1、第三章基因工程的酶学基础优选第三章基因工程的优选第三章基因工程的酶学基础酶学基础一一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （restriction endonucleaserestriction endonuclease）这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 是一类能够识别双链是一类能够识别双链DNADNA分子中的某种特定分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割核苷酸序列，并由此切割DNADNA双链结构的核苷双链结构的核苷酸内切酶酸内切酶寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction）与修饰与修饰 (modification)(modi
2、fication)现象现象 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍，即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉R/MR/M体系体系 寄主是由两种酶活性配合完成的寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶另一种是核酸内切限制酶E.coliBE.coliB含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 当当(k)(k)噬菌体侵染噬菌体侵染E.coliBE.coliB时，由于其时，由于其DNADNA中中有有EcoBEc
3、oB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而而E.coliBE.coliB的的DNADNA中虽然也存在这种特异序列，但中虽然也存在这种特异序列，但可在可在EcoBEcoB甲基化酶的作用下，催化甲基化酶的作用下，催化S S腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。使之甲基化。EcoBEcoB核酸酶不能识别已甲基化的序核酸酶不能识别已甲基化的序列。列。R/M体系的作用 保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解限制性内切酶本是
4、微生物细胞中用于专门水解外源外源DNADNA的一类酶，其功能是避免外源的一类酶，其功能是避免外源DNADNA的干的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于由于R/MR/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。工程重要的工具酶。根据酶的功能、大小和反应条件，及切割根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNADNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类：的特点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型酶、型酶、型酶型酶限制性内切酶的分类限制性内切酶的分类型酶：型酶：19681968年，年，M.Meselson
5、M.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在E.E.colicoliB B和和E.E.colicoliK K中分离出的核酸内切酶。中分离出的核酸内切酶。分子量较大，反应需分子量较大，反应需MgMg+、S-S-腺苷酰腺苷酰-L-L-甲硫甲硫氨酸（氨酸（SAMSAM）、）、ATPATP等。这类酶有特异的识别位等。这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。所以在基因工程中应用不大。型酶型酶 这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的33端端2426bp2426bp处切
6、开，所以它的切割位点处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。也是没有特异性的。型酶型酶 19701970年，和在流感嗜血年，和在流感嗜血RdRd株中分离出来的限制酶。株中分离出来的限制酶。分子量较小（分子量较小（10105 5DaDa），只有一种多肽，通常以同），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需源二聚体的形式存在。反应只需MgMg+的存在，并且的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。得到广泛的应用。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构
7、上。在这一回文对称结构上。许多许多型酶切割型酶切割DNADNA后，可在后，可在DNADNA上形成粘性末端，上形成粘性末端，有利于有利于DNADNA片段的重组。片段的重组。主要特性主要特性I 型型II型型III 型型限制修饰限制修饰多功能多功能单功能单功能双功能双功能蛋白结构蛋白结构异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体辅助因子辅助因子ATP Mg2+SAMMg2+Mg2+SAM ATP识别序列识别序列TGAN8TGCT AACN6GTGC旋转对称序列旋转对称序列 GAGCCCAGCAG切割位点距切割位点距距识别序列距识别序列1kb处随机性切割处随机性切割识别序列内或附近识
8、别序列内或附近特异性切割特异性切割识别序列下游识别序列下游24-26bp处处第一个字母 大写，表示所来自的微生物属名的第一个字母 第二、三字母小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母 其它字母 大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号 罗马数字 表示该菌株发现的限制酶的编号 3.3.限制性核酸内切酶的命名原则：限制性核酸内切酶的命名原则：例：例：EcoR I:来自于来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶的第一个限制酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶Haemophilus influenzae d属名种名株名嗜血流感杆菌d株H i n d II H i n d II
9、I19681968年，年，SmithSmith等人首先从流感嗜血杆菌等人首先从流感嗜血杆菌d d株中分离出株中分离出HindIIHindII和和HindIIIHindIII许多型酶切割DNA后，可在DNA上形成粘性末端，有利于DNA片段的重组。杂种位点（hybrid site）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。（3）、用S核酸内切酶消化除去单链区的发夹结构。（3）提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、合成cDNA的主要步骤（1）粘性末端 两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末
10、端的DNA片断。核酸内切酶作用后的断裂方式（1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用3 32p AGA5用于在平头DNA上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端1957年，美国的生物学家A.3 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5（3）提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）对天然的T7DNA聚合酶进行修饰，使之完全失去3 5的外切酶活性。6影响核酸内切酶活性的因素识别序列内或附近特异性切割1、底物四种脱氧核苷5三磷酸（dNTP）；2 DNA片断末端标记ATP的用量10mol1mmol/L之间4限制酶的特性限制酶的特性a.a.限制酶识别靶序列同限制酶识别靶序列同D
11、NADNA的来源无关；的来源无关；b.b.限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只限制酶识别靶序列是唯一的（对某种限制酶只具一个限制位点的质粒）。具一个限制位点的质粒）。二、二、型酶型酶1.II 1.II 型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构旋转对称型回文结构EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5 G C T G A A T T C G A G 33 C G A C T T A A G C T C 55G-C-T-G-OH P-A-A-T-
12、T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5EcoRI等产生的5 粘性末端5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5退火4-7 OH P5G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 P OHEcoRI 37 PstI等产生的3粘性末端5G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 55G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A-C-G
13、-T-C-C-T-C 5PstI 37 退火4-7 OH P5G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 P OHPvuII等产生的平头末端5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5PvuII 37 2.2.核酸内切酶作用后的断裂方式核酸内切酶作用后的断裂方式 （1 1）粘性末端粘性末端 两条链上的断裂位置是交错地、两条链上的断裂位置是交错地、但又是围
14、绕着一个对称结构中心，这样形式的断但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的裂结果形成具有粘性末端的DNADNA片断。片断。BamH IGGATCCCCTAGGGCCTAGGGATCC G+5-端突出端突出粘性末端粘性末端 3-端突出端突出 5 AATTC 3 5 3 ACGTC（2 2）平末端）平末端 两条链上的断裂位置是处在一个对称结两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的的DNADNA片断。片断。不易重新环化。不易重新环化。Hind GTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG+3 3同裂
15、酶（同裂酶（isoschizomers)isoschizomers)指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶，同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。Example:Example:限制酶限制酶HpaHpa和和MspMsp是一对同裂酶是一对同裂酶 (CCGG)(CCGG)，当靶序列中有一个当靶序列中有一个5-5-甲基胞嘧啶时甲基胞嘧啶时HpaHpa不能进不能进行切割，而行切割，而MspMsp可以。可以。连接酶（DNA ligase）1）从T4噬菌
16、体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。GGCCTAGGCC重复升温94度之后仍具有酶活性。3）在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的32pdNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。一般特点 来自于E.1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。酶AMP（腺苷磷酸）3)DNA序列测定时作顺序缺失大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、（4）、DNA序列的测定。1)正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度5 3的聚合酶活性；由于碱基错配不能形成磷酸二酯键3同裂酶（isoschizomers)5-端突出3)
17、DNA序列测定时作顺序缺失Pol 的功能同DNA的复制有关；1978年，S.OH PTris-HCl 50 mM pH 7.4 4同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。的选择余地更大。杂种位点（杂种位点（hybrid sitehybrid site）由一对同尾酶分别产生的）由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。粘性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。一般不能
18、被原来的任何一种同尾酶识别。BamHBamH G GATC C G GATC C BclBcl T GATC A T GATC A C CTAG G A CTAG T C CTAG G A CTAG T 杂种位点杂种位点 ：T GATCT GATC C C（BamHBamH ）（Bcl）ACTAG GACTAG G 5 5限制片断的末端连接作用限制片断的末端连接作用 （）分子间的连接不同的（）分子间的连接不同的DNADNA片断通过互片断通过互补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连补的粘性末端之间的碱基配对而彼此连接起来。接起来。（2）分子内的连接：由同一片断的两个互补）分子内的连接：由同一片断的两
19、个互补末端之间的碱基配对而形成的环形分子末端之间的碱基配对而形成的环形分子6.II 6.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件Tris-HCl 50 mM pH 7.5MgCl2 10 mM 0-50 mM 低盐酶NaCl 0-150 mM 100 mM 中盐酶DTT 1 mM 150 mM 高盐酶Volume 20-100 lT 37 1-1.5 h1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1 g 标准DNA所需的酶量对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：BamHI SmaI5 GC
20、TACATGGATCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：5 GCTACATG GATTCCCGGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5 5 GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT33 CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切
21、 一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切0.1倍体积的5 M NaAc pH 5.42.5倍体积的冰冷乙醇冰浴5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥6 6影响核酸内切酶活性的因素影响核酸内切酶活性的因素（）（）DNADNA的纯度的纯度蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTTAEDTTA、SDSSDS、NaClNaCl等等DNaseDNase的污染的污染(Mg+)(Mg+)a.a.增加核酸内切限制酶的用量；增加核酸内切限制酶的用量；b.b.扩大酶催化反应的体系（稀释）；扩大酶催化反应的体系（稀释）；c.c.延长酶催化反应的保温时间。延长
22、酶催化反应的保温时间。d.d.加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度加入亚精胺提高酶的消化作用，需适当的温度（2 2）DNADNA的甲基化程度的甲基化程度l大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6 6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响l大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5 5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等l哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5 5位上引入甲基 高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性
23、，即所谓的Star activity现象。EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC 3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATTPyPy3或者5AATT 3（3 3）核酸内切酶的缓冲液性质）核酸内切酶的缓冲液性质嘧啶碱基嘧啶碱基T/C嘌呤碱基嘌呤碱基A/G（4 4）酶切消化反应的温度：酶切消化反应的温度：大多数酶的标准反应温度大多数酶的标准反应温度 37度度（5 5）DNADNA的分子结构：的分子结构：某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性的所需要的酶量要比消化线性的DNA高高29倍倍识别双链
24、DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回文对称结构上。OH P7核酸内切限制酶标准的缓冲液用来对5突出末端的DNA片断作末端标记。（）DNA接头（adapter）连接法II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性，将会发挥作用。合成cDNA的主要步骤A G T G A C C T A C C T3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C
25、5大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、Pol同DNA分子克隆的关系最为密切。不易重新环化。同聚物加尾法或T4连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。2)碱基释放速度CATG主要作用是以mRNA为模板合成cDNA；7 7核酸内切限制酶标准的缓冲液核酸内切限制酶标准的缓冲液（1 1）.氯化镁、氯化钠或氯化钾氯化镁、氯化钠或氯化钾 不正确的不正确的NaClNaCl或或Mg+Mg+浓度，会降低限制酶的活性，浓度，会降低限制酶的活性，还可能导致识别序列的改变还可能导致识别序列的改变 （2 2）.TrisHCl.TrisHCl 维持最适的维持最适的p
26、HpH值（值（pH pH 7.47.4）（3 3）.巯基乙醇或二硫苏糖醇（巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTTDTT）维持酶的稳定性维持酶的稳定性（4 4）.牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSABSA）维持酶的稳定性维持酶的稳定性8 8核酸内切限制酶对核酸内切限制酶对DNADNA的消化作用的消化作用（1 1）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列）核酸内切限制酶以同型二聚体形式与靶序列发生作用发生作用（2 2）核酸内切限制酶对）核酸内切限制酶对DNADNA的局部消化的局部消化 完全的酶切消化识别序列完全的酶切消化识别序列n n个碱基的核酸内切限制个碱基的核酸内切限制酶，对酶，对DNADNA的切割能达到每隔的
27、切割能达到每隔4n4n切割一次的水平切割一次的水平（3 3）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用）核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用小分子量的片断少小分子量的片断少 （电泳容易分离目的片断）（电泳容易分离目的片断）大分子量的片断多（基因文库）大分子量的片断多（基因文库）1连接酶2体外连接1 1连接酶连接酶2 2体外连接体外连接1.1 1.1 连接酶的作用机理连接酶的作用机理 能够将能够将DNADNA链上彼此相邻的链上彼此相邻的33羟基（羟基（OHOH）和和55磷酸基团（磷酸基团（P P），在），在NAD+NAD+或或ATPATP供能的供能的作用下，形成磷酸二酯键。作用下，形成磷酸二酯
28、键。只能连接缺口（只能连接缺口（nicknick），不能连接裂口），不能连接裂口（gapgap）。而且被连接的）。而且被连接的DNADNA链必须是双螺链必须是双螺旋旋DNADNA分子的一部分。分子的一部分。酶酶AMPAMP（腺苷磷酸）（腺苷磷酸）磷酸酰胺键磷酸酰胺键DNADNA的腺苷酸复合物的腺苷酸复合物3-OH3-OH对对P P原子作亲核攻击原子作亲核攻击 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键连接酶的作用机理连接酶的作用机理此反应是由焦磷酸此反应是由焦磷酸 (ppi)(ppi)的水解作用激发的的水解作用激发的需要花费两个高能磷酸键需要花费两个高能磷酸键（赖氨酸残基赖氨酸残基）1.2连接酶的来源 .D
29、NA连接酶 大肠杆菌染色体编码的 .T4 DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的 DNA连接酶 NAD+T4 DNA连接酶 ATP连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）该酶常从噬菌体的受体细胞中提取，是由该酶常从噬菌体的受体细胞中提取，是由噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连噬菌体基因组所编码的，基因工程中常用的连接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键接酶是连接酶。它可催化中磷酸二脂键的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来的形成，从而使两个片段以共价键的形式结合起来 DNADNA连接酶对具有粘性末端的连接酶对具有粘性末端的DNADNA分子经退火后分子经退火后能很好
30、地连接，对平末端的能很好地连接，对平末端的DNADNA分子也可以进行连分子也可以进行连接，但连接效率较低，必须加大酶的用量接，但连接效率较低，必须加大酶的用量。1.3 影响连接酶作用的因素（1）反应温度 连接缺口的温度37度 连接粘性末端的最佳温度 415度（2）连接酶的用量 平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。ATP的用量10mol1mmol/L之间（3）提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）2.2.体外连接体外连接体外连接的三种方式体外连接的三种方式a.a.用用DNADNA连接酶连接具有互补粘性末端的连接酶连接具有互补粘性
31、末端的DNADNA片断片断b.b.用用T T4 4DNADNA连接酶将平末端的连接酶将平末端的DNADNA片断连接；或是片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNADNA片断片断加上加上poly(A)-poly(T)poly(A)-poly(T)尾巴之后，再用尾巴之后，再用DNADNA连接连接酶连接。酶连接。c.c.先在先在DNADNA片断末端加上化学合成的衔接物或接片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用头，形成粘性末端后，再用DNADNA连接酶连接连接酶连接 2.1 粘性末端DAN片断的连接 由于具粘性末端的载体易发生自连，对载体
32、的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。而外源片断的5P能与载体的3OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5P的链不能进行连接，形成3 OH 和5 OH 的缺口。2.2 平末端DNA片断的连接 （1）T4DNA连接酶 （2)用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。常用的连接方法同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特异的核酸外切酶处理末端特异的核酸外切酶处理DNADNA片断片断在在A A和和B B分别中加入分别中加入dATPdATP
33、和和dTTPdTTP同聚物尾巴同聚物尾巴10104040个碱基个碱基 同聚物加尾法或同聚物加尾法或T4T4连接酶的平末端连接酶的平末端连接法，无法用原来的限制酶作特异性连接法，无法用原来的限制酶作特异性的切割，对获得插入片断进行进一步的的切割，对获得插入片断进行进一步的研究。研究。衔接物连接法衔接物连接法 平末端的另一种处理方式是利用衔接物平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linkerlinker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子是一种人工合成的小分子DNADNA，约，约10201020个核苷酸，个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性
34、核酸内切酶的酶切位其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。如：点的回文结构。如：CCGGATCCGG CCGGATCCGG GGCCTAGGCC GGCCTAGGCC 将衔接物分子与平末端将衔接物分子与平末端DNADNA分子连接，再用限制分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点 Hpa II Hpa IIBamH I 或或Sau3A 衔接物（衔接物（linkerlinker）：是指用化学方法合成的）：是指用化学方法合成的一段由一段由1010
35、1212个核苷酸组成、具有一个或数个个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。段。衔接物连接法衔接物连接法双衔接物：可以实现定向克隆，双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断防止发生自连，同时对克隆片断的再删除也比较方便。的再删除也比较方便。双衔接物连接双衔接物连接法的基本程序法的基本程序cDNAcDNA链的合成链的合成通过通过DNADNA聚合酶合成第二链聚合酶合成第二链加入加入Sal Sal I I衔接物衔接物S S I I核酸酶作用后的末端单链突出序列，核酸酶作用后的末端单链突出序列，由由KlenowKl
36、enow补齐，加入第二衔接物补齐，加入第二衔接物Ecol Ecol I I 在用在用DNADNA衔接物连接法时，如果待衔接物连接法时，如果待克隆克隆DNADNA的片断或基因内部，含有与的片断或基因内部，含有与所加衔接物相同的限制位点，在酶切所加衔接物相同的限制位点，在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把克隆的基因切断。会把克隆的基因切断。（）（）DNADNA接头（接头（adapteradapter）连接法）连接法 1978 1978年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的年，美国康奈尔大学生化分子生物学系的教授吴瑞博士发明的。教授吴瑞博士发明的。它是一类人工合成
37、的一头具有某种限制酶粘性它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。断。粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对样的二聚体分子。对DNADNA接头分子末端，进行必要接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端的修饰。移走粘性末端5P5P，暴露出，暴露出5OH5OH，不能，不能产生稳定的二聚体分子。产生稳定的二聚体分子。DNA接头连接法接头连接法（）热稳定的连接热稳定的连接 从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。从嗜热高温方线菌的菌株中分离出来的。能在高温下催
38、化两条寡核苷酸探针发生连接能在高温下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。可明显的降低形成非特异用的一种核酸酶。可明显的降低形成非特异性连接产物的几率，在性连接产物的几率，在8585度下具有酶活性。度下具有酶活性。重复升温重复升温9494度之后仍具有酶活性。度之后仍具有酶活性。寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定 （oligonucletide ligation assay,OLAoligonucletide ligation assay,OLA）用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNADNA杂交，杂交，探针在靶探针在靶DNADNA分子的位置是相邻的。分子的
39、位置是相邻的。探针长度是探针长度是202025bp25bp 连接酶链式反应（连接酶链式反应（lingase chain reaction,LCRlingase chain reaction,LCR）连接扩增反应（连接扩增反应（lingase amplication reactionlingase amplication reaction）用寡核苷酸探针通过用寡核苷酸探针通过DNADNA连接酶的作用扩增已知连接酶的作用扩增已知序列的靶序列的靶DNADNA的方法。需要的方法。需要4 4种引物。种引物。寡核苷酸连接测定寡核苷酸连接测定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C
40、T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待扩增的待扩增的DNA片断片断PPBBDD地高辛配基地高辛配基生物素生物素磷酸磷酸BBBBDDPP阳性信号阳性信号无信号无信号链霉抗生素蛋白链霉抗生素蛋白由于碱基错配不能形成磷酸二酯键由于碱基错配不能形成磷酸二酯键检测单碱基的检测单碱基的取代、插入、取代、插入、及缺失而引起及缺失而引起的多态性的多态性碱性磷酸酶碱性磷酸酶碱性磷酸碱性磷酸酶底物酶底物LCR：ligase chain reaction，连
41、接酶链式反应。连接酶链式反应。样品样品DNA、探针、探针(4)94度变性、度变性、NAD55度退火三、三、DNA聚合酶 常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、反转录酶等。共同点共同点 把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNADNA分子引物链的分子引物链的3OH3OH末端，催化核末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。板上解离的情况。1.大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶（聚合酶（PolPol）、）、DNADN
42、A聚合酶聚合酶（Pol Pol ）、）、DNADNA聚合酶聚合酶 （Pol Pol ）、）、PolPol和和Pol Pol 的主要功能参与的主要功能参与DNADNA的合成；的合成；Pol Pol 的功能同的功能同DNADNA的复制有关；的复制有关；PolPol同同DNADNA分子克隆的关系最为密切。分子克隆的关系最为密切。1.1 1.1 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶 1957 1957年，美国的生物学家年，美国的生物学家A.KornbergA.Kornberg首次首次证实，在大肠杆菌提取物中存在一种证实，在大肠杆菌提取物中存在一种DNADNA聚合聚合酶，即现在所说的酶，即现在所说的
43、DNADNA聚合酶。由聚合酶。由polpol基基因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为因编码的一种单链多肽蛋白质，分子量为109109103dal103dal。DNA DNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的断，一个具有全部的3 53 5的外切酶活性的外切酶活性和和5 3 5 3 的聚合酶活性，另一个具有全的聚合酶活性，另一个具有全部部5 35 3的外切酶活性。的外切酶活性。DNADNA聚合酶的酶活性：聚合酶的酶活性：1.5 31.5 3的聚合酶活性；的聚合酶活性；2.5 32.5 3的外切酶活性；的外切酶活性；3.3 53.3 5的外切酶活性（较
44、低）。的外切酶活性（较低）。1.2 DNA聚合酶发挥作用的条件 1、底物四种脱氧核苷5三磷酸（dNTP）；2、Mg离子；3、带有3OH游离基团的引物链；4、DNA模板单链，双链（糖磷酸主键上有一个或多个断裂）。Pol Pol 1.3 DNA1.3 DNA聚合酶聚合酶5 35 3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1 1、5 35 3的外切酶活性，所切割的的外切酶活性，所切割的DNADNA链必须是位于双链必须是位于双螺旋的区段上；螺旋的区段上；2 2、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距、切割部位可以是末端磷酸二酯键，也可以是在距55末末端数个核苷酸远的一个键上发生；端数个核苷酸远的一个键上
45、发生；3 3、DNADNA的合成可以增强的合成可以增强5 35 3的核酸外切酶活性；的核酸外切酶活性；4 4、5 35 3核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点核酸外切酶的活性位点同聚合作用的活性位点以及以及3 53 5的水解作用位点是分开的。的水解作用位点是分开的。1.4 DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性 能催化DNA链发生水解作用，从DNA链3OH末端开始向5的方向水解DNA，并释放出单核苷酸分子。对酶活的影响 反应物中缺乏dNTPs时，大肠杆菌DNA聚合酶的3 5核酸外切酶活性，将会发挥作用。但对于底物是双链的DNA，在具有dNTPs时，这种降解活性将会被5 3的聚合酶活性所抑制。1
46、.5 DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途 通过DNA缺口转移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针 DNA缺口转移（nick translation）在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶的5 3核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5一侧移去一个5核苷酸之后，聚合酶作用就会在缺口的3一侧补上一个新的核苷酸，但pol不能在3OH和5P之间形成一个键，随着5一侧的核苷酸不断移去，3一侧的核苷酸又按序列增补，缺口便沿着DNA分子合成的方向移动 DNA杂交探针的制备 典型的反应体系是。在25l总体积中含有1g纯化的特定DNA片断，并加入适量的Dnase、Pol、32pd
47、NTPs和未标记的dNTPs。Dnase 造成DNA分子的断裂或缺口；Pol 进行缺口转移，使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，最终从头到尾都被标记。dNTP 对Pol酶活性的影响 在低浓度dNTPs的条件下，Pol具有良好的活性，提高dNTPs浓度时，Pol则能够更有效的合成DNA。低浓度的 32pdNTPs（2 mol/L）和高浓度的dNTPs（20 mol/L）一般希望有30%左右的32pdNTPs参入DNA链（Dnase数量）。2.Klenow片断与DNA末端标记 Klenow片断是由大肠杆菌DNA聚合酶经枯草杆菌蛋白酶的处理之后，产生出来的分子量为761000
48、dal的大片断分子。仍具有5 3的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性，失去了全酶的5 3 外切酶活性。2.1 Klenow2.1 Klenow片断的主要用途片断的主要用途（1 1）、修补经限制酶消化的）、修补经限制酶消化的DNADNA所形成的所形成的33隐隐蔽末端；蔽末端；（2 2）、标记）、标记DNADNA片断的末端；片断的末端；（3 3）、）、cDNAcDNA克隆的第二链克隆的第二链cDNAcDNA的合成；的合成；（4 4）、）、DNADNA序列的测定。序列的测定。2.2 DNA片断末端标记 具有 3隐蔽末端的带标记得的DNA片断 5 GATCT3 3 A5在反应物中加入Klenow聚合酶3
49、2pdGTP,一道温育后生成 5 GATCT3 3 32p GA5 或是同时加入32pdATP dGTP5 GATCT33 32p AGA5 DNADNA片断末端标记可以作为用凝胶电泳法片断末端标记可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。因为被标记的测定分子大小的标记样品。因为被标记的DNADNA片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与片断是同它们的摩尔浓度成比例，而与他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过他们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程产生的大小程产生的大小DNADNA片断都得到了同等程度的片断都得到了同等程度的标记。标记。不能够有效的标记带有不能够有效的标记带有55突出末端的突出末端
50、的DNADNA分子分子 3.T4DNA聚合酶和取代合成法标记DNA片断 1）从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出的一种特殊的DNA聚合酶。具有5 3的聚合酶活性和3 5 的外切酶活性。2）在没有脱氧核苷三磷酸存在的情况下，3外切酶活性便是T4 DNA聚合酶的独特功能。作用于双链DNA片断，并按3 5的方向从3OH末端开始降解DNA。如果反应物中存在一种dNTP时，它的水解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。3）在反应过程中，通过T4 DNA聚合作用，反应物中的32pdNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片断上原有的核苷酸，因此叫做取代合成。外切酶活性外切酶
