1、蛋白质的共价结构 Protein Protein 来自希腊字母，意思是来自希腊字母，意思是“头等重要的，原始的头等重要的，原始的”蛋白质蛋白质 来源于对蛋清（清蛋白）的研究来源于对蛋清（清蛋白）的研究 分布广：分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。部分都含有蛋白质。含量高：含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的干重的4545，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达肌等高达8080。一、蛋白质通论一、蛋白质通论 18331833年年 Paye
2、nPayen和和PersozPersoz分离出淀粉酶。分离出淀粉酶。18641864年年 Hoppe-SeylerHoppe-Seyler从血液分离出血红蛋白，从血液分离出血红蛋白，并将其制成结晶。并将其制成结晶。1919世纪末世纪末 FischerFischer证明蛋白质是由氨基酸组成证明蛋白质是由氨基酸组成的，并将氨基酸合成了多种短肽的，并将氨基酸合成了多种短肽 。19381938年年 德国化学家德国化学家Gerardus J.MulderGerardus J.Mulder引用引用“ProteinProtein”一词来描述蛋白质。一词来描述蛋白质。大事记：大事记：19511951年年 Pa
3、ulingPauling采用采用X X（射）线晶体衍射发现了蛋白（射）线晶体衍射发现了蛋白质的二级结构质的二级结构-螺旋螺旋(-helix)(-helix)。19531953年年 Frederick SangerFrederick Sanger完成胰岛素一级序列测定。完成胰岛素一级序列测定。19621962年年 John Kendrew John Kendrew 和和 Max PerutzMax Perutz确定了血红蛋确定了血红蛋 白的四级结构。白的四级结构。2020世纪世纪9090年代以后年代以后 后基因组计划。后基因组计划。蛋白质蛋白质(protein)(protein)是由许多是由许多
4、氨基酸氨基酸(amino(amino acids)acids)通过通过肽键肽键(peptide bond)(peptide bond)相连形成的高分相连形成的高分子含子含氮氮化合物。化合物。有些蛋白质还含有少量的有些蛋白质还含有少量的P P、FeFe、CuCu、MnMn、ZnZn、SeSe、I I等等。C 50 55%H 6 7%O 19 24%N 13 19%S 0 4%主要元素组成主要元素组成（二）蛋白质的化学组成和分类（二）蛋白质的化学组成和分类1 1、化学组成、化学组成：各种蛋白质的含氮量很接近，平均为各种蛋白质的含氮量很接近，平均为1616。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要
5、由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数每克样品含氮克数 6.251001/16%蛋白质元素组成的特点蛋白质元素组成的特点2 2、蛋白质的分类、蛋白质的分类 *根据蛋白质组成成分根据蛋白质组成成分 单纯蛋白质：单纯蛋白质：如：血清清蛋白如：血清清蛋白结合蛋白质结合蛋白质 =蛋白质部分蛋白质部分 +非蛋白质部分非蛋白质部分 如：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋白等如：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金属蛋
6、白等*根据蛋白质形状根据蛋白质形状 纤维状蛋白质：多为纤维状蛋白质：多为结构蛋白结构蛋白，难溶于水，难溶于水，如丝心蛋白等如丝心蛋白等球状蛋白质：多数具有球状蛋白质：多数具有生理活性，生理活性，多数可溶多数可溶 如血红蛋白、免疫球蛋白等如血红蛋白、免疫球蛋白等膜蛋白膜蛋白简简单单蛋蛋白白 清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白 albuminandglobulin 广泛存在于动物组织广泛存在于动物组织 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelinandprolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/碱碱 精蛋白和组蛋白精蛋白和组蛋白 碱性蛋白存在于细胞核碱性蛋白
7、存在于细胞核 硬蛋白硬蛋白 结结合合蛋蛋白白 色蛋白：色蛋白：简单蛋白简单蛋白+色素物质色素物质 糖蛋白：糖蛋白：简单蛋白简单蛋白+糖类物质糖类物质 脂蛋白：脂蛋白：简单蛋白简单蛋白+脂类结合脂类结合 核蛋白核蛋白：简单蛋白：简单蛋白+核酸核酸3、蛋白质的形状、蛋白质的形状纤维状蛋白质纤维状蛋白质 球状蛋白质球状蛋白质 膜结合蛋白质膜结合蛋白质Collagen Myoglobin Bacteriorhodopsin4、蛋白质的大小、蛋白质的大小 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在量在60006000道尔顿道尔顿以上的多肽称为蛋白质。以上的多肽称
8、为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大,从大约从大约60006000到到10000001000000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。1 1）酶的生物催化作用）酶的生物催化作用2 2）调控作用）调控作用参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等参与基因调控：组蛋白、非组蛋白等参与代谢调控：如激素或生长因子等参与代谢调控：如激素或生长因子等3 3）运动与支持）运动与支持机体的结构蛋白：机体的结构蛋白：头发、骨骼、牙齿、肌肉等头发、骨骼、牙齿、肌肉等4 4）参与运输贮存的作用）参与运输贮存的作用血红蛋白血红蛋白 运输氧运输氧铜蓝蛋白铜蓝蛋白 运输铜运输铜铁蛋白铁蛋白 贮存铁贮存铁5 5）免
9、疫保护作用）免疫保护作用抗原抗体反应抗原抗体反应凝血机制凝血机制6 6）参与细胞间信息传递）参与细胞间信息传递信号传导中的受体、信息分子等信号传导中的受体、信息分子等7 7）氧化供能氧化供能(三三)蛋白质的构象与蛋白质的结构组织层次蛋白质的构象与蛋白质的结构组织层次 每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，蛋每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，蛋白质特有的这种天然空间结构白质特有的这种天然空间结构，称为，称为构象构象。一级结构：一级结构：氨基酸顺序氨基酸顺序二级结构二级结构 ：螺旋、螺旋、折叠、折叠、转角转角,无规卷曲无规卷曲三级结构：三级结构：螺旋、螺旋、折叠、折叠、转角转角 松散肽段借
10、次级键形成球状松散肽段借次级键形成球状四级结构四级结构 ：多亚基聚集：多亚基聚集二、肽二、肽（一）肽（一）肽(peptide)(peptide)的定义的定义肽肽是由氨基酸通过是由氨基酸通过肽键肽键缩合而形成的化合物。缩合而形成的化合物。肽键肽键(peptide bond)(peptide bond)：是由一个氨基酸的是由一个氨基酸的-羧羧基与另一个氨基酸的基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的氨基脱水缩合而形成的化学键，本质为化学键，本质为酰胺键。酰胺键。氨基酸残基氨基酸残基(residue):(residue):肽链中的氨基酸分子因肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为为脱水缩合
11、而基团不全，被称为氨基酸残基。氨基酸残基。（二）肽键的结构（二）肽键的结构NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽键NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO蛋白质氨基酸残基数的估计蛋白质氨基酸残基数的估计 组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为组成蛋白质的氨基酸的平均分子量为128，每个氨基酸残基的平均分子量为每个氨基酸残基的平均分子量为110；对于简单蛋白质，用对于简单蛋白质，用110除它的相对分子量除它的相对分子量即可约略估计出其氨基酸残基数
12、目。即可约略估计出其氨基酸残基数目。计算题：计算题：一种蛋白质按其重量含有一种蛋白质按其重量含有1.65%亮氨酸和亮氨酸和2.48%异亮氨酸，计算该蛋白质最低分子量。异亮氨酸，计算该蛋白质最低分子量。（注：两种氨基酸的分子量都是（注：两种氨基酸的分子量都是131Da）。）。肽肽 键键 肽键的特点是氮原子上的孤对肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的电子与羰基具有明显的共轭作用共轭作用。组成肽键的原子处于同一平组成肽键的原子处于同一平面面酰胺平面。酰胺平面。肽键中的肽键中的C-NC-N键具有部分双键键具有部分双键性质，不能自由旋转。性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以在大多数情况下，以
13、反式结构反式结构存在。存在。CONCN+O-CNCOHC 根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目根据形成肽的氨基酸数目，一般氨基酸数目在在1212个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；个以内时，称为二肽、三肽、四肽等；1313个个至至2020个时称为个时称为寡肽寡肽（oligopeptideoligopeptide）；）；2020个以上个以上称为称为多肽多肽（polypeptidepolypeptide）。当分子量大到一定程）。当分子量大到一定程度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是度时，就称为蛋白质。寡肽和多肽的区分完全是人为规定的，其间的界限并不严格。人为规定的，其间的界限并不严格。（三）
14、肽的命名（三）肽的命名 一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游一条肽链是有方向性的，肽链的一端具有游离的离的氨基，称其为氨基，称其为N N端；另一端具有游离的端；另一端具有游离的羧基，称其为羧基，称其为C C端。有少数小分子量的肽，其首端。有少数小分子量的肽，其首尾也缩合成肽键，成为尾也缩合成肽键，成为环肽环肽。对于生物体内的具有特定结构和功能的小分对于生物体内的具有特定结构和功能的小分子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产子量肽，还有特别名称，如脑啡肽、内啡肽、催产素、加压素等。素、加压素等。N N 末端：多肽链中有末端：多肽链中有自由氨基自由氨基的一端的一端C C 末端：多肽链中有末
15、端：多肽链中有自由羧基自由羧基的一端的一端多肽链有方向性：多肽链有方向性：N端C端N末末端端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶（四）（四）.肽的理化性质：肽的理化性质：1.1.旋光性旋光性 一般一般短肽短肽的旋光度等于其各个氨基酸的的旋光度等于其各个氨基酸的 旋光度的总和。旋光度的总和。2.2.酸碱性质酸碱性质 偶极离子形式存在。偶极离子形式存在。pH014pH014范围内，肽键中的亚氨基不解离范围内，肽键中的亚氨基不解离 酸碱性质主要取决于：酸碱性质主要取决于：COOHCOOH 侧链上可解离的基团。侧链上可解离的基团。肽末端肽末端-羧基羧基pKapKa值比游离值比游离AAAA中的大。中的大。
16、肽末端肽末端-氨基氨基pKapKa值比游离值比游离AAAA中的小。中的小。肽的化学反应和氨基酸的一致，肽的化学反应和氨基酸的一致，N端的氨基酸端的氨基酸残基可以与残基可以与茚三酮反应茚三酮反应。双缩脲反应双缩脲反应是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有是肽和蛋白质特有的，氨基酸没有此反应。此反应。（五）（五）几种生物活性肽几种生物活性肽 1.谷胱甘肽谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性肽活性肽(active peptide)(active peptide)：生物体内存在大量的多肽和寡肽有很强的生物活生物体内存在大量的多肽和寡肽有很强的生物活性，称性，称活性肽。活性肽。GSH过氧过氧化物酶化物
17、酶H H2 2O O2 2 2GSH 2GSH 2H2H2 2O O GSSG GSSG GSHGSH还原酶还原酶NADPHNADPH+H H+NADPNADP+GSH GSH有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生有抗氧化剂的作用，可还原细胞内产生的过氧化氢。的过氧化氢。谷胱甘肽的生理功用：谷胱甘肽的生理功用：解毒作用；解毒作用；参与氧化还原反应；参与氧化还原反应；保护巯基酶的活性；保护巯基酶的活性；抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定。抗氧化剂作用，维持红细胞膜的稳定。体内许多激素属寡肽或多肽体内许多激素属寡肽或多肽2.2.多肽类激素及神经肽多肽类激素及神经肽 主要存在于指数神经系统，包括脑啡肽、主
18、要存在于指数神经系统，包括脑啡肽、内啡肽、强啡肽等和内啡肽、强啡肽等和P-P-物质。具有吗啡样的镇物质。具有吗啡样的镇痛作用。痛作用。神经肽神经肽(neuropeptide)3 3、抗菌肽、抗菌肽细菌的防御武器细菌的防御武器 抑制细菌或其他微生物生长或繁殖的物质；抑制细菌或其他微生物生长或繁殖的物质；由特定微生物产生，最常见的是由特定微生物产生，最常见的是青霉素青霉素，它是由，它是由半胱氨酸和缬氨酸结合成的二肽衍生物。主要破半胱氨酸和缬氨酸结合成的二肽衍生物。主要破坏细菌细胞壁糖肽的合成，引起溶菌。坏细菌细胞壁糖肽的合成，引起溶菌。三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定 Protei
19、nProtein的一级结构（的一级结构（primary structure)primary structure)定义：定义：是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、是指构成蛋白质的各种氨基酸的种类、数量、连接方式和排列顺序连接方式和排列顺序，由遗传信息（遗传密码）所，由遗传信息（遗传密码）所决定。涉及的化学键是决定。涉及的化学键是肽键肽键和少量的和少量的二硫键二硫键。研究意义：研究意义：1 1、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，、从分子水平上研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质的人工合成奠定了物质基础。为蛋白质的人工合成奠定了物质基础。2 2、诊断遗传病、合成基因探针等高新技术的、诊断遗传病、合
20、成基因探针等高新技术的研究具有重要意义。研究具有重要意义。蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从学研究的基础。自从19531953年年F.SangerF.Sanger测定测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。千种不同蛋白质的一级结构被测定。（一）蛋白质测序的要求（一）蛋白质测序的要求1 1，样品必需纯（，样品必需纯（97%97%以上）；以上）；2 2，知道蛋白质的分子量；，知道蛋白质的分子量；3 3，知道蛋白质由几个亚基组成；，知道蛋白质由几个亚基组成；4 4，测定蛋白质的氨基酸组
21、成；并根据分子量计，测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。算每种氨基酸的个数。5 5，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。，测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。（二）测定步骤（二）测定步骤 1、多肽链的拆分。多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。1、多肽链的拆分。多肽链的拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用醇化酶为二聚体；可用8mol/L8mol/L尿素尿素或或6 6mol/Lmol/L盐酸胍盐酸胍处理，即可分开多肽链处
22、理，即可分开多肽链(亚基亚基).).2、测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。数目。几条多肽链通过二硫键交联在一起。可几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6 6mol/Lmol/L盐酸胍存在下，盐酸胍存在下，用过量的用过量的-巯基乙醇巯基乙醇处理，使二硫键还原为处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。以防
23、止它重新被氧化。3 3、二硫键的断裂、二硫键的断裂4 4、测定每条多肽测定每条多肽链的氨基酸组成，链的氨基酸组成，并计算出氨基酸并计算出氨基酸成分的分子比；成分的分子比；氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪和和肽链氨基酸顺序自动肽链氨基酸顺序自动测定仪测定仪，对蛋白质多，对蛋白质多肽氨基酸排列顺序的肽氨基酸排列顺序的测定提供了极大的方测定提供了极大的方便。便。1、N末端末端分析分析二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（DNFB法）：用法）：用DNFB（Sanger试剂）试剂）与肽链与肽链N末端的氨基反应，生成末端的氨基反应，生成DNP多肽多肽或或DNP蛋白质。然后水解肽链，分离得到蛋白质。然后水解肽链，分离
24、得到DNP氨基酸，纸层析、薄层层析或氨基酸，纸层析、薄层层析或HPLC分离鉴定。分离鉴定。丹磺酰氯法（丹磺酰氯法（DNS法）：与法）：与DNFB法类似，由于法类似，由于丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比丹磺酰氯有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高法高100倍。倍。（三）（三）N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的测定末端氨基酸残基的测定苯异硫氰酸酯法（苯异硫氰酸酯法（Edman降解法）：肽链与降解法）：肽链与PITC（Edman试剂）试剂）反应生成反应生成PTC多肽或多肽或PTC蛋白质，在酸蛋白质，在酸性有机溶剂中加热时，性有机溶剂中加热时，N末端的末端的PTC氨基酸发生氨基酸发生环化环化，生，生
25、成苯乙内酰硫脲的衍生物（成苯乙内酰硫脲的衍生物（PTH氨基酸）并从肽链上脱落氨基酸）并从肽链上脱落下来，除去下来，除去N末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的。分离PTH氨基酸并鉴定。氨基酸并鉴定。氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析氨肽酶法：根据游离氨基酸出现的时间顺序分析N末端氨末端氨基酸。值得注意是不同的基酸。值得注意是不同的N末端氨基酸水解的速度不同，有末端氨基酸水解的速度不同，有时难以分析。时难以分析。2、C末端末端分析分析（1 1）肼解法：蛋白质或多肽与）肼解法：蛋白质或多肽与无水肼无水肼加热发生肼解。反应加热发生肼解。反应中除中除C末端氨
26、基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变末端氨基酸以游离形式存在外，其它氨基酸都转变成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲成相应的氨基酸酰肼。反应中生成的氨基酸酰肼可与苯甲醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游醛作用变成水不溶性的二苯基衍生物而沉淀。上清液中游离的离的C末端氨基酸借助末端氨基酸借助DNFB法或法或DNS法鉴定。法鉴定。肼解法反应式肼解法反应式（2 2）还原法：肽链）还原法：肽链C末端的氨基酸可用末端的氨基酸可用硼氢化硼氢化锂锂还原成相应的还原成相应的氨基醇，肽链水解后层析鉴氨基醇，肽链水解后层析鉴定。定。（3 3）羧肽酶法：目前常用的有）羧肽酶法：目前常用
27、的有4种羧肽酶：种羧肽酶：A、B、C和和Y。羧肽酶。羧肽酶A能释放除能释放除Pro、Arg和和Lys之外的任之外的任何一种何一种C末端氨基酸；羧肽酶末端氨基酸；羧肽酶B只能水解以碱性氨只能水解以碱性氨基酸基酸Arg和和Lys为为C末端的氨基酸；羧肽酶末端的氨基酸；羧肽酶C和和Y可可以释放任何一种以释放任何一种C末端氨基酸。末端氨基酸。-Val-Ser-Gly还原法断裂二硫桥还原法断裂二硫桥巯基保护反应巯基保护反应（四）二硫桥的断裂（四）二硫桥的断裂氧化法断裂二硫桥氧化法断裂二硫桥过甲酸过甲酸（五）氨基酸组成的分析（五）氨基酸组成的分析酸水解分析除酸水解分析除色氨酸色氨酸外的其它氨基酸，碱水解分
28、外的其它氨基酸，碱水解分析色氨酸。析色氨酸。氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染氨基酸的分析：离子交换柱层析分离，茚三酮染色，比色定量。色，比色定量。氨基酸分析仪示意图氨基酸分析仪示意图长柱用于分离酸长柱用于分离酸性和中性氨基酸性和中性氨基酸短柱用于分离碱短柱用于分离碱性氨基酸和氨性氨基酸和氨柱中填料为细粒聚苯乙烯柱中填料为细粒聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂磺酸型阳离子交换树脂氨基酸的离子交换柱层析图谱氨基酸的离子交换柱层析图谱洗洗脱脱曲曲线线（六）多肽链的部分裂解（六）多肽链的部分裂解酶裂解法酶裂解法：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋
29、白酶、木瓜蛋白酶等，酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等，它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽它们各自有自己的水解专一性。蛋白酶分为内肽酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。酶和外肽酶（羧肽酶、氨肽酶）。化学裂解法化学裂解法：溴化氰（只裂解由：溴化氰（只裂解由Met的羧基的羧基形形成的肽键，成的肽键，选择性选择性）、羟胺（裂解）、羟胺（裂解Asn-Gly之间之间的肽键，也能部分裂解的肽键，也能部分裂解Asn-Leu及及Asn-Ala之间之间的肽键，的肽键，专一性专一性）。）。蛋白酶的专一性蛋白酶的专一性溴化氰裂解法溴化氰裂解法溴化氰只裂溴化氰只裂解由解由Met的的羧基羧基形成的形成的肽键肽
30、键（七）氨基酸序列测定（七）氨基酸序列测定1 1、质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪、质谱法：两台质谱仪联用，第一台质谱仪通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小通过电喷射电离使肽段带上电荷，将不同大小的的肽段分离肽段分离。第二台质谱仪。第二台质谱仪分析肽段的序列分析肽段的序列。在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气在第二台质谱仪上，小肽段在碰撞池中与氮气分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基分子或氩气分子碰撞，碎裂成依次少一个氨基酸残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得酸残基的碎片，分析这些碎片的质量差，可得出序列。出序列。特点：灵敏度高、所需样品少、测定速度快。特点：灵敏度高、所需样
31、品少、测定速度快。串联质谱仪串联质谱测序工作原理串联质谱测序工作原理分离肽段分离肽段测序测序2、Edman降解法降解法：由：由N端向端向C端逐步降解。先将端逐步降解。先将被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分被测肽段的羧基端固定到不溶性的树脂上，便于分离切下的氨基酸和剩余的肽段。离切下的氨基酸和剩余的肽段。3、酶降解法酶降解法：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只：用外肽酶逐个切下氨基酸分析。只能分析很少的几个氨基酸。能分析很少的几个氨基酸。4 4、根据核苷酸序列的推定法根据核苷酸序列的推定法：找到该蛋白质的基：找到该蛋白质的基因，从基因的编码序列按三联密码推出氨基酸序列。因，从基因的编码序列
32、按三联密码推出氨基酸序列。同源蛋白质：同源蛋白质：来自来自不同不同生物体、生物体、执行同一执行同一/相似功能的蛋白质相似功能的蛋白质 同种蛋白质：同种蛋白质：来自来自相同相同生物体、生物体、执行同一功能的蛋白质执行同一功能的蛋白质三、蛋白质的三、蛋白质的AAAA序列与生物功能序列与生物功能 一百多个一百多个AA残基残基 MW约约12.5103 2 8个不变残基个不变残基 invariant residues(yellow)conservative substitutions(blue)nonconservative or variable residues(unshaded)Conservat
33、ion and variation of cytochrome c sequences 对不同种属的细胞色素对不同种属的细胞色素c c的研究同样指出具有同种功能的的研究同样指出具有同种功能的蛋白质在结构上的相似性。蛋白质在结构上的相似性。对对100100个种属的细胞色素个种属的细胞色素c c的一级结构进行了分析，发现亲的一级结构进行了分析，发现亲缘关系越近，其结构越相似。缘关系越近，其结构越相似。细胞色素细胞色素c c的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。之间的分类学关系，以及绘制进化树。根据进化树不仅可以研究从单细胞
34、到多细胞的生物进化过根据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。1 1、氧合血红蛋白、氧合血红蛋白该酶类活性中心的该酶类活性中心的Ser残基残基起关键作用起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶凝血酶和纤溶酶有有序列同源性序列同源性对对底物偏爱不同底物偏爱不同（三）血液凝固与（三）血液凝固与AAAA序列的局部断裂序列的局部断裂 凝血酶原凝血酶原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原血液凝固：在凝血因子的作用下，可溶性的血纤蛋白原转变为不溶性的血纤蛋
35、白网。转变为不溶性的血纤蛋白网。可溶性的可溶性的血纤蛋白原血纤蛋白原酶酶有活性的凝血酶有活性的凝血酶不溶性的不溶性的血纤蛋白网血纤蛋白网（一）肽的人工合成（一）肽的人工合成 保护（保护（氨基、羧基、侧链活性基团氨基、羧基、侧链活性基团）活化（活化（氨基、羧基氨基、羧基）缩合剂缩合剂（二）胰岛素的人工合成（二）胰岛素的人工合成 1965年中国完成了牛胰岛素的全合成。年中国完成了牛胰岛素的全合成。（三）固相肽合成（三）固相肽合成（一）肽的人工合成（一）肽的人工合成 最广泛应用的氨基保护基是最广泛应用的氨基保护基是苄氧甲酰基苄氧甲酰基，它，它可以用催化加氢或用金属钠在液氨中处理去除。可以用催化加氢或
36、用金属钠在液氨中处理去除。其它可以用作氨基保护基的还有其它可以用作氨基保护基的还有三苯甲基、叔丁三苯甲基、叔丁氧甲酰基、对甲苯磺酰基氧甲酰基、对甲苯磺酰基等，这些基团可以用等，这些基团可以用HBr/CH3COOH在室温下除去。在室温下除去。氨基的保护氨基的保护羧基的保护羧基的保护 羧基一般用羧基一般用盐或酯盐或酯的形式保护。盐是对羧基的形式保护。盐是对羧基临时性的保护。酯有甲临时性的保护。酯有甲酯、乙酯、苄酯和叔丁酯酯、乙酯、苄酯和叔丁酯等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。等。甲酯和乙酯可用皂化法除去，但易引起消旋。苄酯可用苄酯可用H2/Pd法或金属钠液氨法除去。叔丁法或金属钠液氨法除
37、去。叔丁酯可在温和条件下用酸除去。酯可在温和条件下用酸除去。侧链侧链上活泼基团的保护上活泼基团的保护 侧链上需要保护的活泼侧链上需要保护的活泼基团有：基团有：Asp和和Glu的的和和羧基，羧基，Ser、Thr和和Tyr的羟基，的羟基，Cys的巯的巯基，基，Lys的的氨基，氨基，Arg的胍基等。这些保护基团的胍基等。这些保护基团有有苄基、对甲苯磺苄基、对甲苯磺酰基、甲基酰基、甲基等。等。羧基的活化：羧基的活化：早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而早期用酰氯，但反应太激烈，后来采用叠氮法，而现在应用最多的是现在应用最多的是活化酯法活化酯法和和混合酸酐法混合酸酐法。氨基酸的活化：接肽时加入氨基酸的活化：接肽时加入有机碱如三乙胺或有机碱如三乙胺或KHCO3等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。等，保证氨基处于自由状态，氨基即活化。Robert Bruce Merrifield and the first-generation solid-phase peptide synthesizer.为什么要合成大量不同结构的多肽异为什么要合成大量不同结构的多肽异构体？构体？在药物化学和分子生物学等领域的研究中，在药物化学和分子生物学等领域的研究中，需要大量的异构体，以便进行结构与活性关系的需要大量的异构体，以便进行结构与活性关系的研究和生物活性筛选。研究和生物活性筛选。谢谢大家！
