转氨酶及其同工酶一、转氨酶及其同工酶(一一)生物化学特性生物化学特性 转氨酶是一组催化氨基在氨基酸与转氨酶是一组催化氨基在氨基酸与-酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶酮酸间转移的酶类，丙氨酸氨基转移酶(ALT)(AL
24、T)和和(天天)门冬氨酸氨基转移酶门冬氨酸氨基转移酶(AST)(AST)是其中最是其中最重要的两种。重要的两种。AST广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序广泛存在于多种器官中，按含量多少顺序为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中为心、肝、骨骼肌和肾等，肝中70存在于肝细胞线存在于肝细胞线粒体中。粒体中。AST有两种同工酶有两种同工酶ASTs和和ASTm，ASTs存在存在于可溶性的细胞质中于可溶性的细胞质中,ASTm存在于存在于线粒体中线粒体中。细胞。细胞轻度损伤时轻度损伤时ASTs升高显著升高显著，而严重损伤时，则而严重损伤时，则ASTm大量出现于血清中大量出现于血清中。正常血清所含。正常血清所含AST
25、的同工酶主要的同工酶主要为为ASTs，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中，但在病理状态下，如细胞坏死，则血清中以以ASTm为主。为主。血清血清AST活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；肾活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；肾脏或胰腺细胞损伤时，也可出现很高的脏或胰腺细胞损伤时，也可出现很高的AST活性。活性。ALT ALT大量存在于肝脏组织中，其次为肾、大量存在于肝脏组织中，其次为肾、心、骨骼肌等。血清心、骨骼肌等。血清ALTALT活性升高，通常表示活性升高，通常表示肝脏损伤。肝脏损伤。ALTALT有两种不同活性的同工酶有两种不同活性的同工酶(ALTs)(ALTs)、(ALTm)(ALTm)，分别存
26、在于细胞质及线，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的粒体，后者的活性为前者的1616倍。肝细胞坏死倍。肝细胞坏死血清中以血清中以ALTmALTm为主。为主。(二二)测定方法测定方法 转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。转氨酶的测定多用比色法，以赖氏法最常用。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。目前，国内外实验室多采用连续监测法进行测定。ALTALT速率法测定中酶偶联反应式为：速率法测定中酶偶联反应式为：ALTL-L-丙氨酸丙氨酸+-+-酮戊二酸酮戊二酸 L-L-谷氨酸谷氨酸 +L-+L-丙酮酸丙酮酸 LDLD丙酮酸丙酮酸 +NADH+H+NADH+H+L-L-乳酸乳酸 +N
27、AD+NAD+是否为抗酒石酸盐的非PAP增高为毛细胞性白血病的重要鉴别要点。而LPS升高者AMY不一定升高，约有23AMY正常的胰腺炎病人，其LPS正常；对于原因不明的高ALP血清水平，可测定同工酶以协助明确其器官来源。-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清-GT活性。与传统的酶活性测定法相比，免疫化学测定法的优点主要有：ALT有两种不同活性的同工酶(ALTs)、(ALTm)，分别存在于细胞质及线粒体，后者的活性为前者的16倍。若能再加CK-MM亚型则更为理想。酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。由于酶广泛分布于全身
28、各器官、组织，在血清中升高的机制又不尽相同，因此单凭某一酶的活性变化，很难做出独立诊断。非器官特异性的有ALT、CK同工酶、ALD同工酶、LD同工酶等。按检测方法分类主要方法有量气法、分光光度法、荧光法和放射性核素法、电极法等，以分光光度法最常用。此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病(如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起CK升高。(2)肌酶谱：主要用于对骨骼肌疾病的诊断和监护。-GT的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清-GT活性。-GT催化-谷氨酰基从谷胱甘肽(GSH)或其他含-谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上。血清酶活性变化分为酶蛋白质量和酶活性同步变化及酶蛋白
29、质量未变而酶活性变化若为细胞内酶合成增加所致，提示组织再生、修复、成骨或异位分泌，或提示有恶性肿瘤的可能；急性尿潴留、变形性骨炎、癌肿骨转移及甲亢时ACP可轻度升高。重度增加的有病毒性肝炎、中毒性肝炎等。二、-谷氨酰转移酶及其同工酶电泳法的使用最为广泛。酶活性单位有惯用单位、国际单位和Katal单位。脂肪酶(Lipase，LPS或LlP)是胰腺外分泌酶。一般CK-MB21.有助于相应组织病变的诊此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。(一)生物化学特征在急性肝炎时，AST虽亦显著升高，但升高程度不及ALT，而在慢性肝炎，特别是肝硬化时，AST升高程度超过ALT。
30、AST速率法测定中酶偶联反应式为：ALT速率法测定中酶偶联反应式为：酶与其他蛋白质形成的复合物，如LD-脂蛋白；血清AST活性升高，多来自心肌或肝脏损伤；国内外目前测定AMY应用较多的是以麦芽多糖为底物的方法，如2-氯-对硝基苯麦芽三糖苷(CNP-G3)和亚乙基封闭的对硝基苯麦芽庚糖苷(4NP-C7)法(亦称EPS法)，以后者最常用，也是IFCC的推荐方法。用自动生物化学分析仪进行酶学测定时，要合理选择方法并进行参数的设置。酶是能催化生物体内化学反应的一类特殊蛋白质。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。恶性肿瘤如转移到肝脏往往伴有LD4、LD5升高。特别适用于同工酶的测定。即指基因在编
31、码过程中由于翻译后修饰的差异所形成的多种形式的一类酶。第六节 同工酶及其亚型测定胆碱酯酶(ChE)是一类催化酰基胆碱水解的酶类。AST速率法测定中酶偶联反应式为：速率法测定中酶偶联反应式为：ASTL-门冬氨酸门冬氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸 草酰乙酸草酰乙酸+L-谷氨酸谷氨酸 MD 草酰乙酸草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸苹果酸+NAD+上述偶联反应中，上述偶联反应中，NADH的氧化速率与标本中酶的氧化速率与标本中酶活性呈正比，可在活性呈正比，可在340nm检测吸光度下降速率。根据检测吸光度下降速率。根据线性反应期吸光度下降速率线性反应期吸光度下降速率(-Amin)，计算出，计算出ALT、AST
32、的活性浓度。的活性浓度。(三三)临床意义临床意义 ALTALT是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临是反映肝损伤的一个很灵敏的指标，临床上主要用于肝脏疾病的诊断。床上主要用于肝脏疾病的诊断。各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起各种急性病毒性肝炎、药物或酒精中毒引起的急性肝损害时，血清的急性肝损害时，血清ALTALT水平可在临床症状水平可在临床症状(如如黄疸黄疸)出现之前就急剧升高且出现之前就急剧升高且ALTASTALTAST。急性肝炎时血清急性肝炎时血清ALTALT高低与临床病情轻重相高低与临床病情轻重相平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，平行，且往往是肝炎恢复期最后降至正常的酶，是判断急
33、性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如是判断急性肝炎是否恢复的一个很好指标。假如能同时测定能同时测定ASTAST，并计算，并计算ASTASTALTALT之比，则对于之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。急性肝炎时比值特别有价值。急性肝炎时比值1ALTASTALT。二、二、-谷氨酰转移酶及其同工酶谷氨酰转移酶及其同工酶(一一)生物化学特征生物化学特征 谷氨酰转移酶谷氨酰转移酶(-GT(-GT或或GGT)GGT)又称又称-谷谷氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。组织分布以肾脏氨酰转肽酶，是一种线粒体酶。组织分布以肾脏含量最多，其次为胰、肺、
34、肝等。含量最多，其次为胰、肺、肝等。血清中的血清中的-GT-GT则主要来自肝胆，红细胞中则主要来自肝胆，红细胞中几乎无几乎无-GT-GT，因此溶血对其测定影响不大。，因此溶血对其测定影响不大。-GTGT催化催化-谷氨酰基从谷胱甘肽谷氨酰基从谷胱甘肽(GSH)(GSH)或其他含或其他含-谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子谷氨酰基物质中转移到另一肽或氨基酸分子上。上。(二二)测定方法测定方法 -GT-GT的测定方法有数种，目前国内外的测定方法有数种，目前国内外多采用连续监测法测定血清多采用连续监测法测定血清-GT-GT活性。活性。IFCCIFCC参考方法采用参考方法采用L-L-谷氨酰谷氨酰-3
35、-3-羧羧基基对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸对硝基苯胺作为底物，以甘氨酰甘氨酸(双甘肽双甘肽)作为作为-谷氨酰基的受体。在谷氨酰基的受体。在pH7.7pH7.7的条件下，的条件下，-GT-GT催化底物生成催化底物生成-谷氨酰双谷氨酰双甘肽和黄色的甘肽和黄色的22硝基硝基-5-5-氨基苯甲酸，在氨基苯甲酸，在410nm410nm波长处直接连续监测，吸光度的增高波长处直接连续监测，吸光度的增高速率与速率与-GT-GT活性成正比关系。活性成正比关系。(三三)临床意义临床意义 -GT-GT是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。胆道是肝胆疾病检出阳性率最高的酶。胆道疾病如胆石症、胆道炎症、肝外梗阻时，疾病如
36、胆石症、胆道炎症、肝外梗阻时，-GT-GT不不仅阳性率高，而且升高明显。肝实质疾病如肝炎、仅阳性率高，而且升高明显。肝实质疾病如肝炎、脂肪肝、肝硬化时脂肪肝、肝硬化时-GT-GT一般只是中度升高一般只是中度升高(ULN(ULN的的2 25 5倍倍)，这点有助于肝胆疾病的鉴别诊断。，这点有助于肝胆疾病的鉴别诊断。若若ALPALP升高而升高而-GT-GT正常可完全排除正常可完全排除ALPALP的肝来的肝来源，若源，若ALPALP和和-GT-GT均增加，则应先排除肝外引起均增加，则应先排除肝外引起-GT-GT增加的原因，一旦排除，则增加的原因，一旦排除，则-GT-GT增高即为增高即为肝病所致。肝病所
37、致。-GT -GT还可用于判断恶性肿瘤有无肝转还可用于判断恶性肿瘤有无肝转移，肿瘤患者如有移，肿瘤患者如有-GT-GT的升高，常说明有的升高，常说明有肝转移。肝转移。-GT-GT与乙醇的摄取量有关，饮酒时，与乙醇的摄取量有关，饮酒时，由于乙醇对肝细胞线粒体的诱导导致由于乙醇对肝细胞线粒体的诱导导致-GT-GT活性升高，故对乙醇性中毒的判定有相当活性升高，故对乙醇性中毒的判定有相当的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激的价值。长期接受巴比妥类药物、含雌激素的避孕药者常有素的避孕药者常有-GT-GT升高。升高。用醋纤膜电泳可将用醋纤膜电泳可将-GT同工酶分为同工酶分为-GTl、-GT2、-GT3和和
38、-GT4 四种，正常四种，正常人只见人只见-GT2和和-GT3。重症肝胆疾病和肝。重症肝胆疾病和肝癌时常有癌时常有-GTl出现，乙醇性肝坏死和胆总出现，乙醇性肝坏死和胆总管结石时常有管结石时常有-GT2增加，胆总管结石及胰增加，胆总管结石及胰腺炎时腺炎时-GT2也增加。也增加。-GT4与胆红素增高与胆红素增高密切相关。密切相关。三、肌酸激酶及其同工酶和亚型三、肌酸激酶及其同工酶和亚型 (一一)生物化学特性生物化学特性 肌酸激酶肌酸激酶(CK)(CK)催化肌酸和催化肌酸和ATPATP或磷酸肌酸和或磷酸肌酸和ADPADP之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生的磷酸肌酸之间的磷酸转移的可逆性反应，所产生
39、的磷酸肌酸含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。含高能磷酸键，是肌肉收缩时能量的直接来源。CKCK广泛分布于全身，广泛分布于全身，在骨骼肌含量最高在骨骼肌含量最高，其次是心肌，其次是心肌和脑。和脑。CKCK是由是由M M和和B B两类亚基组成的二聚体。在细胞质两类亚基组成的二聚体。在细胞质内存在内存在3 3种同工酶，即种同工酶，即CK-BBCK-BB(CK1)(CK1)，CK-MBCK-MB(CK2)(CK2)和和CK-MMCK-MM(CK3)(CK3)。在细胞线粒体内还存在另一。在细胞线粒体内还存在另一CKCK同工酶，同工酶，即所谓线粒体即所谓线粒体CK(CK-Mt)CK(CK-Mt)，
40、也称，也称CK4CK4。各种各种CK同工酶同工酶还可进一步根据所带电荷和等电点不同分离数目不还可进一步根据所带电荷和等电点不同分离数目不等的亚型。等的亚型。(二二)测定方法测定方法 CKCK的测定方法以的测定方法以酶偶联法酶偶联法最常用，最常用，是是CK的参考的参考方法方法.有两种工具酶及指示酶参与反应。原理如下：有两种工具酶及指示酶参与反应。原理如下：CKCK磷酸肌酸磷酸肌酸 +ADP+ADP 肌酸肌酸 +ATP+ATP HK HKATP+ATP+葡萄糖葡萄糖 6-6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖 +ADP+ADP G6PD6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖+NADP+6-磷酸葡萄糖酸盐磷酸葡萄糖酸盐 +NA
41、DPH+H+可在可在340nm波长下测定波长下测定NADPH生成速率而生成速率而计算计算CK活性浓度。活性浓度。临床常规测定临床常规测定CK同工酶多用电泳和免疫抑制同工酶多用电泳和免疫抑制法，但两法均会受溶血和巨法，但两法均会受溶血和巨CK的干扰，免疫抑的干扰，免疫抑制法还会受到制法还会受到CK-BB的干扰。因此现在推荐用的干扰。因此现在推荐用免疫化学方法直接测定免疫化学方法直接测定CKMBmass，可不受，可不受溶血和巨溶血和巨CK的干扰。的干扰。CK同工酶亚型同工酶亚型(CK-MM 型和型和CK-MB 型型)多用琼脂糖凝胶高压电泳和等多用琼脂糖凝胶高压电泳和等电聚焦电泳等。电聚焦电泳等。(
42、三三)临床意义临床意义 CKCK及其同工酶和亚型是目前临床上测定次及其同工酶和亚型是目前临床上测定次数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑数最多的酶之一，主要用于心肌、骨骼肌和脑疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。疾患的诊断和鉴别诊断及预后判断。AMIAMI时总时总CKCK活性升高显著，约在梗死后活性升高显著，约在梗死后3 38h8h即升高，即升高，101024h24h达峰值，达峰值，3 34d4d恢复正常。恢复正常。CKCK极度升高极度升高(3000U(3000UL)L)主要见于全身疾病，主要见于全身疾病，特别是肌肉疾病，此时特别是肌肉疾病，此时CKCK测定有助于肌萎缩病测定有助于肌萎缩病因的
43、鉴别，如进行性肌萎缩时可见因的鉴别，如进行性肌萎缩时可见CKCK显著升高。显著升高。此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染此外，病毒、细菌、寄生虫感染引起的肌肉感染性疾病性疾病(如心肌炎、皮肌炎等如心肌炎、皮肌炎等)，都能引起，都能引起CK升高。但升高。但神经疾病引起的肌萎缩，神经疾病引起的肌萎缩，CK活性一般正常。活性一般正常。CK-MM亚型测定对早期亚型测定对早期AMI的检出更为敏感，的检出更为敏感，一般以一般以 CK-MM3CK-MM11.0作为诊断作为诊断AMI的标的标准，但必须排除急性骨骼肌损伤。准，但必须排除急性骨骼肌损伤。AMI发病发病24h CK-MM3CK-MM1 即开始
44、升高，即开始升高，812h达峰值。达峰值。CK-MB2亚型在亚型在AMI早期诊断和判断有无再灌注上有早期诊断和判断有无再灌注上有很高的灵敏度和特异性。一般很高的灵敏度和特异性。一般CK-MB21.9UL或或CK-MB2CK-MBl1.5可作为可作为AMI的诊断标准之一。的诊断标准之一。四、乳酸脱氢酶及其同工酶四、乳酸脱氢酶及其同工酶（一）生物化学特征（一）生物化学特征 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶(LD(LD或或LDH)LDH)催化乳酸氧化成丙催化乳酸氧化成丙酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为酮酸，同时将氢转移给辅酶而成为NADHNADH，依，依条件不同而有可逆性。反应式如下：条件不同而有可逆性。反应式如
45、下：L-L-乳酸乳酸 +NAD+NAD+丙酮酸丙酮酸 +NADH+H+NADH+H+LD LD是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于是一种含锌的糖酵解酶，广泛存在于人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、红人体各组织中，以肝、心肌、肾、肌肉、红细胞含量较多。细胞含量较多。第七节 临床常用血清酶、同工酶及其AST主要存在于心肌，以往多用于AMI的诊断。0作为诊断AMI的标准，但必须排除急性骨骼肌损伤。另一类是用质量浓度单位，如用免疫学方法测定CK-MB酶质量(mass)(即蛋白量)，结果常直接用ngml或6gL报告。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。LD同工酶都出现LDlLD21，即所谓“反转比
46、率”现象，且持续的时间长。AMI时，LD由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，通常在梗死818h升高，48144h达峰值，可显著升高(5ULN)，因其半寿期较长，增高持续时间可达510d，此时其他酶已恢复正常，在亚急性心肌梗死诊断上有一定价值。正常男性血清中ACP约主要来自前列腺，其余部分及女子血清中的ACP可能来自血小板、红细胞、白细胞及破骨细胞等。肝炎、休克、白血病、溶血性贫血及晚期恶性肿瘤等均可有中度或显著升高。要制备足够量的提纯酶作为抗原和具有免疫化学性质的抗血清常常是很困难的，而且工作量很大；特别适用于同工酶的测定。临床上以检测血清酶和同工酶应用最广，根据需要也可测定其他各种体液(
47、如尿液、胸腔积液、腹水、脑脊液等)中的酶和同工酶或亚型。反应最后生成对硝基苯酚，其生成量在一定范围内与AMY活性成比，在405nm可以进行连续监测即可测出AMY的活性。草酰乙酸+NADH+H+L-苹果酸+NAD+碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于各器官组织中，其含量以肝脏为最多，其次为肾脏、胎盘、小肠、骨骼等。酶活性浓度测定是临床酶学分析最为常用的方法。假如能同时测定AST，并计算ASTALT之比，则对于急、慢性肝炎的诊断、鉴别诊断以及判断转归也特别有价值。分光光度法目前有两类比较常用：同工酶的分析与鉴定则能反应疾病的部位、性质和程度。性别、年龄、运动、妊娠、人种及环境因素等可引起人血清中某些酶的
48、生理性变化。酶亚基或酶分子之间形成的聚合物，如CKMt聚合物、LD亚基自身聚合等。酶可分为氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶、异构酶类和合成酶类等六大类。LD是由两种不同亚基是由两种不同亚基(M和和H)组成的四聚组成的四聚体，形成体，形成5种结构不同的同工酶，即种结构不同的同工酶，即LD1(H4)，LD2(H3M)，LD3(H2M2)，LD4(HM3)和和LD5(M4)。这这5种同工酶大致可分为三类：种同工酶大致可分为三类：一类以一类以LD1为主，主要在心肌为主，主要在心肌，可占总，可占总LD活性活性50以上，也存在于红细胞内；以上，也存在于红细胞内；另一类以另一类以LD5为主，以横纹肌
49、为代表，肝为主，以横纹肌为代表，肝脏脏中也有；中也有；第三类以第三类以LD3为主，存在于脾、肺为主，存在于脾、肺。(二二)测定方法测定方法 目前根据目前根据LDLD催化反应方向的不同，有两大类催化反应方向的不同，有两大类测测LDLD方法，一大类为以丙酮酸为底物的逆向反应方法，一大类为以丙酮酸为底物的逆向反应(称称LD-PLD-P法法)；另一大类以乳酸为底物的顺向反应；另一大类以乳酸为底物的顺向反应(称称LD-LLD-L法法)。我国多采用目前。我国多采用目前IFCCIFCC参考方法参考方法LD-LLD-L法，用连续监测法进行测定。法，用连续监测法进行测定。LDLD同工酶测定以琼脂糖凝胶电泳法更多
50、用。同工酶测定以琼脂糖凝胶电泳法更多用。一般成年人血中一般成年人血中LDLD同工酶存在如下规律：同工酶存在如下规律：LD2LDlLD3LD4LD5LD2LDlLD3LD4LD5，部分正常儿童血中可见，部分正常儿童血中可见LDlLD2LDlLD2。(三三)临床意义临床意义 临床上测定临床上测定LDLD及其同工酶常用于诊断和鉴别诊及其同工酶常用于诊断和鉴别诊断心、肝和骨骼肌的疾病。断心、肝和骨骼肌的疾病。AMIAMI时，时，LDLD由于分子量较大，在常用心肌酶中由于分子量较大，在常用心肌酶中升高最迟，通常在梗死升高最迟，通常在梗死8 818h18h升高，升高，4848144h144h达峰达峰值，可
