1、 遗传病检测新技术在儿童神经系统疾病的应用遗传病检测新技术在儿童神经系统疾病的应用福建省妇幼保健院儿科 周有峰遗传病检测技术遗传病检测技术 l第一代测序技术第一代测序技术：Sanger测序法测序法：Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。遗传病检测技术遗传病检测技术Sanger测序法测序法 优点：优点：方法简便，分辨率高，测序片段长 缺点缺点：逐个测序，费时费力遗传病检测技术遗传病检测技术l第二代测序技
2、术第二代测序技术（“Next-generation”sequencing technology）：优点：速度快、通量高、测序费用相对低速度快、通量高、测序费用相对低 目前主要包括：(1)全基因组测序全基因组测序(whole genome sequencing)(2)全外显子测序全外显子测序(whole exome sequencing，WES)(3)疾病靶向序列测序技术疾病靶向序列测序技术(disease target sequencing，DTS)第二代测序技术l全基因组测序全基因组测序(whole genome sequencing)：对某种生物的基因组中的所有基因进行测序，真实反映整个生
3、物体的全部遗传信息 第二代测序技术l全外显子测序全外显子测序(whole exome sequencing，WES)利用目标序列捕获技术对基因组的全部外显子实施捕获并进行高通量测序的一种技术。优点：成本更低、测序周期更短、数据分析更方便 缺点：无法了解到内含子区等非编码序列是否发生改变，从而无法全面了解基因组的情况 第二代测序技术l疾病靶向序列测序技术疾病靶向序列测序技术(disease target sequencing，DTS)：是应用最广泛的利用二代测序的临床诊断方法 优点优点：按需定制，即与某一类疾病(如癫痫)、临床表型(如共济失调)相关的所有致病基因可以被整合到一个基因测序包中进行高
4、通量测序，特别适合临床遗传性病因异质性强的疾病。目标区域更加集中，测序成本进一步降低，测序和数据分析的周期进一步缩短，从而更加经济、快捷 可以提前到临床诊断之后，神经生化、神经病理等之前进行 第二代测序技术l疾病靶向序列测序技术（疾病靶向序列测序技术（DTS）：）：缺点：不能检测未知的致病基因；所纳入的基因需不断更新，好的DTS检测包应定期更新纳入基因 可能因为设计缺陷导致纳入的已知基因不全面(比如检索的不全面等)，而导致关键遗传信息的遗漏 第二代测序技术l疾病靶向序列测序技术（疾病靶向序列测序技术（DTS）：）：神经系统疾病适应症：癫痫、智力障碍、先天遗传代谢病、线粒体病、共济失调、遗传性痉
5、挛性截瘫、神经肌肉病等。拷贝数检测技术拷贝数检测技术 l微阵列比较基因组杂交微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)l多重连接探针扩增技术多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)拷贝数检测技术拷贝数检测技术l微阵列比较基因组杂交微阵列比较基因组杂交(aCGH)在芯片上应用携带有不同荧光素的病例样本和正常对照样本进行共杂交，以此发现病例样本基因组相对于正常对照样本基因组的DNA拷贝数变化(copy number variat
6、ion，CNV)优点优点：单次检测所需DNA样本量极少 分辨率高(最好的aCGH可以精确到最小2kb的CNV)检测周期短(7-10 d)无需细胞培养 多种样本类型(如外周血标本、培养的细胞、组织标本等)均可以进行检测 拷贝数检测技术拷贝数检测技术l微阵列比较基因组杂交微阵列比较基因组杂交(aCGH)缺点：不能检测A(p.Glu24Arg)67812327GGTCTTCTCACGCCA CCAGAAGAGUGCGGUPro-Glu-Glu-Cys-Glyc.72CT(p.Glu24Glu)GGTCTCCTCACTCCA CCAGAAGAGUGAGGUPro-Glu-Glu-STOP678123c
7、.78GT(p.Cys26X)Mutations:AdditionsNormal geneGGTCTCCTCACGCCACCAGAGGAGUGCGGU Codons Pro-Glu-Glu-Cys-GlyAmino acidsAddition mutationGGTGCTCCTCACGCCACCACGAGGAGUGCGGU Pro-Arg-Gly-Val-Arg（A frame shift mutation）2010 Paul Billiet ODWSMutations:DeletionsNormal geneGGTCTCCTCACGCCACCAGAGGAGUGCGGU Codons Pro-
8、Glu-Glu-Cys-GlyAmino acidsDeletion mutationGGTC/CCTCACGCCACCAGGGAGUGCGGU Pro-Gly-Ser-Ala-Val(A frame shift mutation)单基因病单基因病常染色体显性遗传病常染色体显性遗传病常染色体隐性遗传病常染色体隐性遗传病X连锁显性遗传病连锁显性遗传病X连锁隐性遗传病连锁隐性遗传病Y连锁遗传病连锁遗传病线粒体病线粒体病单基因病分类单基因病分类常染色体显性遗传常染色体显性遗传(AD)致病基因位于致病基因位于122号号染色体上，杂合时即可发病染色体上，杂合时即可发病患病由亲代传来，患病由亲代传来，1/
9、2患病机会，连续几代都有患病机会，连续几代都有 常染色体隐性遗传（常染色体隐性遗传（AR）双亲正常，为何生出有遗传病的患儿？双亲正常，为何生出有遗传病的患儿？致病基因位于致病基因位于122号染色体上，纯合时才发病号染色体上，纯合时才发病患病由杂合亲代传来，患病由杂合亲代传来，1/4、1/2与与1/4患病机会患病机会X X染色体显性遗传染色体显性遗传致病基因位于致病基因位于X染色体上，杂合时即可发病染色体上，杂合时即可发病女性杂合女性杂合+正常男性，子女中正常男性，子女中1/2发病发病男性患者男性患者+正常女性，儿子正常，女儿发病正常女性，儿子正常，女儿发病X染色体隐性遗传（染色体隐性遗传（PM
10、D）为何男孩发病，女孩为何男孩发病，女孩“不发病不发病”？致病基因位于致病基因位于X染色体上，杂合不发病，男多于女染色体上，杂合不发病，男多于女双亲无病时，双亲无病时，男性男性1/2患病机会，患病机会，女性女性1/2携带者携带者受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合未发现变异未发现变异未发现变异未发现变异AD结果的判读结果的判读受检者受检者父母之一父母之一父母之一父母之一杂合杂合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异受检者受检者父母之一父母之一父母之一父母之一杂合杂合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异情况1情况2受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合未发现变异未发现变异未发现变异未发现变异AD结果
11、的判读结果的判读受检者受检者父母之一父母之一父母之一父母之一杂合杂合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异受检者受检者父母之一父母之一父母之一父母之一杂合杂合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异情况1情况2诊断家族（家族（+）家族（家族（-）诊断不能诊断AR结果的判读受检者受检者父亲父亲母亲母亲纯合纯合杂合变异杂合变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合1杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异杂合杂合2未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合1杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异杂合杂合2杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异受检者受检者父母中一方父母
12、中一方父母中一方父母中一方纯合纯合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异情况1情况2情况3情况4AR结果的判读情况1情况2情况3情况4诊断诊断诊断不能诊断受检者受检者父亲父亲母亲母亲纯合纯合杂合变异杂合变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合1杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异杂合杂合2未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲杂合杂合1杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异杂合杂合2杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异受检者受检者父母中一方父母中一方父母中一方父母中一方纯合纯合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异GJA12 c.216delGinsAA A
13、:正常对照 B:患儿 C:患儿之父 D:患儿之母 受检者受检者父母中一方父母中一方父母中一方父母中一方纯合纯合杂合变异杂合变异未发现变异未发现变异临床和MRI 表现初步诊断为佩梅病PLP1 gene 测序与MLPA:正常 GJA12 gene 突变分析 c.216delGinsAA(p.L73fsX106)父母来源:父亲杂合 母亲为野生型非孟德尔遗传现象单体型与等位基因型分析:GJA12 基因突变为1号染色体父源单亲二倍体所致XR结果的判读受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异未发现变异未发现变异
14、情况1情况2情况3受检者受检者父亲父亲母亲母亲外祖父外祖父半合子半合子未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异半合子半合子XR结果的判读受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异未发现变异未发现变异情况1情况2情况3受检者受检者父亲父亲母亲母亲外祖父外祖父半合子半合子未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异半合子半合子诊断诊断不能诊断Menkes病例男男，9月，月，G3P1（前两胎为自然流（前两胎为自然流产），先兆流产产），先兆流产20d腹沟沟斜疝腹沟沟斜疝，2m双侧髋关节脱位双侧髋关节脱位3m抽搐抽搐，呈简
15、单局限性发作，呈简单局限性发作，进行性进行性加加 重重,脑电图提示高峰失律脑电图提示高峰失律 智力运动发育迟缓智力运动发育迟缓头围头围 4 1 c m，高腭弓高腭弓,皮肤皮肤 白皙白皙，头发干枯、头发干枯、发黄、发黄、卷卷 曲，曲，以双侧颞以双侧颞 部明显，部明显，双侧腹股沟斜疝，双侧腹股沟斜疝，肌肌 张力低张力低下，下，B a r b i n s k i征征 阳性阳性血清铜血清铜 为为 0.8 mo l L(9.4-26.6 ），），血浆铜蓝蛋白为血浆铜蓝蛋白为 5 2.2 m g L (210-530)MRA MRA 脑血管脑血管“螺丝锥螺丝锥”样改变样改变 ATP7A c.3045del
16、T（p.T1016fsX1018）受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异杂合变异杂合变异ATP7A IVS18+1 GA（c.3658+1GA）de novo患儿患儿父亲父亲母亲母亲受检者受检者父亲父亲母亲母亲半合子半合子未发现变异未发现变异未发现变异未发现变异突变性质的确定突变性质的确定检测到基因检测到基因的改变的改变是已知突变是已知突变是否为已报道突变是否为已报道突变否，未报道否，未报道Exon碱基的改变碱基的改变内含子碱基的改变内含子碱基的改变是否改变氨基酸是否改变氨基酸否，没有改变否，没有改变是，改变了氨基酸是，改变了氨基酸基本为基本为SNP或剪接异常或剪接异常是否为已经报道是否为已经报道SNP否，没有报道否，没有报道是，已报道是，已报道氨基酸性质分析氨基酸性质分析氨基酸保守度分析氨基酸保守度分析家系传递家系传递群体频率分析群体频率分析谢谢聆听！谢谢聆听！
