1、一、病毒及其基因组 0.2课时二、phage增殖与突变型 0.4课时三、重组测验与作图 0.4课时四、互补测验与作图 1.4课时五、专一性转导重组 0.6课时目目 录录一、病毒及其基因组一、病毒及其基因组(virus and its genome)病毒(virus)体内无核糖体、翻译及能量转换系统，也没有完整的细胞结构。所以，称病毒为非原核(prokarytes)、非真核生物(eukarytes)的分子生物。但它为遗传物质证实、三联密码破译、基因概念发展、基因表达调控和基因工程发展作出巨大贡献。动物、植物和微生物病毒中，将细菌、真菌及藻类中的病毒往往称为噬菌体(phage)。（一）病毒及噬菌体
2、病毒及噬菌体(virus and phage)P1841.结构简单、形态丰富 蛋白质外壳+DNA或RNA；环、杆、卵、丝状多种形态2.体积小、繁殖快 1m；20min/代3.寄生，无翻译和能量转换系统 无独立代谢能力(二二)病毒的特点病毒的特点（三）病毒的种类病毒的种类P185P185一、病毒及其基因组一、病毒及其基因组(virus and its genome)1、按遗传物质性质分类(遗传和基因工程学角度)DNA类(单、双链，正、反义链)；RNA 类(单、双链)2、按寄生关系分类(遗传、免疫和病毒学角度)烈性(virulent)噬菌体；温和(temperate)噬菌体3、按形态分类(临床诊断
3、和医学角度)蝌蚪、环、线、卵、丝状等 如下噬菌体中T、TMV、在基因工程中应用最多1.烈性噬菌体(virulent phage)P186P186二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型 因裂解寄主得名增殖:附着寄主DNA侵入复制表达蛋白并剪寄主DNA子代误装寄主裂解、转导噬菌体释放。特点：侵染：DNA侵入蛋白质外留复制表达：生产头尾部蛋白、寄主DNA片段误装裂解：寄主被裂解转导噬菌体释放(一)phage繁殖与侵染2.温和噬菌体(temperate phage)与寄主共存增殖：附着寄主 DNA侵入整入寄主基因组内共存称溶源或诱导裂解,再次裂解循环。插入噬菌体后的细菌称溶源菌。特点：侵染:DN
4、A侵入，蛋白质外留溶源循环:插入寄主基因组内,共存表达裂解循环:复制表达诱导进入裂解循环二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型(一)phage繁殖与侵染3.溶源菌特性 P188P188免疫性 整合到细菌染色体上的噬菌体称原噬菌体(prophage)，被侵染的细菌称溶源菌。噬菌体侵染的细菌不会再被同种噬菌体侵染的特性称免疫性。如入侵后，其阻遏蛋白抑制自身复制和近源菌侵染。可诱导性 溶源菌自发或诱导产生0.01%的细菌被裂解，称溶源菌可诱导性。噬菌体整入细菌基因组内称溶源，噬菌体侵入寄主被破坏称裂解。能溶源和裂解的噬菌体为温和型，是基因工程载体。二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型(
5、一)phage繁殖与侵染（二）噬菌体突变类型二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型1.条件致死突变(phage condition lathal)热温敏突变(temperature sensitive mutation ts)30下存活，40-42致死。可进行基因定位。X174 ts与wt30培养10h再42下培养10h，菌斑表型有什么不同？噬菌体氨基酸密码突变成终止密码，称无义突变。UAC(酪)UAG无义突变，称琥珀(amber)突变，记为am；UAC(酪)UAA无义突变，称赭石(ocher)突变，记为och；UGC(半)UGA无义突变，称乳白(opal)突变，记为op。2.无义突变(
6、nonsense mutation)P190P190（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型 抑制无义突变表达的反密码子称无义突变抑制因子，有该因子的寄主为Su+。如细菌tRNA反密码子ATC突变成AUC时，am突变噬菌体能生存。没有无义突变抑制因子的寄主，记为Su-。二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型2.无义突变抑制因子(suppressor-nonsense mutation Su+)证实（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型 无义突变抑制因子与无义突变之间有严格的对应关系。如su+am寄主只能抑制am突变表达，su+op寄主只能抑制op无义突变表达，但su+och寄主能抑制a
7、mb和och无义突变表达(表1)。如：琥珀型无义突变寄主因反密码子摇摆性能接上丝、酪、谷酰氨酸3种氨基酸，选得Su+1、Su+2和Su+3等3种寄主，其蛋白质合成量分别为野生型14%-55%(表2)。二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型3.形态突变二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型速溶性突变r-溶解寄主快呈大斑，r+呈小斑广寄主突变h-能浸染E.coliB1和B2，h+仅侵染E.coliB1，E.coliB1+B2培养基上h-呈透明斑，h+呈半透明斑提问：h+r-基因型菌斑形态是什么？h-r-，h+r+基因型的菌斑形态怎样？T4噬菌体r
8、区突变后寄主范围变窄，由野生型E.ColiB、K菌株寄生变为E.ColiB寄生，问r47能否在E.ColiK株上生长。（二）噬菌体突变类型（二）噬菌体突变类型4.缺失突变二、噬菌体增殖与突变型二、噬菌体增殖与突变型尾部缺失突变27 仅有头部和丝盘能生存，但无侵染力头部缺失突变23 仅有躯干和丝盘能生存，但无侵染力 突变体23与27混合后，因功能互补能形成有侵染力的个体2、计算Rf值及作图 Rf(r-b)=(12+12)/（42+12+12+34）=24%，即24cM r h 24.0 r h+与r+h双亲直接感染E.coli B1和B2 结果如下基因型：r+h-r-h+r-h-h+r+表型型：
9、透明小 半透明大 透明大 半透明小菌斑数：42 34 12 12 求Rf(r-b)=重组子数/总数100%1、杂交重组法测定基因距离（一）（一）T2phage两点基因作图两点基因作图 P193P193三、重组测验与作图三、重组测验与作图（二）（二）T4phage 3 点基因作图点基因作图P195P1952.计算重组值Rf(m-r)=(520+474+162+172)/10342=12.8Rf(tu-r)=(852+965+162+172)/10342=20.8 Rf(m-r)=(520+474+852+965)/10342=27.13.作图m 12.8 r 20.8 tu三、重组测验与作图三、
10、重组测验与作图1.杂交重组法T4速溶r,小斑m,浑浊tu三突变体与野生型杂交，结果如下（三）（三）T4噬菌体重组测验噬菌体重组测验(recombination test)P191P191三、重组测验与作图三、重组测验与作图 Benzer，收集了T4phage r区3000多个突变体。为测定这3000多个基因的距离发明了用双重感染测定法。该方法可以检查到2bp间的遗传距离,称基因精细结构的重组测验。r47与r145突变体，先成对感染大肠杆菌B株，因各类基因型均能产生菌斑，为总配子数；他们的混合培养液再感染大肠杆菌K株，只有野生型噬菌体才能侵染K株。即K株上的菌斑必定为重组配子。从而求得r47与r
11、145突变基因的重组率。r145与r47成对首次感染B获得总菌斑数E.coli K株混合液二次感染K,获得重组型菌斑数E.Coli B株r145 +r47重组率Rf(r47-145)=4/12100=25%双重+r1 r2 +r2 r1 +（三）（三）T4噬菌体重组测验噬菌体重组测验(recombination test)三、重组测验与作图三、重组测验与作图 Benzer用双重感染法测定3000多个突变体两两间的遗传距离。即测定了3000多个突变基因间的重组率，绘图如下。Benzer将T4phage r区3000多个突变体两两成对，直接感染E.coli K株上(不允许基因交换)，测定突变基因遗
12、传功能,称互补测验。（一）（一）T4噬菌体互补测验噬菌体互补测验(complementation test)P196P196四、互补测验与作图四、互补测验与作图E.coli K株r104 +r47遗传功能不互补为同1个顺反子,为什么？E.coli K株r102 +r47遗传功能互补为2个不同顺反子,为什么？因2基因位于1个A基因之内，不互补因2基因均位于1个B基因之内，不互补因2基因位于A、B基因间，功能互补（一）（一）T4phage互补测验互补测验2.互补测验与基因功能研究P200P200四、互补测验与作图四、互补测验与作图23与27突变体遗传功能互补突变基因13必定与头部装配基因有关，为头
13、部发育基因。突变体23：有基盘无头部突变体27：有头部无基盘 分别感染细菌均无菌斑，混合感染细菌有菌斑说明什么？突变体13是什么基因 突变体13与27混合感染有菌班，但与 23 混合无菌班，该突变体为何基因？（一）（一）T4phage互补测验互补测验3.T4phage发育遗传图谱P199P199 用上述方法完成了65个突变体互补测验，将这60多个条件致死突变基因联系起来揭示了T4phage的发育遗传图谱。突变40-47为早期功能基因，即头部、躯干、DNA、丝盘等基本物质控制基因。突变13等基因为头部、尾部、尾丝均有但不能装配，为装配成熟晚期功能基因。四、互补测验与作图四、互补测验与作图（一）（
14、一）T4phage互补测验互补测验4.T4phage发育基因的基因内互补P201P201 T4phage 65个突变体互补测验结果表明：同1亚类不同突变体之间能功能互补称基因内互补。可将其发育调控基因分成3类：头部装配基因：共16个基因内不互补基因，但20-24、31、40与 16、17、49之间有基因内功能互补。尾部装配基因：有3-11、15、18、19、25-29、51、53共20个基因。尾丝装配基因：有35-38、57、63共6个基因。将他们之间的遗传距离，绘制成T4phage发育图谱。四、互补测验与作图四、互补测验与作图（二）X174互补测验1、X174 噬菌体 P198P198四、互
15、补测验与作图四、互补测验与作图 X174 噬菌体发现39个mutant：32个无义、7个温敏突变，见下图。成对直接感染E.coli测定功能是否互补。am8与am14成对感染E.coli有斑，互补，为两个不同的顺反子。am8与am33成对感染E.coli无斑，不互补，同一个顺反子。（二）（二）X174互补测验互补测验2、X174 的顺反子四、互补测验与作图四、互补测验与作图用上述两两成对混合接种的测验方法，测定了X174噬菌体39个突变体，发现它们分别属于8个遗传功能不同的基因，即8个不同的顺反子。如 am8,18,30,33,35,50,86,tsl28为同一个顺反子A；am8与am14,am
16、16,och11,och5为两个不同的顺反子AB。(三三)X174 X174互补测验与互补测验与作图作图 补补1、利用am标记性状选择，获得A-B基因重组率四、互补测验与作图四、互补测验与作图 即，两菌种混合分别接种到Su+和Su-上，分别获得总配子数和AB基因间重组配子数，求得重组率。亲本基因型：amA+tsC +amB 、Su-寄主中的菌斑必定有2种基因型（三）（三）X174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图亲 本基因 型：amA+tsC +amB Su-寄主中活：必定是amA+tsC与+amB+交换产生野生型活 体基因 型：野生型活体必有+tsC 和+两种基因
17、型amA+amB+tsCamA+amB+tsC+amA+amB+tsCamA+amB+tsC+3、据优势菌斑种类确定中央基因（三）（三）X174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图 42下amA+amB+tsC基因型为小斑，+为大斑amA +tsC +amB +ts+amA tsCamB +ts小菌斑占优势，是B居中央 因B居中时AB基因间仅1次单交换产生小斑+tsC，但A居中时AB基因间需双交换才有小斑+tsC，故B居中央。amA+tsC +amB +amA tsC amB+大菌斑占优势，是A居中央 因A居中时AB基因间仅1次单交换产生大斑+，但B居中时AB基因间需
18、双交换才有大斑+，故A居中央。4、三点作图举例 amAtsC+与+amB成对感染Su+E.coli，5 106倍稀释液平板接种1ml产生88个菌斑；裂解后5107倍稀释液接种1ml 到Su-E.coli培养，30培养12h后45培养，产生13个大、7个小菌斑，求Rf(A-B)、Rf(A-tsC),=?并作图。解：总配子=885106，A-B重组配子=(7+13)5107 基因定序：42下大菌斑占13/20，则amA在中央 Rf(B-A)=(重组配子数2）/总配子数 =（220510-7）/(88510-6）=4.5%Rf(A-C)=(2 510-7)/(220510-7)=35tsC 35am
19、B4.5 amA 绘图：（三）（三）X174phage三点作图三点作图四、互补测验与作图四、互补测验与作图五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组(specific recombination)1.噬菌体基因组P204P204 通过重组、互补测验和测序研究，证明基因组有48502bp,61个基因。其中32个重要基因可分为2类：必需类24个基因，非必需类8个基因。即：五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组2.正常整合与切除P206P206 噬菌体仅能在Ecoli基因组gal 和bio基因之间插入称整合。在int基因编码的整合酶作用下，附着位点attP与Ecoli附着位点 attB 结合、交叉、
20、整合，进入Ecoli基因组。在xis基因编码的切除酶和整合酶共同作用下，能从Ecoli基因组内环去。细菌BOB接 POP呈BOP,POP接细菌BOB呈POBA末端酶基因 J尾部基因N反终止基因R宿主裂解酶 五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组3.异常剪接 几乎始终从Ecoli基因组内精确环去，但偶而也发生异常剪接。丢失必需基因环去时产生活性、非活性缺陷。从gal到尾部形成基因J之间异常环出，丢失了attP必需基因，为非活性缺陷型 dbio 从成斑基因N到bio异常环出，丢失attP与N之间非必需基因，多为活性缺陷 dgal。phage与Ecoli附着位点中有相互识别的核心序列能联绘-DNA
21、 POP 240bp核心序列O：15bp，富含A-T，非对称序列左序列P：160bp,-1600右序列P：80bp，080E.Coli BOB 23bp左序列B：-11 0右序列B：0 11核心序列O：与O相同POP与BOB相互识别(attP)核心序列与B(attB)相互识别五、五、噬菌体噬菌体专一性重组专一性重组3.噬菌体整合切除机理P207P207第第8章章 作业及复习题作业及复习题一、作业：一、作业：P2135.9 二、复习题二、复习题（一）名词注释（一）名词注释1.prophage2.nonsense mutation 3.suppressor-nonsense mutation 4p
22、lementation test 5.recombination test（二）填空（二）填空1.噬菌体(a+)与(+b)杂交，在E.coli K株内产生2.7%野生型，则Rf(ab)=(）。5.噬菌体转导a,b基因共导率愈高，说明a b基因的遗传距离愈（），cM值会愈（）。2、基因内不同位点间有结构差异的基因称为拟等位基因，基因内不同位点间的排列方式被称为（）差异，顺反位置效应被称为（）差异。3、T4phage突变体成对感染E.coli B株后代再感染K株测定重组率的方法称为（），它是基因内精细结构及遗传距离研究方法，通常称为()。4、在不允许基因交换的背景下，用成对的突变体混合接种测定成对
23、基因否遗传功能互补的实验方法称为（），成对的突变体在该遗传背景下能产生野生型说明它们（）。5、反式排列遗传功能不能互补的基因称（）基因，遗传功能能够互补的基因称为（）基因。（三）选择填空（三）选择填空1、a+b、ab+菌株在DavisU形管分开后有a+b+产生，加入二硝基苯后仍有a+b+产生，但加入某物种血清后不再产生野生型，则该细菌重组途径为(D)2、烈性噬菌体繁殖与侵染特点是（）a.核酸和蛋白质侵入寄主，b.噬菌体核酸插入寄主基因组内c.寄主裂解后子代释放，d.噬菌体核酸与寄主共生存3、琥珀型无义突变是指氨基酸密码子突变成如下密码子a.UAC(酪)UAA；b.UGC(半)UGA；c.UAC
24、(酪)UAG4、基因组有48502bp、61个基因，其中32个重要基因可分为必需和非必需类基因。如下（）基因是必需基因a.附着位点基因 att；b.整合酶基因int；c.切除酶基因xis；d.溶源基因s（四）是非题（正确题画（四）是非题（正确题画，错误题画，错误题画）1、噬菌体(a+)与(+b)杂交，野生型百分率为2.7%，则Rf(a-b)=2.7%。()2、噬菌体晚期功能基因就是指头部、尾部、尾丝装配基因，即成熟晚期功能基因。（）3、突变体两两成对直接接种到E.coli K株上，目的是在不允许基因交换情况下测定突变基因的遗传功能是否互补，称互补测验。（）（五）复习题 即作业题：P2135.9
