1、本章内容转基因的方法和原理转基因动物转基因植物转基因生物和生物安全性转基因的方法和原理o目的基因制备和载体系统o几种有效的转基因方法o定点突变和受体系统简介o转基因研究技术的中心环节即为DNA重组技术，其最终目的是将DNA片段转入为一个生物体，从而使该生物体具有表现某种性状。o转基因通过获取基因、重组基因和表达基因等过程来实现。o转基因打破了物种的界限，使不同种的生物的遗传物质在分子水平上重新组合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，实现对生物体的改造。基本步骤o1.分离获得目的基因；o2.在体外进行DNA重组，将外源DNA连接到能自我复制又带有选择标记的载体上；o3.将重组DNA转移入受体
2、细胞；o4.筛选出含有目的DNA的受体细胞克隆；o5.将此克隆。o目的基因来源：基因组DNA分离、化学合成、PCR扩增、cDNA文库及DNA文库中制得。o载体：质粒、噬菌体、柯氏质粒、YAC载体 等o工具酶：限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶 等 PCR反应oPCR技术就是在体外通过酶促反应或自发地扩增一段目的基因的技术。oPCR要求反应体系具有以下条件：o1、要有与被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物(约20个碱基左右)；o2、具有热稳定性的酶如Taq DNA聚合酶；o3、4种dNTP；o4、作为模板的目的DNA序列。oPCR反应可扩增出1005000bp的目的基因。PCR反应
3、过程 o1、变性，即将模板DNA置于95的高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA；o2、退火，将反应体系的温度降低至55左右，使得一对引物分别与变性后的两条模板链相配对；o3、延伸，将反应体系温度调整到Taq DNA聚合酶作用的最适温度72，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。o反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列。利用cDNA法 o由于真核生物的mRNA具有poly A这一结构特点，可以用结合长度大约为15bp的短链多聚DT的纤维素填充的柱子，根据碱基配对原则，将其吸附，从真核细胞的总RNA中提取出来，再用能打断A-T氢键的缓冲液洗脱。o在mRNA群体中，有高丰度的
4、mRNA，拷贝数多；也有低丰度的mRNA，但种类多，高丰度的mRNA容易合成cDNA。o要保证构建的cDNA文库中要含有目的克隆，可利用琼脂糖凝胶电泳、非变性蔗糖梯度离心和羟甲基蔗糖剃度离心等分级分离不同长度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分级分离。cDNA链的合成o得到纯化的mRNA后，再利用逆转录酶和DNA聚合酶I，缓冲液和4种脱氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作为引物，合成cDNA。o这些cDNA是由该种生物的各种mRNA分子逆转录得到的，因此是混合物，它们可以通过末端连接或是加入衔接物等其它方法克隆进入质粒载体，形成cDNA文库。o然后，采用DNA杂交或免疫分析的方法来筛
5、选目的基因质粒载体o质粒（plasmid）是能自我复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体外的方式存在，其大小不定，小的不到1kb，大的超过500kb。o每个质粒都有一段DNA复制起始位点的序列，它能帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。o高拷贝数的质粒，在宿主细胞中能达10100个拷贝；低拷贝数的质粒，在宿主细胞中只有14个拷贝。o质粒要成为克隆载体，就必须进行遗传改造，使之成为一个具有单一的限制性内切酶识别位点、多个选择性标记、并一般小于15kb且以高拷贝数存在的克隆载体。其最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右。质粒载体pBR322o1.大小为4361bp，含有抗氨苄青霉素和抗
6、四环素这样两个抗生素抗性基因o2.在四环素抗性基因内部，还具有BamH I、Hind 和Sal I 三个识别位点。o3.Pst I识别位点在氨苄青霉素抗性基因。o带有一个复制起点，可以保证质粒只在大肠杆菌里进行复制功能。pUC19质粒o长2686bp，带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个大肠杆菌乳糖操纵子半乳糖苷酶基因（lac Z）的调节片段，一个调节lac Z基因表达的阻碍蛋白的基因lac I，还有多个单克隆位点。opUC19的筛选将转化细胞涂布到含有氨苄青霉素、IPTG和Xgal的固体培养基上，那些带有自身环化质粒的细胞由于能够形成具活性的半乳糖苷酶，所以菌落是蓝色
7、，如果插入有目的DNA片段，无法形成杂合半乳糖苷酶，菌落时白色的。噬菌体o噬菌体染色体是长约49kb的双链DNA，该DNA的两个5末端都是由12个bp组成的单链互补粘性末端，当噬菌体DNA进入宿主细胞后，这两个粘性末端互相结合，在连接酶作用下封闭成环。o在噬菌体基因组中位于左边的基因（A-J）编码噬菌体头部和尾部的蛋白质，中间的基因（J-N）与重组和生长过程有关，但与裂解生长过程无关，因此对裂解生长过程来说，中间区的DNA是非必需的，可以被缺失或置换，因此可以在这个区域克隆外源DNA，右边的基因涉及基因的表达、调节、DNA合成晚期功能调节以及宿主细胞裂解等。噬菌体载体o分类：插入型载体和置换型
8、载体。o插入型载体：具有单一的酶切位点，可供外源DNA的插入。o置换型载体：有成对的酶切位点，在两个酶切位点之间的DNA片段，可被外源DNA片段置换。o噬菌体载体可以克隆较大DNA片段，最大长度约为24kb，只需将噬菌体DNA、尾巴和纯化的空的头，混在一起就可以在体外产生具有侵染性的噬菌体颗粒。柯氏质粒 Cosmido柯氏质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存，综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。o柯氏质粒上带有多个单克隆位（RE2），两个cos位点，DNA复制起始位点和抗生素抗性基因，在两个cos位点之间还有一个限制性内切酶位点（RE1）。o基因转移（transge
9、nosis）是借助于物理、化学或生物的手段将外源基因导入受体细胞，并检查其在该细胞内表达情况的一种技术，是细胞工程中一项重要而应用广泛的技术。o细胞直接摄取外源DNA的过程称为转化（transformation），如果通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程，称为转导(transduction)。1.细胞融合 1062.微细胞介导的基因转移 106 3.染色体介导的基因转移 106 4.脂质体介导的基因转移 2104 5.磷酸钙沉淀物介导的基因转移 103107 6.显微注射DNA 110 7.电脉冲介导的基因转移 1030 8.激光，超声波介导的基因转移 10509.重
10、组RNA病毒感染10100 10.重组DNA病毒感染 100DNA-磷酸钙沉淀法o磷酸钙沉淀反应是将外源DNA转移并整合到细胞株中去的最常用方法，主要用于将基因导入动物细胞。o由于核酸以磷酸钙DNA共沉淀物的形式存在，培养细胞对DNA的吸收会大大提高，细胞通过内吞作用，使DNA进入细胞质，并转移整合到细胞核内的染色体内。o一般是将DNA与CaCl2 溶液混合后，同时加入HEPES缓冲的盐溶液（HeBS）混合，静置后形成DNA磷酸钙沉淀物，然后用来转染受体细胞。这个过程中，pH值、Ca 2浓度等都会对转染的效率有所影响。方法简单，效率较高，可达培养细胞的20，但缺点是受体细胞有限。脂质体（lip
11、osome）介导的基因转移 o脂质体是一种内部包装DNA的球状磷脂双分层膜结构，能与细胞膜融合将DNA送入细胞的。o用脂质体介导DNA转染各种不同的类型的真核细胞的方法具有较高的转化效率和可重复性。o脂质体制备的基本方法是以一定比例称取磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，放于氯仿中之后加入待转移的DNA分子制成悬液，经超声化处理后，即形成包含DNA分子的脂质体，然后与培养细胞作用2小时左右，就可望实现DNA导入受体细胞。o脂质体介导的基因转染率受脂质体的组成及理化性质的影响。o脂质体可以实现体内和体外的瞬时稳定表达。显微注射DNAo显微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在显微镜下准确地插入受体细胞核中
12、，并将DNA注射进去的方法，在动物细胞转移中较常使用。现在，多利用显微镜操作器在相差显微镜下进行操作。每个细胞的注射量约为1011 ml，熟练的操作者每10分钟可注射200个细胞。显微操作仪显微操作仪的使用o显微操作仪使用杠杆操作而移动，它能靠杠杆操作把微吸管的先端在显微镜的视野中作平面移动。上下的运动靠设在显微操纵仪支柱上的上下微动，粗动调节装置进行。它与显微镜牢固地连接起来。右侧的显微操作仪是装在显微镜本体上，左侧的显微操作仪是装在显微镜的机械台上，随机械台的移动而移动，一般在进行操作时，先将平皿放置在显微注射仪上，移动载物台，把视野移到细胞处，先用缓慢移 动显微操纵仪上固定细胞的微吸管，
13、同时使注射器缓慢减压，吸引目标受精卵并固定之，再用另一侧显微操纵仪移动微注射针，对准细胞核刺入，导入目的基因，完成显微注射。显微注射法的优点o1）转化率高达20，特别是在没有合适的DNA载体系统时更有价值；o2）对各种受体细胞均适用，从体细胞、淋巴细胞到受精卵；3）对转移物质没有限制，可以是DNA、RNA、蛋白质、病毒、代谢物或代谢底物以至细胞器、染色体、细胞核；o4）可以控制转移的量和转移物的浓度；o5）可选择受体细胞的核的接受位点，可研究物质在细胞内的运转，区隔化和依赖区隔的修饰；o6）受体不用特殊的选择系统；o7）要求的样品量少，2ml样品足够作显微注射；o8）实验细胞与对照细胞可以化同
14、样的条件下比较。但也有缺点，如设备和技术的要求较高，一次处理细胞数量不能太多，对细胞有损伤。基因枪介导的DNA转移o 基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，从而实现基因转化的方法。1992年，世界首例转基因小鼠就是通过该法获得的。基因枪转化的原理基因枪转化的原理o第一因素是动力系统。o根据动力系统，基因枪分为三大类：一类是以火药爆炸力作为动力加速微弹；第二类是以电弧放电蒸发浪作为动力；第三类是以高压气体作为动力。o第二因素是微弹的制备过程。用的微载体有两类：一是钨粉，另一个是金粉，直径一般为4m。o常用的将D
15、NA包被到微载体上所用的沉淀试剂有亚精胺、氯化钙、乙醇、聚乙二醇、异丙醇等。o第三个因素是受体材料的选择。定点突变和受体系统o基因打靶（gene targeting）又称同源重组技术，也是转基因技术的一个组成部分。o利用转基因的方法，将外源基因序列导入靶细胞后，通过外源基因序列与靶细胞内染色体上同源基因序列间的重组，将外源基因定点整合到靶细胞基因组上的某一确定位点，而对某一预先确定的靶位点进行点突破的一项技术。基因敲除的载体 oO型载体，又称序列插入型载体，这类载体与靶基因组同源重组配对，经过一次交换，前者插入后者，它发生单交换而将载体序列插入靶基因内，致使染色体DNA部分重复，可能破坏内在正
16、常基因而发生突变，也可代替原来缺陷基因，纠正遗传特征，使靶基因特异失活。o型载体，也称序列取代载体，外来载体DNA和靶细胞染色体DNA同源配对，经过两次交换，前者取代后者，此类载体可与靶序列发生双交换，以外源序列取代靶序列，其基因组大小并无改变。靶细胞o基因敲除的靶细胞既可以是原核细胞，也可以是真核细胞；既可是植物细胞，也可是动物细胞。对于单细胞生物和体细胞具有全能性的植物来所，对靶细胞选择要求不高，对任一细胞打靶成功都可获得纯系个体。但对于动物，普通细胞敲除却无法得到纯系个体，小鼠生殖系嵌合体构建技术的发展却提供了理想的胚胎干细胞靶细胞。o胚胎干细胞体积大，胞浆少；体外培养时，细胞排列紧密，
17、呈集落形生长，在集落边缘有时可见有少量的已分化细胞，形态为扁平上皮细胞样或梭形成纤维细胞样。转入方法o构建的基因敲除载体，经线性化后通常采用电穿孔的方法将DNA引入胚胎干细胞。一般电压为220800V，电容从500F不等，转染后24小时开始用含200gG418（或/和其他物质）的培养基进行选择培养，经过812天未整合外源DNA的胚胎干细胞都已死亡，而整合了外源DNA的胚胎干细胞则长出了显微镜下可见到的克隆。o该方法的突出优点在于其可靠性和重复性。正负选择法 转基因动物o转基因小鼠的制备方法o转基因动物的应用价值转基因小鼠的制备方法o1974年，Jaenish和Mintz应用显微注射法，在世界上
18、首次成功地获得了AV40 DNA转基因小鼠。oPalmiter等人于1982年将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵的雄原核中，转基因动物技术轰动了整个生命科学界。反转录病毒法o利用反转录病毒可以转移小片段DNA（10kb）o缺陷：可能导致产生辅助病毒株DNA显微注射一种注入的外源基因序列利用胚胎干细胞筛选和鉴定o可以利用正负选择法或PCR检测外源DNA是否整合到染色体的正确位点。PCR检测转基因动物的应用价值o1）用于各种人类遗传疾病的模型 以转基因鼠居多，例如在老鼠中转入突变的人珠蛋白基因，会产生地中海型贫血症。o2）转基因动物模型还可以用于人类病毒病的研究。转基因动物模型可将病毒的基因通过转
19、基因技术转动实验鼠体内进行研究。人们利用转基因小鼠技术培育了引入HIV的tat蛋白的转基因鼠模型。3）转基因动物作为乳腺生物反应器：o将所需要的目的基因构建入载体，加上适当的调控序列，转入动物胚胎细胞，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需的药用蛋白。生产药用蛋白o1.抗凝血酶：转基因羊中得到，产量为7g/lo2.乳球蛋白：转基因小鼠，2mg/mlo3.红细胞生成素（EPO）:转基因小鼠乳汁o4.1抗胰蛋白酶（AAT）:转基因羊60mg/mlo5.因子:转基因羊的乳汁125ug/ml的重组蛋白o6.因子：转基因猪1o7.单克隆抗体:转基因小鼠中得到o8.C蛋白：转基因猪每小时分泌380ug/mlo9
20、.生长激素：转大鼠GH基因猪最高，血清中740ng/mlo4）膀胱生物反应器：收集产物蛋白比较容易，不会对生物造成伤害，宜用UP作为启动子，但由于含量低，成本和乳腺反应器差不多。o5）转基因动物血液表达系统：例如：Swanson等人制备了血液中含有人血红蛋白的转基因猪。o6)转基因改良移植器官：利用转基因技术改造异种来源器官的遗传性状，使之能适应人体器官或组织的移植。例如导入补体控制因子基因的转基因猪获得成功，为培育异体移植的供体猪开辟了道路。7）转基因生物获得更多经济利益o转基因牛：改变牛奶成分及提高产奶量o转基因羊：改良羊毛生长o转基因鱼：生长速度提高，以及导入抗冻蛋白基因、珠蛋白基因的鱼
21、o转基因鸡：改良现有品种的遗传特性，增强鸡对于感染的抵抗能力，降低对疾病的易感性，还可以将母鸡产生的外源蛋白收集到蛋内，以供医疗和保健之用。转基因植物o制作转基因植物的基本方法o转基因植物与高技术农业制作转基因植物的基本方法o土壤农杆菌的质粒DNA转入植物细胞后，会导致植物产生冠瘿瘤，这是由于Ti质粒上有一段TDNA，能转移并整合进入植物基因组中，导致冠瘿瘤形成。oTDNA的长度约在1224kb之间。oVir区的产物对于TDNA的转移是必须的农杆菌农杆菌与植物与植物细胞相细胞相互作用互作用的机制的机制Ti质粒衍生的克隆转化载体oTi质粒衍生的克隆转化载体必须具备以下的结构特点o1）具有选择标记
22、基因o2）DNA复制起始位点o3）TDNA右边缘序列o4）单克隆位点o5）vir区域，利用双元载体系统和共整合载体系统解决。实现vir区的方法双元载体共整合载体和农杆菌质粒重组过程土壤农杆菌转化法转基因植物与高技术农业o转基因技术在绿色革命中起了重要的作用！o抗除草剂基因转入农作物中，农作物游离抗除草剂的作用，而可以选择性除掉杂草！o有抗昆虫基因的农作物可以避免农药的使用o有抗病毒的农作物可以防止病毒的侵袭！o利用转基因可以改善农作物的营养价值！o转固氮基因农作物可以利用分子氮！转基因生物和生物安全性o1）基因重组打破了物种间的界限，打乱了自然进化历程，改变了生态系统的结构，这对于人类是福是祸
23、？o2）转基因生物具有新性状，其适合度和竞争力增加，是否会导致本来就弱的濒危生物更快地从地球上消失？o3）转基因生物的数目增加，是否会对生物多样性、群落结构形成威胁？o4）新性状的转基因生物如果大量回归自然界，有可能会影响到生态系统中能量的流动和物质循环，这又会有什么影响？o5）重组微生物降解的产物是否对人类有害，这是否会给人类带来负面效应？o6）转基因食品是否有损于人类健康？你是如何看待转基因生物？o总之，由于转基因技术的实现，大大促进了人类的生产力，推动社会进一步向前发展！o但与此同时，转基因也带来了一系列的社会问题，为了保证人类社会的可持续发展和人类的安全，人们开始立法限制转基因生物的产生!o到底转基因生物的产生，是打开了人类的百宝箱，还是打开了潘多拉之盒？参考书目o动物细胞工程 原理与实践 冯伯森等 科学出版社o哺乳动物胚胎学 秦鹏春等 科学出版社o转基因技术理论与应用 孙晗笑 等 河南医科大学出版社o重组 DNA的原理和方法 李德葆 等 浙江科学技术出版社o生命的卫生免疫系统朱锡华编 科学技术文献出版社o植物基因与分子操作 顾红雅等 北京大学出版社
