1、实验实验四四 氨基酸纸层析氨基酸纸层析 一、实验目的一、实验目的 本实验采用纸色谱对几种氨基酸进行分本实验采用纸色谱对几种氨基酸进行分 离和鉴定离和鉴定,以了解纸色谱的原理，练习其操以了解纸色谱的原理，练习其操 作方法。作方法。 二、实验原理二、实验原理 色谱分析法（简称色谱法或层析法）色谱分析法（简称色谱法或层析法） 色谱分析法简称色谱分析法简称色谱法色谱法或或层析法层析法。1906年，年， 俄国植物学家俄国植物学家Tsweet将将CaCO3放在竖立的放在竖立的 玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸玻璃柱中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸 取液，并用石油醚冲洗。在柱的不同部位形取液，并用石油
2、醚冲洗。在柱的不同部位形 成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为 固定相固定相，冲洗剂称为，冲洗剂称为流动相流动相。 色谱法色谱法就是利用混合物中各组分在固定相和就是利用混合物中各组分在固定相和 移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到移动相中进行反复的吸附或分配作用，达到 各组分分开的目的。各组分分开的目的。 分类分类: (1)按照被分离物质在固定相中的作用原理按照被分离物质在固定相中的作用原理 不同，色谱法可分为不同，色谱法可分为吸附色谱、分配色谱、吸附色谱、分配色谱、 离子交换色谱离子交换色谱等。等。 (2)按照操作方式不同，又可分为按照操作方式不同，
3、又可分为柱色谱、柱色谱、 薄层色谱、纸色谱、气相色谱、薄层色谱、纸色谱、气相色谱、和和高效液高效液 相色谱相色谱等。等。 R f 原点到层析点中心的距离 原点到溶剂前沿的距离 纸色谱纸色谱为分配色谱，色谱过程在固定相构为分配色谱，色谱过程在固定相构 成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定成的平面状层下进行。滤纸为载体，固定 相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用相为滤纸上的水，流动相（展开剂）为用 水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于水饱和过的有机溶剂。纸色谱属于分配色分配色 谱谱。根据相似相溶的原则，在展开过程中，。根据相似相溶的原则，在展开过程中， 样品在水和有机溶剂中不断分配，从而达样品在水和有机
4、溶剂中不断分配，从而达 到分离的结果。到分离的结果。 衡量物质向上移动的物理量是比移值（衡量物质向上移动的物理量是比移值（Rf） 例例:大黄中游离蒽醌的纸色谱图大黄中游离蒽醌的纸色谱图 溶剂前沿溶剂前沿 大黄素甲醚大黄素甲醚 芦荟大黄素芦荟大黄素 大黄素大黄素 大黄酸大黄酸 点样点点样点 三、实验步骤三、实验步骤 纸层析纸层析 1在滤纸条上端边缘约在滤纸条上端边缘约1厘米的中央剪一小厘米的中央剪一小 孔。孔。 2将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸将滤纸条平放于洁净的纸上，在距离滤纸 下端下端1cm处用铅笔轻画一横线，并在横线的处用铅笔轻画一横线，并在横线的 中央画一直径为中央画一直径为2mm
5、的小圆圈。的小圆圈。 3用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下用毛细管吸取氨基酸混合液，在滤纸条下 端的小圆圈内点样。端的小圆圈内点样。 4. 取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液取干燥大试管，加入被水饱和的酚溶液 10ml，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管，注意勿使溶液沾到试管壁上，将试管 垂直固定于铁架台上。垂直固定于铁架台上。 5. 在距滤纸条下端在距滤纸条下端0.5cm处穿大头针。从滤纸处穿大头针。从滤纸 条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的条上端小孔处穿棉线并左右分开，调节线的 高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液高度使滤纸垂直悬于试管内且下湍浸入溶液 0.5cm，注意勿使点样点浸入
6、溶液中，亦勿使，注意勿使点样点浸入溶液中，亦勿使 滤纸条接触试管壁。滤纸条接触试管壁。 6. 此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一此时即可看到溶剂向上移动，溶剂升到一 定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶定高度时，小心将纸条取出，以铅笔标出溶 剂上升的前沿。剂上升的前沿。 7. 将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹将滤纸条两端，用大头针钉在小木框上，吹 干后用喷雾器均匀地喷一层干后用喷雾器均匀地喷一层0.2%茚三酮乙醇溶茚三酮乙醇溶 液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出液，然后再将滤纸条吹干，即可看到纸上显出 三色点，每个色点代表一种氨基酸。三色点，每个色点代表一种氨基酸。 8. 分别
7、测量并计算三种氨基酸的分别测量并计算三种氨基酸的Rf，再根据教，再根据教 师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。师供给的值确定此三个色点各为何种氨基酸。 9. 留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。留在试管内的酚溶剂切勿弃去，塞紧塞子。 氨基酸氨基酸 Rf值值 蛋氨酸蛋氨酸 0.84 谷氨酸谷氨酸 0.32 丙氨酸丙氨酸 0.62 1 层析缸要预先饱和，展开剂勿附着于大试层析缸要预先饱和，展开剂勿附着于大试 管内壁。管内壁。 2点样量要适当，太少效果不明显，太多分点样量要适当，太少效果不明显，太多分 离不好。离不好。 要求点的样直径不超过要求点的样直径不超过.。 无论在准备工作中还是以后的实验过程中，无论在准备工作中还是以后的实验过程中， 都不要用手触摸纸条中部，因为手上不干净物都不要用手触摸纸条中部，因为手上不干净物 或皮屑落在纸上会产生多余斑点而干扰实验结或皮屑落在纸上会产生多余斑点而干扰实验结 果果 4样品点不能浸入展开剂中。样品点不能浸入展开剂中。 注意：注意：
