1、新型冠状病毒的检测新型冠状病毒的检测 据央视报道，钟南山指导研发的快速检测试剂盒，采钟南山指导研发的快速检测试剂盒，采 1 滴血，滴血，15 分钟内就可获检测结果。分钟内就可获检测结果。呼吸疾病国家重点实验室透露，该实验室联合 中国科学院广州生物医药与健康研究院、广州再生医学与健康广东省实 验室等单位最新研发出新型冠状病毒新型冠状病毒 IgM 抗体快速检测试剂盒抗体快速检测试剂盒， 并已在 实验室和临床完成初步评价。 该试剂盒应用胶体金免疫层析技术，采用间接法检测人新型冠状病毒 IgM 抗体，仅需采取一滴血就有望在 15 分钟内肉眼观察获得检测结果，且患者的血 浆稀释 500 至 1000 倍
2、后，仍能检测出阳性条带。（有点像测孕纸）其实质为利（有点像测孕纸）其实质为利 用用抗原抗原抗体杂交技术检测患者因新型冠状病毒而产生的特异蛋白质。下面介抗体杂交技术检测患者因新型冠状病毒而产生的特异蛋白质。下面介 绍两种蛋白质检测技术：绍两种蛋白质检测技术： 1 病毒蛋白快速诊断原理（ELISA，胶体金） 与病毒的遗传物质 RNA 不同，病毒外壳是由蛋白质组成，但也有着特异性的病毒外壳是由蛋白质组成，但也有着特异性的 分子构型，故而可以利用抗原分子构型，故而可以利用抗原- -抗体结合的原理，抗体结合的原理，对病毒外壳蛋白进行免疫学检 测诊断。 ELISAELISA 酶联免疫法酶联免疫法就是一种高
3、效且广泛使用的蛋白定量方法，该方法的原理 是让能特异性识别病毒蛋白抗原的抗体结合到固相载体表面， 再加入受检样本与 固相抗体结合形成固相抗原复合物， 然后引入用酶标记的抗体识别并结合固相抗 原复合物，在洗涤多余的酶标抗体后，加入底物使酶发生颜色反应，根据颜色的 变化程度进行抗原的定性或定量。该方法省去了病毒核酸提取的步骤，大大降低 了检测时间，且方法较为成熟，自动化程度高，只要找到足够特异识别病毒的抗 体，就能在 1-3 小时内获得检测结果。但是，筛选出合适的病毒识别抗体是该方 法的难点，因为涉及到动物免疫和蛋白纯化过程，比起核酸检测试剂盒来说，蛋 白检测试剂盒开发时间更长，生产成本更高。 胶
4、体金试纸胶体金试纸基于免疫蛋白检测原理开发的则更便于人们广泛使用。 胶体金试 纸就是用一种胶体形式的金标记生物大分子，并在 PVC 材质的试纸固定，试纸上 留有加样孔、检测线和质量控制线，将患者的咽拭子、肺泡灌洗液等样品加入加 样孔之后，再滴加几滴液体介质，让液流向试纸另一端的吸水垫进行流动，试纸 上进行层析，一般等待十余分钟的免疫反应之后，就可以看到胶体金聚集的位置 上有没有红色条带出现，检测线和质控线都显色的为阳性样本，只有质控线显色 的为阴性样本。该方法最大的优点就是方便快捷，但其通量也较小，比较适用于 单独个体的快速确诊，但该试纸的准确性也高度依赖于抗体对病毒识别的特异 性。 图双抗体
5、夹心法检测抗原的胶体金试纸原理图双抗体夹心法检测抗原的胶体金试纸原理 图双抗体夹心法检测抗原的胶体金试纸法的结果判读图双抗体夹心法检测抗原的胶体金试纸法的结果判读 研制成功了新型冠状病毒抗体快速检测试纸，可用于诊断、治疗 参考，流行病学调查、免疫评估等。 但是，无论如何，现在抗体检测还不能完全替代核酸检测但是，无论如何，现在抗体检测还不能完全替代核酸检测 2 新型冠状病毒的核酸检测原理 所有生物除朊病毒外都含有核酸，核酸包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核 酸（RNA），新型冠状病毒是一种仅含有新型冠状病毒是一种仅含有 RNARNA 的病毒，病毒中特异性的病毒，病毒中特异性 RNARNA 序列是
6、序列是 区分该病毒与其它病原体的标志物。区分该病毒与其它病原体的标志物。 新型冠状病毒出现后， 我国科学家在极短的 时间里完成了对新型冠状病毒全基因组序列的解析， 并通过与其它物种的基因组 序列对比，发现了新型冠状病毒中的特异核酸序列。临床实验室检测过程中，如 果能在患者样本中检测到新型冠状病毒的特异核酸序列， 应提示该患者可能被新 型冠状病毒感染。 对于新型冠状病毒的核酸检测，首先根据试剂盒说明书【样本要求】部分进行 样本采集，常规的样本类型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗 液等。由于新型冠状病毒为 RNA 病毒，RNA 易降解，因此，采集样本时使用无 RNA 酶的拭子和无
7、RNA 酶的储存管。获得患者样本后，需尽快进行检测，如无法立即检 测需要转运的样本，应按照说明书的要求进行低温封装，并送到专门的检测机构进 行检测。检测机构收到样本后，对样本进行核酸提取，核酸提取试剂应使用批准产 品说明书中指定的核酸提取试剂盒。 检测新型冠状病毒特异序列的方法最常见的是荧光定量最常见的是荧光定量 PCRPCR （聚合酶链式反（聚合酶链式反 应）。因应）。因 PCRPCR 反应模板仅为反应模板仅为 DNADNA，因此在进行，因此在进行 PCRPCR 反应前，应将新型冠状病毒核反应前，应将新型冠状病毒核 酸 （酸 （RNARNA） 逆转录为） 逆转录为 DNADNA。 在 PCR
8、 反应体系中， 包含一对特异性引物以及一个 Taqman 探针， 该探针为一段特异性寡核苷酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭 荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；如反应体系 存在靶序列，PCR 反应时探针与模板结合，DNA 聚合酶沿模板利用酶的外切酶活 性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条 DNA 链， 就有一个荧光分子产生。 荧光定量 PCR 仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循 环数（Ct 值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高， Ct 值越小。不同生产 企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的阳性判断值。 展开来讲就是：将标记有
9、荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后，完成高温变性、低温 复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板 DNA 互补配对的 Taqman 探针被切 断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光；随着循环次数的增加，被扩增的目的 基因片段呈指数规律增长， 通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度， 求得 Ct 值 （Cycle threshold，循环阈值，每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数），同时利用数 个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。 该方法尽管十分灵敏，特异性和准确性都很高，但仍然存在假阳性或该方法尽管十分
10、灵敏，特异性和准确性都很高，但仍然存在假阳性或 假阴性的可能假阴性的可能，比如采集样本或实验操作时不慎与其他患者样本发生交叉 污染，就会产生假阳性的结果；而部分患者体内的载量较低，导致目的核 酸提取浓度不够，使仪器检测不到荧光信号，就会产生假阴性的结果，因因 此如果要进一步确诊阳性，就需要进行重复实验核对，两次结果一病毒致此如果要进一步确诊阳性，就需要进行重复实验核对，两次结果一病毒致 才能报告。整个实验流程从样本采集、核酸提取到荧光定量才能报告。整个实验流程从样本采集、核酸提取到荧光定量 PCR，大概需，大概需 要要 6-8 小时，如小时，如果进行复核则需要约果进行复核则需要约 16 小时，
11、给疑似患者的及时诊断和疫小时，给疑似患者的及时诊断和疫 情控制带来了一定挑战。情控制带来了一定挑战。 欲直观了解具体的检测过程，可查询相关示范视频，例如北京协和医院录制的 示范短片。（各企业的提取处理等过程不尽相同，该视频仅为举例，具体操作应参 照产品说明书） 核酸（DNA/RNA）是核酸检测的基础物质，而核酸提取不管是“一步法” 还是“两步法”，目的都是要提取出相当纯度的核酸。这也是整个核酸检测行目的都是要提取出相当纯度的核酸。这也是整个核酸检测行 业绕不过去的步骤，很多时候一份临床样本的核酸提取纯度高低，甚至直业绕不过去的步骤，很多时候一份临床样本的核酸提取纯度高低，甚至直 接决定了检测结
12、果的有效性。这也决定了核酸检测的时间是比较长、要求接决定了检测结果的有效性。这也决定了核酸检测的时间是比较长、要求 是比较高的：是比较高的： 新冠病毒核酸检测有新冠病毒核酸检测有“五高五高”特点特点 与其他常见病毒检测不同，新型冠状病毒的检测有“五高”的特点： 1. 1. 场地要求高场地要求高PCR 实验室。标准的四区分隔和气流控制：试剂准备、标本 制备、PCR 扩增检测和扩增产物检测四个独立的实验区。每个独立实验区设置有 缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个 PCR 实验过程中试剂和标本免受气溶胶 的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 机械连锁不锈钢传递窗保证试剂和 标本在传递过程中不受
13、污染（人物分流）。 2.2.人员要求高人员要求高PCR 上岗证。进入 PCR 实验室，需要经过从基础理论、实验原 理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训，并获取 PCR 上岗证。 3.3.检测风险高检测风险高直接对病毒核酸进行提取、扩增。检测过程中，样本的开盖， 核酸提取的震荡、离心都有可能产生气溶胶，有感染的风险。 4.4.防护要求高防护要求高个人防护必须按照生物安全三级实验室的个人防护要求进行。 5.5.体力耐力要求高体力耐力要求高整个实验过程基本需要 4 小时，穿上密不透风的防护装 备，注意力高度集中，不到 1 个小时就汗流浃背；呼吸防护面罩一层水汽，会有 缺氧感觉；再加上隔离区只
14、可以人和样本进去，扩增时漫长的等待，其间不能吃 东西、喝水、上厕所，这些对于检验者的体力耐力无疑是多重考验。 最后，样本操作、废弃物处理均需符合卫生部微生物生物医学实验室生物 安全通用准则和医疗废物管理条例等相关法规要求。 3 医学影像也被建议作为新冠肺炎诊断的凭证。 华中科技大学一位教授向湖北省新型冠状病毒防控总指挥部提交了关 于推荐以 CT 影像作为 2019nCoV 肺炎主要诊断依据的建议，武汉大学 中南医院影像科副主任张笑春教授也建议以此为主要诊断依据，原因如下： 1. 有些病例早期会出现影像学表现，但核酸检测出现滞后性。有些病例早期会出现影像学表现，但核酸检测出现滞后性。这些患者中
15、的很多人既不归为疑似病理也不在新冠肺炎确诊人数中，没有得到隔离或 者治疗，但部分患者后期核酸检测又呈阳性，因而有可能增加疾病传染的 风险； 2. 核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳定可靠性尚存疑。核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳定可靠性尚存疑。核酸检 出率低，许多病例要重复 2-3 次检测，很多病人咽拭子阴性但肺细胞灌洗 液里有病毒； 3. CT 检查及时、准确、快捷、阳性率高、肺部病变范围与临床症状密切检查及时、准确、快捷、阳性率高、肺部病变范围与临床症状密切 相关，可以依据相关，可以依据 CT 病变范围结合临床资料病变范围结合临床资料，如血氧饱和度判断患者轻重缓 急，重症优先住院
16、，轻者尽快隔离，必要时征用移动 CT 进社区筛查。 因此，随着对患者病情的深入了解及治疗经验的积累诊断手段也可能 会进行更新。 展望展望 有人说有人说， 未来危险国家安全的可能不是原子弹， 瘟疫的发生可能更具危险性， 未来危险国家安全的可能不是原子弹， 瘟疫的发生可能更具危险性 和危害性。因此，我们要从此次疫情中吸取教训。和危害性。因此，我们要从此次疫情中吸取教训。首先，要建立和健全各级疫首先，要建立和健全各级疫 情发生的联防机制。情发生的联防机制。 主要城市要建立独立的“小汤山医院”， 医院具备样品提取、 患者隔离病房、ICU、分子检测、影像分析和快速转运机制。一旦有可疑病例发 生，可以尽快
17、启动追根循源机制，减少扩散风险的发生。利用网络和 APP 系统建 立医院 24 小时预诊体系，通过筛查，患者可直接在附近药房取药获得初步治疗； 一旦病情加重可经预诊体系到指定医院就诊。 其次，建立病原体快速检测程序。其次，建立病原体快速检测程序。我们需要根据常见的细菌、病毒类 型，建立初步筛查的诊断试剂盒，至少在疾病发生初期，就能确定发病的 主要原因，区分细菌，病毒或其他病原微生物，是否具有潜在的传染性。 进一步再明确是否是已知的亚型，还是新发的变异类型。经两步筛查，可 避免存在的有症状但并没有查出有冠状病毒的情况而造成传染发生。 再者，加强和加快抗病毒药物和病毒疫苗的研发。再者，加强和加快抗病毒药物和病毒疫苗的研发。本次疫情发生后， 所有的医生都说没有特效药，只能对症治疗，使疫情的防治如履薄冰。很 大程度上，要靠患者的自身免疫力的恢复。因此，调动各方积极性，包括 中西医结合方法，广泛开展有针对性的治疗研究，如流感病毒，冠状病毒， EB 病毒，埃博拉病毒，SARS 病毒等，开发疫苗和相应药物研究，为疫情 防治奠定坚实基础。
