1、问题问题v细胞周期的不同时期细胞周期的不同时期v个体发育不同阶段个体发育不同阶段v不同的器官和组织不同的器官和组织v不同的外界环境下不同的外界环境下 各种基因的表达与否、量的差异、表达各种基因的表达与否、量的差异、表达部位如何部位如何SAGE实例实例5.3 基因芯片v何为生物芯片?生物芯片主要指通过平面微细加工技术在固体芯片表面构建的微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。它是继大规模集成电路之后的又一次具有深远意义 的科学技术革命。D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c
2、 h ip s基因芯片基因芯片基因芯片的主要应用基因芯片的主要应用基因表达检测 拟南芥、酵母基因表达研究等突变检测 BRCA基因外显子、CFTR基因、-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等基因组多态性分析 人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分系析，人线粒体16.6kb基因组多态性的研究等基因文库作图 通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 Expression ChipsGenomic ChipsSequencing ChipsDNA Chips基因芯片研制的总体蓝图基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定基因组序列分析与待检基因探针序列的确定检测样品 的
3、制备探针阵列的准备检测设备的研制杂交检测与数据分析表达芯片的制备检测流程表达芯片的制备检测流程v表达芯片实例PCR法从外周血淋巴细胞cDNA文库扩增产物扩增产物点样于包被的玻片上DNA 芯片热击T细胞cDNA未处理的细胞cDNA 杂交 杂交激光共聚焦扫描发现17个差异表达基因,11个被热诱导,6个被热抑制,发现其中3个为未发现的新基因6.6.蛋白质组蛋白质组 DNAmRNAPROTEIN(活性活性)转录水平调控(transcriptional control)翻译水平调控(Translational control)翻译后水平调控(Post-translational control)6.1蛋
4、白质组(Proteome)v Proteome来源于 Proteins和 genome 两个词的组合,意思是Proteins expressed by a genome,即基因组表达的蛋白质.v蛋白质组定义蛋白质组定义 广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质广义上是指某种细胞或组织中基因组表达的所有蛋白质;狭义上狭义上,可以指不同时期细胞内蛋白质的变化可以指不同时期细胞内蛋白质的变化.v蛋白质组学定义蛋白质组学定义 研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学研究蛋白质组结构和功能的领域称为蛋白质组学.v蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容:分析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量分
5、析全部蛋白质组所有成分以及它们的数量;确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、确定各种组分所在的空间位置、修饰方法、互作机制、生物活性和特定功能等生物活性和特定功能等 6.2 蛋白质组分析复杂性v蛋白质有许多加工方式,如磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化等；vmRNA 的可变剪接、程序性移码和可控突变，1个基因可编码许多不同的蛋白质，常常表现为组织特异性；v蛋白质之间存在大量的相互作用，如形成同源或异源二聚体、三聚体或多聚体，不同的结合状态有不同的活性；v1种蛋白质可参与多种反应，或多种蛋白质参与1种反应。6.36.3蛋白质组研究技术蛋白质组研究技术 蛋白质组主要研究技术：蛋白质组主要研究
6、技术：双向电泳双向电泳 生物质谱技术生物质谱技术 蛋白质芯片蛋白质芯片 酵母双杂交酵母双杂交6.3.1 6.3.1 双向凝胶电泳双向凝胶电泳 样品制备（包括蛋白质的溶解、变性及还原，从而去除非蛋白质杂质等）第一向等电聚焦（根据蛋白质电荷差异进行分离）第二向SDS-PAGE（以蛋白质分子量差异为基础）蛋白质的检测（用考马斯亮蓝、银染、铜染等方法）图谱数字化分析（图象扫描、确定每个蛋白质点的等电点和分子量，寻找差异蛋白）6.3.2 蛋白质组分析技术 主要蛋白质组分析技术：质谱方法 蛋白质序列分析 氨基酸组成分析v质谱技术的基本原理：样品分子离子化后，根据不同离子间质核比（m/z）的差异来分离并确定
7、分子量。v质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、离子检测器和数据分析系统组成。v质谱技术在蛋白组研究中的应用：质谱技术在蛋白组研究中的应用：A 肽质谱和肽序列分析 蛋白质经双向电泳后，分离到的蛋白质被切割下来，进行胶内酶解，或转移到PVDF膜上，进行膜上膜解，然后上样进行测序。但目前质谱法还不能够取代Edman降解法测序，可是其测定速度较快。B 鉴定翻译后修饰的蛋白质鉴定翻译后修饰的蛋白质 质谱可通过特征离子监测的方法很快确定磷酸化肽，通过串联质谱确定磷酸化位点；质谱可与蛋白酶解和糖苷酶酶解结合，寻找糖肽，鉴定糖基化位点；质谱还参与糖链组成、结构甚至分支情况等的分析。C 质谱技术的其他作
8、用 质谱可对蛋白质二硫键进行定量和定位，分析蛋白质与蛋白质的相互作用，蛋白质与其他分子的相互作用，以及蛋白质的二级结构等。6.4蛋白质组数据库的建立和生物信息学 数据库的建立是蛋白质组研究的最重要的一个方面。蛋白质的数据库包括：蛋白质序列数据库 质谱数据库 双向电泳图谱数据库 有关蛋白质结构的数据库 6.5 与疾病相关蛋白质研究的基本策略6.6 蛋白质组研究的目的v建立蛋白质互作网络v为人们了解生物体的各个生长、发育期的各个蛋白质有机组成、协作，更完整的解释各种生命现象奠定基础v促进人类疾病的治疗本章要点v已知一个DNA片段，如何预测其开放读码框?vRACE技术的基本原理是什么?v动物园杂交的
9、原理v基因剔除法vRNAi的作用原理及应用v酵母双列杂交的原理vSAGE 的基本原理及技术路线v什么是蛋白质组、蛋白质组学，以及蛋白质组的研究目的和意义？第三章第三章 物理作图物理作图(physical mapping)物理作图物理作图:应用分子生物学技术直接将应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置隆标定在基因组的实际位置物理图的距离物理图的距离:依作图方法而异依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为辐射杂种作图的计算单位为厘镭厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对碱基对(bp)物理作图的
10、方法物理作图的方法 o 限制酶作图限制酶作图(Restriction Mapping)(Restriction Mapping)o 依靠克隆的基因组作图依靠克隆的基因组作图(clone-based mapping)(clone-based mapping)o 荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ (Fish,Fluorescent in situ hybridization)hybridization)o 序标位作图序标位作图 (STS(STS，Sequence taged site)Sequence taged site)1.1 限制酶作图限制酶作图(R
11、estriction Mapping)基本原理基本原理1Kb EcoR I待检的待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBH H EH H H H E+BEB6KbEH 4KbEB 5KbBH 跨叠克隆群跨叠克隆群(Contig)酶切位点酶切位点2.1 大片段大片段DNA的克隆载体的克隆载体v YAC:YAC:酵母人工染色体酵母人工染色体 230-1700Kb230-1700Kbv BAC:BAC:细菌人工染色体细菌人工染色体 300Kb300Kbv PAC:P1 PAC:P1人工染色体人工染色体 300Kb 300Kb v Fosmids:30Kb Fosmids:30K
12、b2.基于克隆的基因组作图3.荧光原位杂交荧光原位杂交(Fish,Fluorescent in situ hybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。标定在连锁图上。用用DNA纤维分析水稻第纤维分析水稻第4号染色体号染色体 4.序标位作图序标位作图(STS,Sequence Taged Site)长度长度:100-500 bp序列已知序列已知,可以设计可以设计PCR反应反应单拷贝单拷贝,在染色体上的位置是唯一的在染色体上的位置是
13、唯一的EST(Expressed sequence tag)大部分可以作大部分可以作STSEST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为。EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的端和端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式。不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR 检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度构建全基因组DNA 基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA 流式细胞仪分离染色体打断 打断用用STS构建构建Contig56 结束语结束语
