1、3-农业基因工程第一节第一节 基因工程的物质基础基因工程的物质基础一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生二、基因工程的含义二、基因工程的含义三、基因工程工具酶三、基因工程工具酶 四、基因工程载体四、基因工程载体 一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生理论基础：理论基础：三大发现三大发现20C40S，基因载体是，基因载体是DNA 遗传物质基础问题；遗传物质基础问题；20C50S，DNA双螺旋结构和半保留复制双螺旋结构和半保留复制 基因的自我复制和传递问题；基因的自我复制和传递问题；20C50-60S，中心法则和操纵子学说，中心法则和操纵子学说 遗传信息的流向和表达问题。遗传信息的流向和表达问题。技术
2、基础：三大发明技术基础：三大发明工具酶工具酶载体载体反转录酶反转录酶二、基因工程的含义二、基因工程的含义基因工程（基因工程（gene engineering）指将某种生物的基因经过体外修饰指将某种生物的基因经过体外修饰或直接导入另一种生物细胞或个体，从或直接导入另一种生物细胞或个体，从而改变生物的遗传性状或创造新的生物而改变生物的遗传性状或创造新的生物类型。类型。这种人为在遗传物质的分子水平上这种人为在遗传物质的分子水平上改造和设计生物的结构和功能的生物技改造和设计生物的结构和功能的生物技术，就是所谓的术，就是所谓的基因工程基因工程，也称，也称DNA重重组技术组技术。基因工程的优势基因工程的优
3、势生物技术的核心技术生物技术的核心技术基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。基因交换不受生物物种亲缘关系的限制。生物基因可在人、动物、植物和微生物基因可在人、动物、植物和微生物四大系统间进行交换，人类可以构生物四大系统间进行交换，人类可以构思并创造出世界上前所未有的生物新类思并创造出世界上前所未有的生物新类型。型。三、基因工程工具酶三、基因工程工具酶基因工程操作需要在分子水平上对基因工程操作需要在分子水平上对DNA分子进行剪接、重组和转运，需要借助分子进行剪接、重组和转运，需要借助一些工具。一些工具。1、限制性内切酶、限制性内切酶 2、DNA连接酶连接酶 3、DNA聚合酶聚合酶 4、反转录酶、反
4、转录酶 1、限制性内切酶、限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶就是一类能够识别双链就是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割割DNA双链结构的酶。双链结构的酶。1970，Smith和和Wilcox，Hind 1972，Boyer，EcoR300种微生物种微生物500种限制性内切酶种限制性内切酶基因体外分析研究基因体外分析研究人工重组。人工重组。2、DNA连接酶连接酶作用：能把不同作用：能把不同DNA片段结合到一起。片段结合到一起。1967，首次发现，但活性不高，首次发现，但活性不高1970，Khorana，T4 DNA连接酶，高活性连接酶，
5、高活性 3、DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶能以单链能以单链DNA为模板合成互为模板合成互补的补的DNA链。链。TaqDNA聚合酶：耐高温，聚合酶：耐高温，70以上合成以上合成DNA。这为体外人工大量复制目标这为体外人工大量复制目标DNA片段提供片段提供了极大的方便。了极大的方便。4、反转录酶、反转录酶反转录酶反转录酶也是一种也是一种DNA聚合酶，但它不是聚合酶，但它不是以以DNA为模板，而是以为模板，而是以mRNA为模板进为模板进行行DNA的合成。的合成。由于这一过程正好与由于这一过程正好与mRNA的转录过程相的转录过程相反，故而称为反转录酶。反，故而称为反转录酶。反转录酶使得基因工程学
6、家们能通过细胞反转录酶使得基因工程学家们能通过细胞质中的质中的mRNA来认识和分离目标基因。来认识和分离目标基因。1970，Baltimore和和Temin，各自发现。，各自发现。四、基因工程载体四、基因工程载体载体：载体：将外源将外源DNA携带进入宿主细胞的运携带进入宿主细胞的运载工具。载工具。基因载体的基因载体的实质实质：一类小型的一类小型的DNA分子分子。其作用：其作用：将目的基因转移到受体细胞，并将目的基因转移到受体细胞，并使其在受体细胞中得到转录和表达。使其在受体细胞中得到转录和表达。1946，Lederberg，细菌，细菌F因子因子1973，Cohen，首次将质粒作为基因载体。，首
7、次将质粒作为基因载体。理想载体的特点理想载体的特点自我复制能力；自我复制能力；大小要适度，能从外部进入细胞；大小要适度，能从外部进入细胞；稳定安全可靠，不易降解；稳定安全可靠，不易降解；要有遗传标记和选择性的识别标记。要有遗传标记和选择性的识别标记。载体的分类载体的分类（1）根据克隆外源）根据克隆外源DNA的方式：的方式：插入型载体插入型载体：指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶：指在载体的克隆位点上用限制性内切酶酶切后，将外源切后，将外源DNA插入，再用连接酶连接。绝大多数插入，再用连接酶连接。绝大多数的载体都属于此类。的载体都属于此类。置换型载体置换型载体：指载体的某一片段用限制性内切酶切
8、除，：指载体的某一片段用限制性内切酶切除，代之以外源代之以外源DNA片段。噬菌体属于此类。片段。噬菌体属于此类。（2）根据载体的用途：）根据载体的用途：克隆载体克隆载体：指克隆了外源：指克隆了外源DNA后，转入宿主细胞中进行后，转入宿主细胞中进行增殖，使克隆的增殖，使克隆的DNA片段在数量上大大扩增。片段在数量上大大扩增。表达载体表达载体：将外源：将外源DNA在宿主细胞中表达产生蛋白质。在宿主细胞中表达产生蛋白质。常用基因载体常用基因载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒转座子转座子人工载体人工载体质粒质粒质粒是独立与染色体之外的能自主复制的质粒是独立与染色体之外的能自主复制的双链环状双链环状DNA
9、分子，也叫分子，也叫“核外遗传体核外遗传体或核外染色体或核外染色体”。质粒所携带外源质粒所携带外源DNA片段比较片段比较小小（10Kb）。Ti质粒：高等植物基因工程常用。质粒：高等植物基因工程常用。噬菌体噬菌体噬菌体所能负载的噬菌体所能负载的DNA片段较大。片段较大。噬菌体：双链线性噬菌体：双链线性DNA。原核生物常用。原核生物常用。病毒病毒SV40（猿猴病毒），双链环状（猿猴病毒），双链环状DNA广泛应用：广泛应用：微生物微生物和和哺乳动物体细胞哺乳动物体细胞基因工程。基因工程。转座子转座子能在基因组中频繁转移，主要成分也都是能在基因组中频繁转移，主要成分也都是不同的不同的DNA。人工载体人
10、工载体YAC（酵母人工染色体）（酵母人工染色体）Yeast artificial chromosomeBAC（细菌人工染色体）（细菌人工染色体）Bacterial artificial chromosomeMAC（哺乳动物人工染色体）（哺乳动物人工染色体）Mammalian artificial chromosome第二节第二节 基因工程操作程序基因工程操作程序一般包括一般包括5个步骤：个步骤：一、目的基因的获得；一、目的基因的获得；二、目的基因与基因载体的体外重组；二、目的基因与基因载体的体外重组；三、重组三、重组DNA分子的转化；分子的转化；四、转化细胞的筛选；四、转化细胞的筛选；五、目的
11、基因表达的检测。五、目的基因表达的检测。基因转化操作过程 一、目的基因的获得一、目的基因的获得目的基因目的基因：在基因工程操作中所需要的某：在基因工程操作中所需要的某些些DNA分子的片段。分子的片段。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。它含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。目的基因获得方法：目的基因获得方法：人工合成法、人工合成法、cDNA法、法、PCR法、法、基因文库筛选法等。基因文库筛选法等。1、人工合成法、人工合成法核苷酸核苷酸 酶酶 目的基因目的基因注：该法合成目的基因较小。注：该法合成目的基因较小。2、cDNA法法特定基因特定基因 分离分离mRNA反转录酶反转录酶 G、C、T、
12、A单链单链cDNA目的基因目的基因 3、PCR法法前提前提：已知序列：已知序列方法方法：多聚酶链式反应（：多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）程序程序：通过：通过DNA模板高温变性、模板与引模板高温变性、模板与引物的低温退火及引物的中温延伸物的低温退火及引物的中温延伸3个阶个阶段的多次循环，就可以扩增得到目的段的多次循环，就可以扩增得到目的DNA序列。序列。4、基因文库筛选法、基因文库筛选法基因文库就是保存某个物种完整基因组遗基因文库就是保存某个物种完整基因组遗传信息的不同传信息的不同DNA片段的总称。片段的总称。前提：前提：核酸序列未知核酸序列未知程序
13、：程序：蛋白质纯化蛋白质纯化测定部分氨基酸的测定部分氨基酸的顺序顺序合成合成DNA探针探针从基因文库从基因文库中筛选中筛选目的基因。目的基因。原理：原理：中心法则中心法则 二、体外重组二、体外重组载体载体+目的基因目的基因 重组重组DNA（基因工程最重要的环节基因工程最重要的环节）1、选择适合的基因载体、选择适合的基因载体2、载体酶切（限制内切酶）、载体酶切（限制内切酶）3、目的基因与载体、目的基因与载体DNA 连接（连接（DNA连接连接酶）酶）4、重组、重组DNA分子获得分子获得三、重组三、重组DNA分子的转化分子的转化将重组的将重组的DNA杂合分子，向选定的生物受杂合分子，向选定的生物受体
14、细胞（或叫宿主细胞、寄主细胞）中体细胞（或叫宿主细胞、寄主细胞）中转移，让重组的转移，让重组的DNA杂合子在受体细胞杂合子在受体细胞中自主复制、转录、翻译得以表达。中自主复制、转录、翻译得以表达。常用常用大肠杆菌大肠杆菌作为宿主细胞。作为宿主细胞。常用转化方法（1）Ti质粒介导法质粒介导法（2）电击法）电击法（3）微注射法）微注射法（4）基因枪法）基因枪法（1）Ti质粒介导法 基因载体：基因载体：农杆菌农杆菌Ti质粒质粒。优点：优点：转化再生率高转化再生率高最常用的方法。最常用的方法。（2）电击法 瞬间电脉冲瞬间电脉冲刺激细胞膜刺激细胞膜小孔小孔 重重组组DNA分子进入细胞的分子进入细胞的通道
15、通道。电脉冲强度电脉冲强度孔径孔径大小大小和和数量数量 DNA进入细胞的进入细胞的速度速度和和难易难易。（3）微注射法 毛细管针毛细管针显微操作显微操作注射外源基因注射外源基因细胞。细胞。优点：准确性高优点：准确性高缺点：技术性高，处理效率低缺点：技术性高，处理效率低（4）基因枪法 特制特制“基因枪基因枪”外源基因外源基因+金属微粒金属微粒=“微型弹微型弹”射入受体细胞。射入受体细胞。优点：批量处理，效率高；优点：批量处理，效率高；缺点：装置昂贵。缺点：装置昂贵。提高转化率的方法（1）多聚氨基酸法）多聚氨基酸法（2）磷酸钙）磷酸钙DNA共沉淀法共沉淀法（3）脂质体法）脂质体法（1）多聚氨基酸法
16、 多聚氨基酸多聚氨基酸+重组重组DNA分子分子DNA多聚氨基酸复合分子多聚氨基酸复合分子 常用：多聚常用：多聚-L-鸟氨酸鸟氨酸 多聚多聚-L-赖氨酸赖氨酸该结构：该结构：保护外源基因免受核酸酶的降保护外源基因免受核酸酶的降解。解。刺激宿主细胞提高其摄入能力。刺激宿主细胞提高其摄入能力。（2）磷酸钙DNA共沉淀法 D重组重组NA分子分子+磷酸钙磷酸钙磷酸钙磷酸钙-DNA复合体复合体（沉淀状）（沉淀状）作用：同上法。作用：同上法。（3）脂质体法 重组重组DNA悬浮液悬浮液+10%矿物油或橄榄油矿物油或橄榄油 剧烈振荡剧烈振荡 包膜包膜脂质体脂质体（内裹（内裹DNA分子）分子）稳定性好，对核酸酶具
17、有较好的抗性。稳定性好，对核酸酶具有较好的抗性。四、转化细胞的筛选四、转化细胞的筛选转化处理受体细胞转化处理受体细胞培养基（抗菌素）培养基（抗菌素）转化细胞（抗性基因）转化细胞（抗性基因）未转化细胞未转化细胞 培养培养重组重组DNA五、目的基因表达的检测五、目的基因表达的检测合成合成外源基因外源基因 蛋白质蛋白质检测检测六、基因工程操作实例六、基因工程操作实例抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻抗除草剂和多价抗虫基因导入水稻光温敏核不育系的研究光温敏核不育系的研究1.Epsps基因为筛选标记的多价抗基因为筛选标记的多价抗虫虫表达载体表达载体构建构建1.1 多基因表达载体构建的流程和图谱多基因表达载体
18、构建的流程和图谱pC1300pCTSM1300pCT-pinII-1pCT-Bt-2pCTSKC3 1.2.载体构建的部分电泳鉴定图谱载体构建的部分电泳鉴定图谱图图1-3 pCT-Bt-2正向连接酶切鉴定正向连接酶切鉴定Lane1:15kb DNA markerLane2:pCT-Bt-2/HindLane3:pCT-Bt-2/KpnI+XhoILane4:pCT-Bt-2/KpnI图图1-4 pCT-Bt-2反向连接酶切鉴定反向连接酶切鉴定Lane1:pCT-Bt-2/Hind Lane2:pCT-Bt-2/KpnIXhoILane3:pCT-Bt-2/PstILane1:15kb DNA
19、marker图图1-1 pCTSM1300酶切鉴定酶切鉴定Lane1:15kb DNA markerLane2:pCTSM1300/EcoRI+XhoI2320 bp图图1-5 载体载体pCTSKC3的酶切鉴定的酶切鉴定Lane1:15kb DNA marker;Lane2:pTSM/EcoRI+XhoI;Lane3:pCTSM1300/EcoRI+XhoI;Lane4:pKC-3/KpnI+Hind;Lane5:pCT-pin-1/KpnI+Hind;Lane6:pCT-pin-1/Hind;Lane7:pCT-Bt-2/Hind;Lane8:pCT-Bt-2/KpnI;Lane9:pRSs
20、1GNA/KpnI;Lane10:pCTSKC3/KpnI3000 bp4500 bp8200 bp图图1-2 pCT-PinII-1酶切验证酶切验证 Lane1:DNA marker(DL15000)Lane2:pCT-PinII-1/KpnI+HindIII3000 bp图图1-6 GNA基因的基因的PCR鉴定鉴定Lane1,2:pCTSKC3（460bp）Lane3:pKC-3（460bp）220bp1.3 Kb图图1-7 TSP和和aroAM12基因的基因的PCR鉴鉴定定Lane1:15kb DNA markerLane2,3:TSP sequence(200bp)Lane4,5:Ep
21、sps gene(1.3kb)图图1-8 Bt 和和 PinII 基因的基因的PCR鉴定鉴定Lane1:pCTSKC3/Bt gene（300bp）Lane2:pCTSKC3/PinII gene（566bp）Lane3:pKC-3/PinII gene（566bp）转转抗草甘膦基因和多个抗虫抗草甘膦基因和多个抗虫基因基因水稻植株的获得水稻植株的获得 2.1 2.1 水稻胚性水稻胚性愈伤组织的愈伤组织的 诱导诱导2.2 2.2 水稻胚性水稻胚性愈伤组织的愈伤组织的 转化转化愈伤组织诱导生长过程图 接种接种7d的愈伤组织的愈伤组织 刚接种的愈伤组织刚接种的愈伤组织继代继代3次的愈伤组织次的愈伤组
22、织 接种接种14d的愈伤组织的愈伤组织 继代继代1次的愈伤组织次的愈伤组织继代继代3次以上的愈伤组织次以上的愈伤组织2.2 愈伤组织的转化基因枪法和农杆菌法2.2.1 材料材料生长生长旺盛，结构致密，颜色淡黄旺盛，结构致密，颜色淡黄的的胚性愈伤组织胚性愈伤组织多基因表达载体多基因表达载体pCTSKC3，pCAMBIA1300农杆菌株农杆菌株EHA1052.2.2 基因枪转化法基因枪转化法转化前，将愈伤组织按转化前，将愈伤组织按每皿每皿25-30块块，放置在平皿放置在平皿 中心中心 2.5cm范围内，然范围内，然后置于高渗培养基上后置于高渗培养基上暗培养暗培养 4h。质粒质粒DNA用量约用量约
23、25ug/6枪枪，可裂膜的压力为，可裂膜的压力为 7.58MPa，靶材料至可裂膜距离为，靶材料至可裂膜距离为 6cm,真空真空度度0.08 Mpa，每皿材料每皿材料 轰击轰击2次次。2.2.3 农杆菌转化法农杆菌转化法质粒质粒DNA转化农杆菌转化农杆菌EHA105。菌液菌液OD6000.6，稀释度为，稀释度为 2倍倍,侵染时间为侵染时间为 30 Min,共培养时间为共培养时间为3d。2.3 结果与分析1通过通过基因枪转化法基因枪转化法轰击轰击1160块块左右的左右的愈伤组织则初步得愈伤组织则初步得到到167株再生植株，株再生植株，转化率为转化率为17.4%。2通过通过农杆菌介导农杆菌介导转化法
24、侵染转化法侵染270块块左右的愈伤组织，左右的愈伤组织，最终只获得最终只获得6株株再再生植株，转化率生植株，转化率为为2.2%。2.2.用于农杆菌转化用于农杆菌转化的愈伤组织块是继的愈伤组织块是继代多次的愈伤组织，代多次的愈伤组织，其生长和分化能力其生长和分化能力大大下降了。大大下降了。1.1.愈伤抑菌过程失愈伤抑菌过程失败从而导致多数愈败从而导致多数愈伤不能分化成苗。伤不能分化成苗。原因原因转基因水稻植株的转基因水稻植株的分子分子生物学生物学鉴定鉴定 3.1 材料和方法3.1.1 材料转基因植株基因组DNA；负对照的基因组DNA；正对照的基因组DNA。3.1.2 方法(1)PCRPCR反应条
25、件：94 5 Min，94 45 s，59 1 Min，72 1.5 Min，30个循环后，72延伸10 Min。(2)Southern blot操作流程:基因组DNA酶切 琼脂糖凝胶电泳 转膜 探针制备 杂交 洗膜 显影3.2.1 部分转基因植株的部分转基因植株的PCR 检测检测M：100bp marker;P：阳性对照（：阳性对照（pCTSKC3）;CK：阴性对照；：阴性对照；111：转基因植株：转基因植株1.3kb1.Epsps基因PCR检测（1.3kb）2.Bt基因PCR检测（300bp）4.PinII 基因PCR检测(566bp)566bp300bp3.GNA基因PCR检测（460b
26、p）460bp3.2 结果与分析Bt基因的基因的PCR-southern杂交检测杂交检测M：DNA分子量标记；泳道分子量标记；泳道1：质粒：质粒DNA；泳道；泳道2：阴性对照：阴性对照CK；泳道；泳道3：空白对照；泳道：空白对照；泳道47：转基因水稻植株：转基因水稻植株Bt基因的基因的Southern blot分析分析泳道泳道1：DNA分子量标记；泳道分子量标记；泳道2：阳性对照：阳性对照pCTSKC3；泳道泳道3：非转基因阴性对照；泳道：非转基因阴性对照；泳道48：转基因水稻植株：转基因水稻植株 基因组基因组DNA的酶切的酶切M1,M2：DNA 分子量标记；分子量标记；泳道泳道1：质粒：质粒
27、pCTSKC3/Hind+XhoI；泳道泳道2：非转基因阴性对照：非转基因阴性对照/Hind；泳道泳道37：转基因水稻植株：转基因水稻植株/Hind.3.2.2 部分基因的部分基因的Southern blot 检测检测转基因水稻植株的转基因水稻植株的草甘膦草甘膦抗抗性鉴定的结果与分析性鉴定的结果与分析 4.1 4.1 盆栽植株盆栽植株离体叶片离体叶片草甘草甘膦抗性试验膦抗性试验4.3 4.3 盆栽植株盆栽植株整株喷洒整株喷洒草甘草甘膦抗性试验膦抗性试验4.2 4.2 盆栽植株盆栽植株叶片涂抹叶片涂抹草甘草甘膦抗性试验膦抗性试验图图4-1 含含1.0 mg/L 6-BA的草甘膦的草甘膦处理实验处
28、理实验 图图4-2 不含不含1.0 mg/L 6-BA的草甘膦的草甘膦处理实验处理实验 CK 0 10 20 40 6080 100 120 1404.1 植株离体叶片草甘膦抗性试验 4.1.1 草甘膦适宜浓度的选择草甘膦适宜浓度的选择材料选取材料选取：剪取：剪取 1cm长的新鲜长的新鲜绿色叶片片段，放入含一定检绿色叶片片段，放入含一定检测溶液的平皿中，测溶液的平皿中，12h光照光照/12h黑暗，黑暗，26条件下培养。条件下培养。对照设置对照设置：为使叶片在离体环：为使叶片在离体环境下保持新鲜的绿色，参考境下保持新鲜的绿色，参考刘刘巧泉等巧泉等的方法，在检测液中附的方法，在检测液中附加加 1.
29、0 mg/L 6-BA，并设置，并设置对照组。对照组。草甘膦浓度草甘膦浓度(mg/L)设置：设置：0，10，20，40，60，80，100，120，140草甘膦适宜浓度草甘膦适宜浓度(mg/L)的确定：的确定：0，5，10，20，70，140AB0 5 10 20 70 140图图4-3 转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测结果（转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测结果（7d后）后）A:转基因植株叶片；转基因植株叶片；B：非转基因植株对照叶片：非转基因植株对照叶片140 mg/L草甘膦处理植株 72株，其中 41株叶片受伤非常轻，23株黄斑面积低于1/3；8株黄斑面积占1/2以上。结果说明转基因植株不
30、同程度的表达了草甘膦抗性功能。4.1.2 转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测转基因植株离体叶片草甘膦抗性检测4.2 植株叶片涂抹草甘膦抗性试验取转基因植株叶端部分3 cm左右的部位，用记号笔标记出来，然后涂抹浓度为1218 g/L的草甘膦溶液。转基因植株叶片草甘膦涂抹抗性检测（转基因植株叶片草甘膦涂抹抗性检测（7d后）后）CK：非转基因对照；：非转基因对照；15：转基因植株：转基因植株4.3 植株整株喷洒草甘膦抗性试验用1.8 g/L的Roundup按照17L/100m2喷洒水稻植株30株，每7d喷洒 1次，共喷洒3次。3次后，有 9株转基因植株还正常生长，7株死亡，12株叶片变黄，生长发育缓慢
31、，恢复培养2周后，又有 7株恢复正常生长。转基因植株喷洒草甘膦转基因植株喷洒草甘膦2828天内叶片变化分析天内叶片变化分析转基因植株整株喷洒草甘膦抗性检测转基因植株整株喷洒草甘膦抗性检测（2828天后）天后）第三节第三节 转基因植物与植物改良转基因植物与植物改良现代农业生物技术：现代农业生物技术：最有现实意义的技术之一。最有现实意义的技术之一。改革传统植物育种，改革传统植物育种，独创植物新物种、新品种。独创植物新物种、新品种。新的新的“绿色革命绿色革命”。1983，转基因烟草，首次报道。，转基因烟草，首次报道。目前，目前，35科，科，120多个植物种。多个植物种。主要包括农作物、蔬菜、园艺植物
32、、药用主要包括农作物、蔬菜、园艺植物、药用植物、果树和树木等。植物、果树和树木等。主要目标：主要目标：抗病虫害和除草剂，改良农作抗病虫害和除草剂，改良农作物和经济作物的重要经济性状，改善品物和经济作物的重要经济性状，改善品质，创造全新植物种等。质，创造全新植物种等。迄今为止，迄今为止，40多个种，多个种，3000多个转化植物多个转化植物品种的田间试验，在品种的田间试验，在30个国家中进行或个国家中进行或已经完成。已经完成。转基因植物发展 年代年代项目项目199619992007面积万（面积万（h）170399023200销售值（亿美元）销售值（亿美元）2.3523165国家数目国家数目6122
33、3转基因植物发展水平转基因植物发展水平阶段阶段1，主要集中于具有重要经济价值的，主要集中于具有重要经济价值的基因的分离与改造；基因的分离与改造；阶段阶段2，培育具有改良的重要经济性状的，培育具有改良的重要经济性状的工程植株；工程植株；阶段阶段3，培育具有生物反应器功能的工程，培育具有生物反应器功能的工程植株。植株。一、抗除草剂植物一、抗除草剂植物（一）抗除草剂植物研究现状（一）抗除草剂植物研究现状（二）抗除草剂作物的创制（二）抗除草剂作物的创制（三）抗除草剂作物的推广应用（三）抗除草剂作物的推广应用（四）抗除草剂作物的安全性（四）抗除草剂作物的安全性（一）研究现状 常用除草剂：常用除草剂：草甘
34、膦、草铵膦、磺酰脲类、草甘膦、草铵膦、磺酰脲类、咪唑啉酮类、溴苯腈等。咪唑啉酮类、溴苯腈等。作用：作用：机械化耕作；机械化耕作；减少劳力支出；减少劳力支出；提高产量提高产量问题：问题：选择性差，限制其适用范围。选择性差，限制其适用范围。杂草易对除草剂产生抗性。杂草易对除草剂产生抗性。解决途径解决途径其一，研制新型除草剂。其一，研制新型除草剂。研发费用高；需时较长。研发费用高；需时较长。8-10年，近年，近1亿美元。亿美元。其二，其二，培育转基因抗除草剂植物。培育转基因抗除草剂植物。将抗性基因导入到作物中，培育抗除草将抗性基因导入到作物中，培育抗除草剂作物新品种。快速经济，费用为除草剂的剂作物新
35、品种。快速经济，费用为除草剂的1-5%。扩大除草剂的应用范围扩大除草剂的应用范围 延迟抗性形成延迟抗性形成1983，第一个抗除草剂烟草问世。，第一个抗除草剂烟草问世。1998，美国孟山都，耐草甘膦玉米。，美国孟山都，耐草甘膦玉米。2000，美国与加拿大，耐咪唑琳酮类小麦。，美国与加拿大，耐咪唑琳酮类小麦。1997，全球种植面积为，全球种植面积为690万万hm2，1998年年1980万万hm2，1999年年2820万万hm2。目前，近目前，近300种植物抗除草剂品种，种植物抗除草剂品种，大规模商业化释放的作物有大豆、油菜、大规模商业化释放的作物有大豆、油菜、玉米、棉花、水稻等。玉米、棉花、水稻等
36、。（二）抗除草剂作物的创制（二）抗除草剂作物的创制创制方法多样：创制方法多样：基因导入；组织培养；细胞融合；植株基因导入；组织培养；细胞融合；植株差异选择；种子诱变选择；花粉突变选择；差异选择；种子诱变选择；花粉突变选择；传统单株选择。传统单株选择。利用转基因技术创制抗除草剂作物是植物生物利用转基因技术创制抗除草剂作物是植物生物技术中技术中第第1项项最广泛采用的技术。最广泛采用的技术。转基因抗除草剂作物要求：转基因抗除草剂作物要求：具有高度抗性；具有高度抗性；具有优质高产潜力。具有优质高产潜力。1、草甘膦（glyphosate）销售量最大，使用面积最广，非选择性销售量最大，使用面积最广，非选择
37、性除草剂。除草剂。杀草机理：抑制氨基酸生物合成。杀草机理：抑制氨基酸生物合成。最早成功作物：大豆，最早成功作物：大豆，1992。应用作物：大豆、油菜、棉花、甜菜等。应用作物：大豆、油菜、棉花、甜菜等。2、草铵磷（glufosinate）触杀性，非选择性除草剂。触杀性，非选择性除草剂。杀草机理：抑制谷氨酰胺合成酶杀草机理：抑制谷氨酰胺合成酶最早成功作物：油菜，最早成功作物：油菜，1989应用植物：油菜、甜菜、甘兰、胡萝卜、应用植物：油菜、甜菜、甘兰、胡萝卜、马铃薯、番茄、烟草、小麦、玉米、水马铃薯、番茄、烟草、小麦、玉米、水稻、大麦、高粱、黑麦、燕麦、苜蓿、稻、大麦、高粱、黑麦、燕麦、苜蓿、杨树
38、等。杨树等。3、磺酰脲（sulfonylurea）最早使用，低毒高效，选择性除草剂。最早使用，低毒高效，选择性除草剂。残留期长，易产生抗性。残留期长，易产生抗性。杀草机理：抑制蛋白质合成杀草机理：抑制蛋白质合成最早成功作物：烟草，最早成功作物：烟草，1989应用植物：烟草、油菜、棉花、亚麻、应用植物：烟草、油菜、棉花、亚麻、玉米、水稻、甜菜、番茄等。玉米、水稻、甜菜、番茄等。4、咪唑啉酮（imidazolinone)吸收性，选择性除草剂。残留期长。吸收性，选择性除草剂。残留期长。杀草机理：抑制蛋白质合成杀草机理：抑制蛋白质合成最早成功作物：玉米，最早成功作物：玉米，1996应用植物：玉米、小麦
39、、油菜、水稻、应用植物：玉米、小麦、油菜、水稻、烟草、甜菜等。烟草、甜菜等。5、2,4D生长激素类，有机选择性除草剂。生长激素类，有机选择性除草剂。杀草机理：影响激素结合蛋白杀草机理：影响激素结合蛋白最早成功作物：大豆，最早成功作物：大豆，1987应用植物：大豆、棉花、烟草等。应用植物：大豆、棉花、烟草等。6、喜禾啶（sethoxydim）禾本科杂草除草剂。禾本科杂草除草剂。杀草机理：抑制脂肪酸合成杀草机理：抑制脂肪酸合成最早成功作物：玉米，最早成功作物：玉米，1989应用植物：玉米应用植物：玉米7、均三氮苯类（s-triazine）广谱选择性除草剂。广谱选择性除草剂。杀草机理：抑制光合作用杀
40、草机理：抑制光合作用最早成功作物：油菜，最早成功作物：油菜，1986应用植物：油菜、烟草、玉米、大豆、应用植物：油菜、烟草、玉米、大豆、水稻、谷子、甜菜、马铃薯等。水稻、谷子、甜菜、马铃薯等。小测验小测验试述植物脱毒的原理及其操试述植物脱毒的原理及其操作程序。作程序。（三）抗除草剂作物的推广应用1、主要成功作物、主要成功作物2、抗除草剂作物的推广、抗除草剂作物的推广3、抗除草剂作物的优势、抗除草剂作物的优势1、主要成功作物、主要成功作物大豆、玉米、小麦、水稻、棉花、油菜、大豆、玉米、小麦、水稻、棉花、油菜、亚麻和甜菜。亚麻和甜菜。2、抗除草剂作物的推广、抗除草剂作物的推广世界抗除草剂作物种植面
41、积世界抗除草剂作物种植面积3270万公顷，占万公顷，占转基因谷物的转基因谷物的74%。美国。美国阿根廷阿根廷加拿大加拿大北美洲：面积最大，应用最早北美洲：面积最大，应用最早 美国和加拿大为主，大豆美国和加拿大为主，大豆玉米玉米油菜油菜棉花棉花拉丁美洲：阿根廷、墨西哥、巴西、乌拉圭拉丁美洲：阿根廷、墨西哥、巴西、乌拉圭欧洲：对转基因作物持否定态度，少量种植。欧洲：对转基因作物持否定态度，少量种植。罗马尼亚（大豆）、保加利亚（玉米）、西班牙罗马尼亚（大豆）、保加利亚（玉米）、西班牙（玉米）（玉米）、德国（玉米）、德国（玉米）、法国（玉米）、法国（玉米）大洋洲：澳大利亚大面积种植棉花。大洋洲：澳大利
42、亚大面积种植棉花。亚洲：中国、日本亚洲：中国、日本3、抗除草剂作物的优势、抗除草剂作物的优势巨大的市场和经济效益巨大的市场和经济效益扩大杀草谱，减少除草剂用量扩大杀草谱，减少除草剂用量除草剂使用时期灵活、方便除草剂使用时期灵活、方便对作物和环境安全对作物和环境安全解决抗性杂草解决抗性杂草利于耕作改制利于耕作改制提高产量、增加收益提高产量、增加收益4、存在问题、存在问题杂草抗性和群落改变杂草抗性和群落改变前茬作物成为后茬作物田间杂草前茬作物成为后茬作物田间杂草对生物多样性的影响对生物多样性的影响抗性基因转移，形成超级杂草抗性基因转移，形成超级杂草人们的认识与接受程度人们的认识与接受程度（四）抗除
43、草剂作物的安全性（四）抗除草剂作物的安全性杂草抗性和群落改变杂草抗性和群落改变前茬作物成为后茬作物田间杂草前茬作物成为后茬作物田间杂草对生物多样性的影响对生物多样性的影响抗性基因转移，形成超级杂草抗性基因转移，形成超级杂草人们的认识与接受程度人们的认识与接受程度焦点：焦点：转基因抗除草剂作物食品的安全性转基因抗除草剂作物食品的安全性二、抗虫植物二、抗虫植物 虫害导致损失数千亿美元，化学杀虫剂使虫害导致损失数千亿美元，化学杀虫剂使用为主要措施。用为主要措施。化学杀虫剂危害化学杀虫剂危害：成本成本200亿美元亿美元 第一，害虫产生抗性。第一，害虫产生抗性。第二，对其他生物的危害。第二，对其他生物的
44、危害。第三，对环境的影响。第三，对环境的影响。世界要求控制化学杀虫剂的使用。世界要求控制化学杀虫剂的使用。控制使用化学杀虫剂的途径控制使用化学杀虫剂的途径一是用生物杀虫剂替代化学杀虫剂；一是用生物杀虫剂替代化学杀虫剂；二是培育抗虫植物新品种。二是培育抗虫植物新品种。培育抗虫植物的优点：培育抗虫植物的优点：长远效果，成本较低。长远效果，成本较低。抗虫效果好。专杀抗虫效果好。专杀 安全性高。基因难扩散安全性高。基因难扩散 保护作用范围广。全株抗性保护作用范围广。全株抗性转基因抗虫植物概况目前，实现转化的物种有目前，实现转化的物种有农作物、园艺和农作物、园艺和林果类植物林果类植物，如：水稻、棉花、小
45、麦、，如：水稻、棉花、小麦、大麦、玉米、高粱、大豆、马铃薯、西大麦、玉米、高粱、大豆、马铃薯、西红柿、大白菜、甘蓝、茄子、甘蔗、苜红柿、大白菜、甘蓝、茄子、甘蔗、苜蓿、咖啡、香蕉、苹果和杨树等。蓿、咖啡、香蕉、苹果和杨树等。其中其中转转Bt、胰蛋白酶基因、胰蛋白酶基因的棉花、大豆、的棉花、大豆、玉米、西红柿和马铃薯已经大规模商业玉米、西红柿和马铃薯已经大规模商业化释放；转基因杨树已获得中国政府的化释放；转基因杨树已获得中国政府的释放许可，目前正在生产中推广。释放许可，目前正在生产中推广。1、Bt毒蛋白基因毒蛋白基因苏云金杆菌（苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）产生
46、）产生的的毒蛋白毒蛋白可专一性毒杀可专一性毒杀鳞翅目、鞘翅目或双鳞翅目、鞘翅目或双翅目昆虫翅目昆虫，而对人、畜和其他生物无害。，而对人、畜和其他生物无害。20世纪世纪80年代以来，获得转年代以来，获得转Bt基因抗虫植物。基因抗虫植物。烟草、棉花、玉米、水稻、马铃薯、杨树等。烟草、棉花、玉米、水稻、马铃薯、杨树等。1998，我国抗虫棉，我国抗虫棉，10万亩。万亩。Bt毒蛋白基因是目前世界范围内使用最广泛、毒蛋白基因是目前世界范围内使用最广泛、最有潜力的一个抗虫基因。最有潜力的一个抗虫基因。Bt毒蛋白基因应用缺陷毒蛋白基因应用缺陷一、抗虫谱窄一、抗虫谱窄二、昆虫易产生抗性。二、昆虫易产生抗性。相应
47、措施相应措施抗虫基因本身的利用抗虫基因本身的利用 措施措施转基因抗虫植物的种植转基因抗虫植物的种植Bt毒蛋白基因的利用毒蛋白基因的利用分离新的分离新的Bt毒蛋白基因。毒蛋白基因。对其分子改造，提高其表达量。对其分子改造，提高其表达量。多基因转化。多基因转化。使其特异表达。使其特异表达。用不同表达水平来控制。用不同表达水平来控制。高表达量杀死昆虫；高表达量杀死昆虫；低致死量抑制昆虫，利于天敌捕食。低致死量抑制昆虫，利于天敌捕食。转基因抗虫植物的种植转基因抗虫植物的种植轮换法轮换法：抗虫基因植物与化学杀虫剂交：抗虫基因植物与化学杀虫剂交替使用，使毒素基因表达产物对昆虫的替使用，使毒素基因表达产物对
48、昆虫的选择压力间断：选择压力间断：避护法避护法：转基因植物与非转基因植物混：转基因植物与非转基因植物混播，使抗虫昆虫品系难以发展；播，使抗虫昆虫品系难以发展；淘汰法淘汰法：在昆虫抗性产生以前，淘汰此：在昆虫抗性产生以前，淘汰此种抗虫植物。种抗虫植物。2、蛋白酶抑制剂基因、蛋白酶抑制剂基因proteinase inhibitor gene，PI 基因基因多存在植物的种子和块茎中。多存在植物的种子和块茎中。作用机制：作用机制：PI抑制剂抑制剂+昆虫的蛋白消化酶昆虫的蛋白消化酶 酶酶抑制剂复合体抑制剂复合体 阻断或减弱蛋白水解作用阻断或减弱蛋白水解作用昆虫对食物的消化吸收昆虫对食物的消化吸收昆虫非正
49、常发昆虫非正常发育和死亡。育和死亡。常用蛋白酶抑制剂基因常用蛋白酶抑制剂基因豇豆胰蛋白酶抑制剂豇豆胰蛋白酶抑制剂（cowpea trypsin inhibiter，CpTI）广谱抗虫，抗鳞翅目、鞘翅目害广谱抗虫，抗鳞翅目、鞘翅目害虫等，几乎对所有害虫有效，虫等，几乎对所有害虫有效，但对人畜无害。害虫难产生耐但对人畜无害。害虫难产生耐受性。受性。烟草、甘薯烟草、甘薯马铃薯蛋白酶抑制剂马铃薯蛋白酶抑制剂（potato proteinase inhibitor，PPI）一类损伤诱导性表达的基因产物，可抑制一类损伤诱导性表达的基因产物，可抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的活性。烟草。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的
50、活性。烟草。水 稻 巯 基 蛋 白 酶 抑 制 剂水 稻 巯 基 蛋 白 酶 抑 制 剂（oryzacystatin inhibitor）主要抑制鞘翅目和半翅目昆虫消化管内的主要抑制鞘翅目和半翅目昆虫消化管内的半胱氨酸类蛋白水解酶。半胱氨酸类蛋白水解酶。研究最活跃，已获得抗棉铃虫和黄粉虫转研究最活跃，已获得抗棉铃虫和黄粉虫转基因植物。基因植物。3、-淀粉酶抑制剂基因淀粉酶抑制剂基因广泛存在禾谷类作物和豆科作物种子广泛存在禾谷类作物和豆科作物种子中，能阻断中，能阻断哺乳动物和昆虫哺乳动物和昆虫对淀粉对淀粉成分的消化。成分的消化。转菜豆转菜豆-淀粉酶抑制剂基因烟草，表淀粉酶抑制剂基因烟草，表现对烟
